賈文斌 孫欣 杜志杰 郭建昇

結(jié)腸癌是西歐、北美等發(fā)達國家最常見的惡性腫瘤，也是我國九大常見惡性腫瘤之一。在過去30多年的時間里，包括我國在內(nèi)的多數(shù)國家或地區(qū)結(jié)腸癌發(fā)病率呈上升趨勢。在我國因結(jié)腸癌死亡者，男性居惡性腫瘤死亡的第5位，女性居第6位。從流行病學的觀點看，結(jié)腸癌的發(fā)病與社會環(huán)境、生活方式（尤其是飲食習慣、缺乏體力活動）、遺傳因素有關(guān)。年齡、結(jié)直腸息肉史、潰瘍性結(jié)腸炎及膽囊切除史也是結(jié)腸癌的高危因素[1-2]。但總體而言，結(jié)腸癌的病因似不十分清楚。60%以上結(jié)腸癌患者被確診時已經(jīng)失去根治手術(shù)機會，因此術(shù)后化療成為主要治療辦法，但化療藥物的毒副作用及患者自身的耐藥性是目前影響患者預后的相關(guān)因素。

青蒿素（artemisine）是從中藥黃花蒿中提取的有過氧基團的倍半萜內(nèi)酯抗瘧新藥。青蒿素是中國發(fā)現(xiàn)的第一個被國際公認的天然藥物，在其基礎(chǔ)上合成了多種衍生物，如雙氫青蒿素、蒿甲醚、青蒿琥酯等。青蒿素類藥物毒性低、抗虐性強，被WTO批準為世界范圍內(nèi)治療腦型瘧疾和惡性瘧疾的首選藥物[3]。除上述作用外，還發(fā)現(xiàn)青蒿素對白血病、黑色素瘤、結(jié)腸癌、前列腺癌和乳腺癌細胞株高度敏感，有效抑制癌細胞的增殖[4]。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗藥物 青蒿琥酯（廣西桂林南藥股份有限公司，批號：LA120306）

1.1.2 實驗儀器 CO2培養(yǎng)箱（Heal Force，型號：HP900），酶標儀（美國Thermo，型號：5250030），倒置顯微鏡（Olympus，型號：CKX41SF），流式細胞儀（美國B-D公司，型號：Facscalibur）。

1.1.3 實驗試劑 人結(jié)腸癌細胞株HCT116和HT29細胞來自于山西醫(yī)科大學細胞生理學省部共建教育部重點實驗室，10%無支原體小牛血清（杭州四季青生物工程材料有限公司，批號：121004），噻唑蘭（Biotopped，批號：410C055），二甲基亞砜 （Solarbio，批號：302A035），DMEM高糖培養(yǎng)基（Hyclone，批號：NYF0905），0.25% 胰酶（Hyclone，批號：NWM0527），凋亡檢測試劑盒（南京凱基生物科技發(fā)展有限公司，批號：130605）。

1.2 實驗方法

1.2.1 細胞培養(yǎng) 人結(jié)腸癌CHT116和HT29細胞復蘇后采用RPMI 1640培養(yǎng)液、37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，2~3 d換液1次，取對數(shù)期生長細胞用于檢測。每組實驗重復3次。

1.2.2 MTT法檢測細胞抑制率 取對數(shù)生長期細胞，調(diào)整細胞懸液密度為5×104個/mL，每孔200 μL鋪于96孔板。培養(yǎng)24 h后細胞貼壁，棄去培養(yǎng)液，加入不同濃度（7.5、15、30、60、120 μg/mL）青蒿琥酯，每種濃度設(shè)5個復孔，每孔200 μL。同時設(shè)置空白孔（只加培養(yǎng)液）、陰性對照孔（只加細胞和培養(yǎng)液）。37 ℃、5%CO2：培養(yǎng)箱中分別培養(yǎng)48 h后棄去培養(yǎng)液，每孔加入20 μL MTT溶液（MTT質(zhì)量濃度為5 mg/mL），繼續(xù)培養(yǎng)4 h后終止培養(yǎng)。棄去培養(yǎng)液，每孔加入二甲基亞砜（DMSO）150 μL，于搖床低速振蕩10 min。在酶標儀490 nm波長處測量每孔的吸光度（A）值。整理數(shù)據(jù)后計算細胞抑制率，使用SPSS 13.0軟件計算IC50值。每組實驗重復5次。

