陳祖翼，丁顯平，2△，景亞玲，文 強(qiáng)，張 順，曹 曼(.四川大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院遺傳醫(yī)學(xué)研究所，特色生物資源研究與利用川渝共建重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，成都 6004；2.重慶市南川生物技術(shù)研究院 408400)

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·論 著·

成都地區(qū)HPV-33 E6/E7多態(tài)性分析

陳祖翼1，丁顯平1，2△，景亞玲1，文 強(qiáng)1，張 順1，曹 曼1
(1.四川大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院遺傳醫(yī)學(xué)研究所，特色生物資源研究與利用川渝共建重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，成都 610041；2.重慶市南川生物技術(shù)研究院 408400)

目的 研究四川地區(qū)人乳頭瘤病毒(HPV)的33 E6/E7基因變異情況,為HPV的防治提供分子水平的數(shù)據(jù)。方法 用PCR方法擴(kuò)增HPV陽性患者宮頸刷脫細(xì)胞中HPV-33 E6/E7基因,測序并與GenBank的參考序列對比尋找變異位點(diǎn)，對變異進(jìn)行初步分析。結(jié)果 與參考序列相比，成都地區(qū)HPV-33 E6基因變異率為56.00%(28/50)，HPV-33 E7基因變異率為54.00%(27/50)。結(jié)論 CINⅢ/CC樣品中HPV-33 E6/E7 序列變異程度比宮頸炎中更高，序列突變可能增加患宮頸癌風(fēng)險。

宮頸癌； 人乳頭瘤病毒； 變異

人類乳頭瘤病毒(HPV)是一種雙鏈閉合環(huán)狀小DNA病毒，人是其唯一宿主[1]。HPV亞型按照其與癌癥的相關(guān)性,分為高危型和低危型,其中HPV-16、18、31、33、35、39、45、51、52、53、56、58、59、66、68和73等被認(rèn)為是高危型,可引發(fā)惡性腫瘤[2]。HPV的分布及病毒基因序列的分布都有地域性差異，在不同地區(qū)都存在一定的變異株[3]。HPV功能基因核酸變異有可能引起病毒功能區(qū)氨基酸的變化，從而改變病毒基因的功能，與病毒的持續(xù)感染、腫瘤的發(fā)生、發(fā)展相關(guān)[1,4]。HPV-33在成都地區(qū)是排名第4的常見高危亞型，而且其感染率有上升趨勢[5-6]。目前國內(nèi)對于HPV-33的研究很少，本試驗(yàn)調(diào)查了成都地區(qū)HPV-33 E6/E7序列的突變情況，并對一些突變位點(diǎn)進(jìn)行了對比分析，旨在為HPV-33感染的防治提供一些流行病學(xué)數(shù)據(jù)。

1 資料與方法

1.1 樣品來源 2012～2014年間共收集HPV-33陽性樣品50例，其中宮頸上皮內(nèi)瘤變(CINⅢ)和宮頸癌(CC)樣品13例，宮頸炎37例。樣品主要通過成都地區(qū)部分醫(yī)院、醫(yī)師聯(lián)合采集(樣品由四川省腫瘤等醫(yī)院確診，由成都婦女兒童、安琪兒、維多利亞女子、金沙、生殖?？?、陽光、天府、錦江婦幼、麗人、棕南等醫(yī)院聯(lián)合采集)。

1.2 儀器與試劑 PCR擴(kuò)增儀(杭州朗基公司)，微量移液器(上海大龍醫(yī)療設(shè)備有限公司)，生物安全柜(安徽航天生物科技公司)，GSG-2000核酸/蛋白凝膠圖像分析系統(tǒng)(珠海黑馬醫(yī)學(xué)儀器有限公司)，HPV基因提取試劑盒(亞能生物技術(shù)有限公司)，Pfu DNA聚合酶(生工生物工程有限公司)。

1.3 引物設(shè)計 以Genbank:M12732.1為參考序列，用Primer5設(shè)計巢式PCR引物，外引物：前引物5′-AAA AAA GTA GGG TGT AAC CGA-3′，后引物5′-TGC CAC TGT CAT CTG CTG T-3′；內(nèi)引物：前引物5′-ACG GTG CAT ATA TAA AGC AAA CAT T-3′，后引物5′-CTT CTA CCT CAA ACC AAC CAG TAC A-3′。

1.4 方法

1.4.1 HPV DNA提取 取宮頸細(xì)胞保存液1 mL加入離心管，離心吸去上清液，按照試劑盒加入裂解液提取HPV DNA。

1.4.2 PCR擴(kuò)增 (1)PCR體系：Buffer(含MgCl2)2.5 μL，dNTPs 2 μL，引物各1.25 μL，DNA 聚合酶0.25 μL，DNA樣品5 μL，加無菌雙蒸水至25 μL。(2)擴(kuò)增條件：95 ℃預(yù)變性5 min;95 ℃變性45 s,53 ℃退火(內(nèi)引物57 ℃退火)30 s,72 ℃延伸1 min，共35個循環(huán)。最后72 ℃延伸5 min。(3)用2%瓊脂糖凝膠電泳鑒定PCR產(chǎn)物。其后將樣品送生工生物工程有限公司測序。

