林志偉+孫冬梅+遲麗

摘要：以黃綠木霉菌在馬鈴薯幾丁質(zhì)營養(yǎng)液中培養(yǎng)96 h獲得的發(fā)酵濾液為試驗藥劑，進(jìn)行室內(nèi)稻瘟病菌孢懸液人工接種與防治處理，測定水稻植株各防御性關(guān)鍵酶的變化規(guī)律，研究黃綠木霉菌發(fā)酵液對水稻植株抗病性的誘導(dǎo)能力。結(jié)果表明，噴施發(fā)酵液的水稻植株，稻瘟病病斑比對照減?。徊煌幚黹g水稻植株酶活性變化不同，噴施發(fā)酵液并接種病菌的水稻植株各種防御酶活性峰值出現(xiàn)較早，接種12 h，多酚氧化酶（PPO） 含量是對照的4倍，苯丙氨酸解氨酶（PAL）含量比對照高25%，綠原酸含量比對照高60%；接種48 h，過氧化物酶（POD）含量是對照的8倍。黃綠木霉菌幾丁質(zhì)發(fā)酵液具有抗御稻瘟病菌侵染和提高防御酶活性的作用。

關(guān)鍵詞：黃綠木霉菌；幾丁質(zhì)；稻瘟??；防御酶；多酚氧化酶；苯丙氨酸解氨酶；過氧化物酶

中圖分類號： S435.11文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A文章編號：1002-1302（2015）01-0121-03

收稿日期：2014-03-31

基金項目：黑龍江省齊齊哈爾市科技計劃（編號：NYGG2010-09）。

作者簡介：林志偉（1970—），男，黑龍江勃利人，碩士，副教授，主要從事植物病蟲害綜合防治技術(shù)研究。Tel：（0459）6819182；E-mail：lzwsdm@sohu.com。幾丁寡糖為功能型低聚糖，水溶性好且易被分散吸收，具有多種生理和生物學(xué)功能，尤其是可提高植物對病原菌的抵抗能力，啟動和激發(fā)植物的防御系統(tǒng)[1]，目前已被廣泛應(yīng)用到農(nóng)業(yè)生產(chǎn)領(lǐng)域[2]。幾丁寡糖可由幾丁質(zhì)通過酸解法、氧化法和酶解法降解產(chǎn)生[3]。傳統(tǒng)化學(xué)方法降解幾丁質(zhì)的反應(yīng)條件難以控制，反應(yīng)穩(wěn)定性和重復(fù)性較差，易造成環(huán)境污染。利用生物發(fā)酵技術(shù)降解幾丁質(zhì)成為當(dāng)前研究熱點，至今，已發(fā)現(xiàn)包括細(xì)菌、真菌和植物[4]在內(nèi)的許多生物能產(chǎn)生幾丁質(zhì)降解酶。黃綠木霉菌（Trichodema aureoviride）對幾丁質(zhì)有較好的降解能力[5]，對水稻紋枯病菌[Thanatephorus cucumeris （Frank） Donk]、稻瘟病菌（Pyricularia grisea）、核盤菌[Sclerotinia sclerotiorum （Lib.） de Bary]等有良好的應(yīng)用潛能[6-8]。有研究表明，微生物代謝產(chǎn)生的幾丁寡糖可以誘導(dǎo)植物提高抗病能力[9-12]，但有關(guān)黃綠木霉菌代謝產(chǎn)物誘導(dǎo)抗病能力的產(chǎn)生還未見報道。研究黃綠木霉菌在含幾丁質(zhì)營養(yǎng)液中發(fā)酵所得濾液對水稻植株防御酶系的影響，探索黃綠木霉發(fā)酵幾丁質(zhì)產(chǎn)生幾丁寡糖的利用途徑，明確黃綠木霉菌防病作用機(jī)理，對開拓植物病害的生物防治資源具有重要意義。

1材料與方法

1.1供試材料

供試菌種黃綠木霉菌T4、水稻稻瘟病菌ZD1，由黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)植物保護(hù)系提供；試驗水稻品種為墾鑒稻5號，由黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)農(nóng)學(xué)院水稻中心提供。改良馬鈴薯幾丁質(zhì)發(fā)酵培養(yǎng)液為：馬鈴薯200 g、葡萄糖5 g、K2HPO4 0.7 g、KH2PO4 0.3 g、KCl 0.01 g、FeSO4 0.01 g、MgSO4 0.5 g、膠態(tài)幾丁質(zhì)8 g，用蒸餾水定容至1 000 mL，分裝于500 mL三角瓶中。