細胞抑制率=[1-（實驗孔A值-空白孔A值）/（陰性對照孔A值-空白孔A值）]×100%。

1.2.3 流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡 取對數(shù)生長期的細胞，調(diào)整細胞懸液密度為1×105個/mL，每孔l mL接種于6孔板，每孔各加1 mL培養(yǎng)液，吹打均勻后放入37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。單層細胞鋪滿板底后，加入不同濃度的青蒿琥酯培養(yǎng)液（0、60、120 μg/mL），繼續(xù)培養(yǎng)24 h后收集細胞到10 mL離心管。每樣本細胞數(shù)為1×106個左右。離心半徑13.5 cm，1000 r/min離心5 min，棄去培養(yǎng)液，PBS 5 mL懸浮細胞。濾網(wǎng)過濾細胞懸液，離心半徑13.5 cm，1000 r/min離心5 min，棄去上清液加入500 μL的Binding Buffer懸浮細胞；加入5 μL Annexin V—FITC混勻后，加入5 μL Propidium Iodide，混勻；室溫避光，反應5~15 min；在1 h內(nèi)，用流式細胞儀進行觀察和檢測。每組實驗重復3次。

1.3 統(tǒng)計學處理 應用SPSS 13.0統(tǒng)計學軟件對數(shù)據(jù)進行處理，計量資料以（±s）表示，組間比較采用單因素方差分析，組內(nèi)兩兩比較采用LSD-t檢驗分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 青蒿琥酯對細胞增殖的影響 人結(jié)腸癌細胞經(jīng)不同濃度青蒿琥酯處理后，細胞生長受到不同程度的抑制（表1），且抑制程度隨著藥物濃度的增加而增強。不同濃度青蒿琥酯處理同種細胞后，抑制率間的差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05）；相同藥物濃度下兩種細胞之間抑制率的差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。青蒿琥酯作用HCT119和HT29細胞48 h后的IC50值分別為57.34 μmol/L 和 26.64 μmol/L。

表1 不同濃度Art對HCT116和HT29的抑制作用比較（x-±s）%

2.2 青蒿琥酯對人結(jié)腸癌細胞凋亡率的影響 隨青蒿琥酯濃度升高，作用24 h后兩種人結(jié)腸癌細胞的凋亡率均逐漸上升，加藥組與陰性對照組凋亡率比較差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05），見表2、圖1~6。

3 討論

目前手術(shù)、化療、放療仍是結(jié)腸癌治療的主要方法，但中藥因其獨特的生物調(diào)節(jié)功能也日益發(fā)揮著突出的作用。青蒿琥酯作為一種中藥成分，臨床上主要用于抗瘧疾方面的治療。近年發(fā)現(xiàn)其能發(fā)揮一定的抗腫瘤作用。Therese Ericsson等[5]長期臨床觀察發(fā)現(xiàn)青蒿琥酯在乳腺癌患者中治療中具有意義；Yang等[6]發(fā)現(xiàn)青蒿琥酯在細胞溶酶體中積累，促進溶酶體功能和鐵蛋白退化，然后導致線粒體ROS生產(chǎn)和最終的細胞死亡；Serkan Sertel等[7]經(jīng)基因檢測得出5356的基因包含一個或多個結(jié)合位點的c-Myc/最大的上游該基因的位置，結(jié)論是c-myc和最大介導的轉(zhuǎn)錄控制基因表達可能有助于提高青蒿琥酯對癌細胞的治療效果；Wai等[8]提出ART相關(guān)的化合物具有強效