1.2試驗方法

1.2.1黃綠木霉菌的發(fā)酵培養(yǎng)及發(fā)酵濾液獲得將孢子濃度為2.5×107個/mL的黃綠木霉菌孢懸液，接種于改良馬鈴薯幾丁質(zhì)培養(yǎng)液中，28 ℃、120 r/min恒溫振蕩培養(yǎng)4 d；過濾除去菌體，即得木霉菌幾丁質(zhì)發(fā)酵濾液。

1.2.2水稻植株栽培與處理方法將墾鑒稻5號秧苗插栽于直徑25 cm、高20 cm的花盆中，按三角位置每盆插栽3穴，1株/穴；每日觀察花盆內(nèi)水量，適當(dāng)補(bǔ)水，保證水稻正常生長至孕穗期；在水稻孕穗期進(jìn)行噴霧接種。試驗設(shè)噴施發(fā)酵濾液不接種稻瘟病菌孢子懸液、噴施清水并接種稻瘟病菌孢子懸液、噴施發(fā)酵濾液2 h后接種稻瘟病菌孢子懸液、噴施清水不接種稻瘟病菌孢子懸液為空白對照共4個處理，接種稻瘟病菌孢子懸液濃度為1.6×108個/mL，于16：00—17：00，使用手執(zhí)式噴霧器在水稻植株上方均勻噴霧；分別將每盆水稻用有機(jī)玻璃罩保濕36 h，除去有機(jī)罩，每日觀察水稻葉片病斑出現(xiàn)情況；處理結(jié)束后12、24、48、72、96、122、144 h，剪取水稻最上部2張葉片，立即用天平稱質(zhì)量，并按文獻(xiàn)[13]方法測定水稻葉片過氧化物酶（POD）、多酚氧化酶（PPO）、苯丙氨酸解氨酶（PAL）及綠原酸等指標(biāo)。

2結(jié)果與分析

2.1黃綠木霉菌幾丁質(zhì)發(fā)酵濾液對水稻稻瘟病的控制作用

試驗結(jié)果表明，在水稻植株接種稻瘟病菌并保濕，各水稻植株葉片上均有稻瘟病病斑出現(xiàn)，病斑出現(xiàn)的時間和病斑數(shù)量沒有差別，病斑均為典型的稻瘟病急性病斑，病斑較?。粐娛┌l(fā)酵濾液的植株，稻瘟病病斑周圍的黃色暈圈不明顯，而只接種病原菌的水稻葉片，病斑周圍有明顯的黃色暈圈，病斑向兩端延伸明顯（表1）。經(jīng)發(fā)酵濾液處理的水稻葉片發(fā)病程度減輕，一定程度上抑制了病原菌生長，限制了病原菌對水稻葉片的危害。表1噴施黃綠木霉菌幾丁質(zhì)發(fā)酵液對稻瘟病斑的影響

處理病斑長直徑

（mm）病斑短直徑

（mm）黃暈寬度

（mm）噴施清水并接種稻瘟病孢子懸液3.62a0.84a0.45a噴施發(fā)酵液2 h后接種稻瘟病孢子懸液1.12b0.65a0.12b

2.2黃綠木霉菌幾丁質(zhì)發(fā)酵濾液對水稻抗病關(guān)鍵酶活性的影響

2.2.1過氧化物酶的活性變化植物體內(nèi)過氧化物酶活性與植物抗病性呈正相關(guān)[14]。試驗結(jié)果表明，未噴施發(fā)酵濾液而接種稻瘟病菌的水稻新葉，POD酶在接種12～72 h內(nèi)與對照在同一水平范圍波動，72 h后發(fā)生變化，96 h時POD酶活性大幅躍升，并在96～144 h維持一個較高水平；噴施發(fā)酵濾液后接種病菌的水稻植株，葉片POD酶活性在12～48 h內(nèi)提高幅度很大，24 h時POD酶活性是對照的近7倍，48 h達(dá)到近8倍水平，48 h后開始下降，但葉片酶活水平仍略高于對照（圖1）。這是由于病原菌侵染水稻植株葉片后，水稻植株對病原菌產(chǎn)生了抗逆反應(yīng)[15]，施用發(fā)酵濾液，在一定程度上使葉片POD酶活性提高且抗逆反應(yīng)提前，有利于保護(hù)植物免受病原菌進(jìn)一步侵染[16]。

2.2.2多酚氧化酶的活性變化PPO是一類廣泛分布于植物體內(nèi)能催化多酚類氧化成醌類的質(zhì)體金屬酶，其活性提高有助于提高植物的抗病性[17-18]，對病原菌侵染起到一定限制作用。試驗結(jié)果表明，僅接種稻瘟病病菌的水稻葉片，12 h時PPO酶活性幾乎為0，48 h達(dá)到最高值，后逐漸下降；清水對照組，水稻葉片PPO酶活性在12～144 h較低，而僅噴施濾液的葉片，PPO酶活性在12 h有顯著提高，并持續(xù)至72 h，72～144 h 后稍有下降，但仍高于清水對照組（圖2），這說明噴施濾液可提高植物的抗病性。

2.2.3苯丙氨酸解氨酶的活性變化PAL是植保素、木質(zhì)素和酚類化合物合成的關(guān)鍵酶，與系統(tǒng)獲得抗性表現(xiàn)存在相關(guān)性。試驗結(jié)果表明，不同處理水稻葉片，在PAL酶活達(dá)到高峰后均呈逐漸下降趨勢；PAL初期變化趨勢與PPO相似，12 h時，各處理水稻葉片PAL表現(xiàn)出明顯差異，僅噴施濾液和噴施濾液2 h后接種的水稻葉片，其PAL酶活性比清水對照和只接種病菌分別高25%和10%；僅接種病菌的水稻葉片，其PAL活性在接種120 h后有所升高（圖3）。這進(jìn)一步表明，噴施濾液對植株抗病性的提高有促進(jìn)作用。

2.2.4綠原酸的活性變化綠原酸能夠清除自由基，具有抑制IAA氧化酶對植物生長素的破壞[19]，在植物抗病方面起著

特殊作用。由圖4可見，僅噴施發(fā)酵濾液，12 h時葉片綠原酸含量顯著高于清水對照，高出60%以上；只接種稻瘟病菌的水稻葉片，綠原酸含量在144 h達(dá)到最高值，此時，僅噴施發(fā)酵濾液的葉片，其綠原酸含量與清水對照相近。

3結(jié)論

過氧化物酶是植物體內(nèi)普遍存在且活性較高的一種酶，是植物體內(nèi)的保護(hù)酶之一，可以清除細(xì)胞內(nèi)的H2O2，與植物呼吸作用、光合作用、生長素氧化及木質(zhì)素形成等有關(guān)，其活性可以反映某一時期植物體內(nèi)的代謝及抗逆性變化[14]。苯丙氨酸解氨酶是植物體內(nèi)苯丙烷代謝途徑的關(guān)鍵酶，其活性高低控制著植物體內(nèi)多種次生酚類化合物、類黃酮植保素、木質(zhì)素等抗菌物質(zhì)的合成，在植物次生代謝和抗病代謝中具有重要的作用[20-21]。多酚氧化酶是一類廣泛存在于植物體內(nèi)的含銅金屬酶類，與作物的褐化有關(guān)，可以提高植物對病原菌的抗性[22-23]。本研究結(jié)果表明，當(dāng)水稻葉片受稻瘟病菌協(xié)迫后，黃綠木霉菌幾丁質(zhì)發(fā)酵濾液能夠誘導(dǎo)激活水稻葉片內(nèi)PAL、PPO、POD等幾種抗病關(guān)鍵酶的活性，使酶活力有所提高，且葉片內(nèi)綠原酸含量也得到顯著提高。黃綠木霉菌幾丁質(zhì)發(fā)酵濾液對稻瘟病具有一定的防治作用。

參考文獻(xiàn)：

[1]van der Holst P P G，Schlaman H R M，Spaink H P. Proteins involved in the production and perception of oligosaccharides in relation to plant and animal development[J]. Current Opinion in Structural Biology，2001，11（5）：608-616.

[2]王揚，婁永江，楊文鴿. 酶法制備幾丁寡糖和殼寡糖研究現(xiàn)狀與進(jìn)展[J]. 東海海洋，2001，19（4）：40-45.

[3]喬興忠，李永嫻，湯熙翔. 發(fā)酵法產(chǎn)酶生產(chǎn)幾丁寡糖的工藝研究[J]. 廈門大學(xué)學(xué)報：自然科學(xué)版，2010，49（2）：251-255.