性與細胞周期相關(guān)；梅昕等[9]采用逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶聯(lián)反應與酶聯(lián)免疫吸附法檢測得出青蒿琥酯可能通過抗炎及調(diào)節(jié)Treg/Th17平衡而發(fā)揮免疫作用；黃偉煒等[10]經(jīng)細胞培養(yǎng)試驗發(fā)現(xiàn)青蒿琥酯可明顯抑制結(jié)腸癌HCT-8細胞的侵襲，其作用機制可能與其下調(diào)ICAM-1、VEGF165和Ang-2蛋白表達有關(guān)；朱天明等[11]提出青蒿琥酯能夠抑制人胃癌細胞GC-7901的增殖，促進其凋亡，Caspase 3蛋白的高表達在促進SGC-7901細胞凋亡中起著重要作用；劉亮等[12]研究表明Art誘導Ec9706細胞凋亡的機制可能是通過降低細胞線粒體膜電位，啟動內(nèi)源性線粒體凋亡途徑，激活Caspase-3蛋白，從而誘導細胞凋亡；孫雅潔等[13]采用四甲基偶氮唑鹽法測定青蒿素、雙氫青蒿素、蒿甲醚和青蒿琥酯體外抑制人肺癌細胞、人胃癌細胞、人結(jié)腸癌細胞、人紅白血病細胞和人肝癌細胞的活性，認為青蒿素及其衍生物在體外對不同的腫瘤細胞有抑制活性作用；吳理茂等[14]檢測青蒿琥酯對拓撲異構(gòu)酶的影響顯示，青蒿琥酯能提高DNA拓撲異構(gòu)酶的活性，隨著濃度的提高作用漸趨明顯。本實驗通過運用不同濃度的青蒿琥酯干預兩種不同的人結(jié)腸癌細胞，發(fā)現(xiàn)其能抑制人結(jié)腸癌細胞的增殖。其抑制效應隨著劑量增加而逐漸增強，60 μg/mL濃度的青蒿琥酯處理人結(jié)腸癌HCT116和HT29細胞48 h后抑制率可達74%左右，呈劑量依賴效應。青蒿琥酯作用HCT116和HT29細胞48 h后兩種胃癌細胞的IC50值分別為57.34、26.64 μg/mL。表明青蒿琥酯對分化程度較低的人結(jié)腸癌細胞HCT116抑制作用較為明顯。運用流式細胞術(shù)檢測結(jié)果顯示藥物處理24 h后兩種人結(jié)腸癌細胞凋亡率逐漸上升，呈劑量依賴效應，與對照組相比差異有統(tǒng)計學意義。

表2 不同濃度青蒿琥酯處理兩種人結(jié)腸癌細胞24 h后的細胞凋亡率 %

圖1 HCT116細胞陰性對照

圖2 HCT116細胞30 μg/mL

圖3 HCT116細胞60 μg/mL

圖4 HT29細胞陰性對照

圖5 HT29細胞30 μg/mL

圖6 HT29細胞60 μg/mL

青蒿琥酯不但在抑制癌細胞增殖及誘導細胞凋亡方面方面廣受關(guān)注，而且還有報道指出青蒿琥酯可逆轉(zhuǎn)腫瘤細胞多藥耐藥等作用[15-16]。術(shù)后化療現(xiàn)在仍作為治療中晚期結(jié)腸癌必不可缺的治療手段之一，而現(xiàn)在腫瘤藥物耐藥性及副作用日趨明顯，本試驗通過對青蒿琥酯對人結(jié)腸癌細胞HCT116和HT29的增殖與凋亡，為青蒿琥酯在臨床抗腫瘤應運提供可能，為今后關(guān)于結(jié)腸癌治療的基礎(chǔ)和臨床研究提供一定的思路和方法。

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