[4]竺國芳，趙魯杭.幾丁寡糖和殼寡糖的研究進(jìn)展[J]. 中國海洋藥物，2000，19（1）：43-46.

[5]林志偉，張海燕，孫冬梅，等. 黃綠木霉菌菌株產(chǎn)幾丁質(zhì)酶發(fā)酵條件的研究[J]. 安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2011，39（9）：5043-5044.

[6]林志偉，靳學(xué)慧. 四種木霉菌對稻瘟病菌作用能力的比較研究[J]. 黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)學(xué)報，2006，18（4）：8-12.

[7]孫冬梅，林志偉. 黃綠木霉發(fā)酵液對水稻紋枯病菌作用的研究[J]. 植物保護(hù)，2009，35（4）：83-86.

[8]孫冬梅，楊謙，宋金柱.黃綠木霉菌代謝產(chǎn)物對大豆菌核病核盤菌的抑菌能力研究[J]. 天然產(chǎn)物研究與開發(fā)，2005，17（6）：691-695.

[9]戚益平，何逸建，許煜泉.根際細(xì)菌誘導(dǎo)的植物系統(tǒng)抗性[J]. 植物生理學(xué)通訊，2003，39（3）：273-278.

[10]王淑霞，張麗萍，黃亞麗，等. 哈茨木霉Tr-92誘導(dǎo)黃瓜對灰霉病系統(tǒng)抗性的研究[J]. 中國生物防治學(xué)報，2013，29（2）：242-247.

[11]黃艷青，莊敬華，高增貴，等. 木霉菌誘導(dǎo)甜瓜抗枯萎病相關(guān)防御反應(yīng)酶系的研究[J]. 沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報，2005，36（5）：546-549.

[12]Olson H A，Benson D M. Induced systemic resistance and the role of binucleate Rhizoctonia and Trichoderma hamatum 382 in biocontrol of botrytis blight in geranium[J]. Biological Control，2007，42（2）：233-241.

[13]王學(xué)奎.植物生理生化實驗原理和技術(shù)[M].2版. 北京：高等教育出版社，2006.

[14]葛秀春，宋鳳鳴，鄭重.稻瘟菌侵染后水稻幼苗活性氧的產(chǎn)生與抗病性的關(guān)系[J]. 植物生理學(xué)報，2000，26（3）：227-231.

[15]馬國華，王銓茂.水稻品種過氧化物酶活性和木質(zhì)素含量與抗稻瘟病菌的關(guān)系[J]. 植物生理學(xué)通訊，1992，28（4）：264-267.

[16]孫萬春，薛高峰，張杰，等. 硅對水稻防御性關(guān)鍵酶活性的影響及其與抗稻瘟病的關(guān)系[J]. 植物營養(yǎng)與肥料學(xué)報，2009，15（5）：1023-1028.

[17]賀立紅，賓金華. 高等植物中的多酚氧化酶[J]. 植物生理學(xué)通訊，2001，37（4）：340-345.

[18]趙伶俐，范崇輝，葛紅，等. 植物多酚氧化酶及其活性特征的研究進(jìn)展[J]. 西北林學(xué)院學(xué)報，2005，20（3）：156-159.

[19]郭秋娟，金邦荃，陳和平. 綠原酸生物活性與提取方法的研究進(jìn)展[J]. 食品工業(yè)科技，2009，30（8）：346-348.

[20]向妙蓮，何永明，付永琦，等. 茉莉酸甲酯對水稻白葉枯病的誘導(dǎo)抗性及相關(guān)防御酶活性的影響[J]. 植物保護(hù)學(xué)報，2013，40（2）：97-101.

[21]Latha P，Anand T，Ragupathi N，et al. Antimicrobial activity of plant extracts and induction of systemic resistance in tomato plants by mixtures of PGPR strains and zimmu leaf extract against Alternaria solani[J]. Biological Control，2009，50（2）：85-93.

[22]張智慧，聶燕芳，何磊，等. 外源茉莉酸甲酯誘導(dǎo)水稻抗瘟性相關(guān)防御酶和內(nèi)源水楊酸的變化[J]. 植物病理學(xué)報，2010，40（4）：395-403.

[23]黃鳳蓮，戴良英，羅寬. 藥劑誘導(dǎo)水稻幼苗抗寒機(jī)制研究[J]. 作物學(xué)報，2000，26（1）：92-97.