2 結(jié) 果

2.1 HPV-33 E6 研究結(jié)果顯示與參考序列(Genbank:M12732.1)相比，成都地區(qū)HPV-33 E6基因變異率為56.00%(28/50),共檢出突變位點(diǎn)15種，其中3種(A272G，T549C，A552C)不導(dǎo)致氨基酸改變。突變A129C(E7D)、A213C(K35N)、G329C(S74T)、A364C(N86H)、G373A(K89N)、A387C(K93N)、G413C(R102T)、A446G(Q113R)、A446T(Q113L)、G508A(G134R)、G542T(R145I)、G544C(E146Q)均導(dǎo)致氨基酸改變。在宮頸癌樣品中HPV-33 E6突變率為76.92%(10/13),在宮頸炎樣品中HPV-33 E6突變率為48.65%(18/37)。

2.2 HPV-33 E7 研究結(jié)果顯示與參考序列相比成都地區(qū)HPV-33 E7基因變異率為54.00%(27/50)，共檢出突變位點(diǎn)13種，突變G612T(D14Y)、G658C(S29T)、G669T(D33Y)、G674T(E34D)、G705A/C706T/A707T(A45I)、C706A(A45V)、G765A/T766C(V65T)、A780T(N70Y)、A792T(S74C)、A862T(Q97L)均導(dǎo)致氨基酸改變。在宮頸癌樣品中HPV-33 E7突變率為75.00%(9/12)，在宮頸炎樣品中HPV-33 E7突變率為47.37%(18/38)。

3 討 論

宮頸癌是一種在世界范圍內(nèi)常見的婦女惡性腫瘤，宮頸癌在女性常見惡性腫瘤中排名第2，僅次于乳腺癌，其發(fā)病率高達(dá)187/1 000 000，高危型HPV持續(xù)感染被認(rèn)為是導(dǎo)致女性宮頸癌最主要的因素之一[2]。世界范圍內(nèi)每年大概有50萬新增宮頸癌患者[7]，其中因HPV-33感染導(dǎo)致的宮頸癌占5%[8]。

HPV相對分子質(zhì)量約為8 000,其基因包括8個開放式閱讀框，按功能可分為3個結(jié)構(gòu)域：早期蛋白編碼區(qū)(ER)、晚期蛋白編碼區(qū)(LR)和上游調(diào)控區(qū)(URR)[1]。E1和E2為調(diào)控蛋白，調(diào)控轉(zhuǎn)錄和復(fù)制，E4與病毒成熟胞漿蛋白有關(guān)；早期蛋白E5、E6、E7為原癌基因，行使調(diào)控細(xì)胞轉(zhuǎn)化的功能；L1和L2基因分別編碼HPV的主要衣殼蛋白和次要衣殼蛋白，組裝成HPV的衣殼；URR位于E區(qū)與L區(qū)之間，序列保守性較小，含有病毒基因組DNA的復(fù)制起點(diǎn)和基因表達(dá)所必需的調(diào)控元件[9]。 E6和E7是HPV最重要的兩個功能基因，高危型HPV的E6蛋白能抑制p53的活性，E7能使細(xì)胞往永生化方向轉(zhuǎn)化[10]。HPV E6和E7序列變異會在一定程度上改變蛋白的功能，增強(qiáng)或減弱病毒的致病性[3,11]。宮頸癌的發(fā)生與病毒的變異、病毒的持續(xù)性感染和反復(fù)感染、病毒DNA 拷貝數(shù)以及機(jī)體的免疫狀態(tài)等因素相關(guān)，高危型HPV功能基因變異與病毒的持續(xù)性感染和反復(fù)感染以及病毒DNA 在宮頸癌組織中的高拷貝數(shù)相關(guān)[3,12]。從試驗(yàn)結(jié)果中發(fā)現(xiàn)，HPV-33 E6/E7基因在宮頸癌中的突變率與在宮頸炎中的突變率不同且前者高于后者，且在宮頸炎和CINⅢ/CC中不同病毒株的檢出比例也不盡相同，說明基因突變會使HPV E6/E7基因的致癌性改變。

一項研究統(tǒng)計了全球性的HPV-33 E6/E7序列分析(其中中國只有6例陽性樣品)[11]，其結(jié)果與成都地區(qū)序列變異調(diào)查結(jié)果差別較大，E6基因中共同存在的突變位點(diǎn)只有A213C和A273G，而E7基因的突變經(jīng)對比則沒有發(fā)現(xiàn)相同位點(diǎn)，提示HPV-33變異序列的分布有地域性差異。

一些研究顯示存在I73L、V83L、K93N和A138V的HPV-33 E6基因在抑制p53活性的能力上更加突出[13]，本研究中僅發(fā)現(xiàn)了K93N(A387C)的突變位點(diǎn)。對于HPV-33 E6基因，除了K93N，值得注意的還有K35N、N86H、E89K、R102T、Q113R和R145I，存在這些變異的病毒株在宮頸癌樣品中的檢出數(shù)都明顯高于在宮頸炎樣品中的檢出數(shù)。對于HPV-33 E7基因，值得注意的是D14Y、S29T、A45V、A45I、V65T、N70Y和Q97L，存在這些變異的病毒株在宮頸癌樣品中的檢出數(shù)都明顯高于在宮頸炎樣品中的檢出數(shù)。

成都地區(qū)HPV-33 E6/E7基因變異程度較高，在研究例如RNA干擾等針對HPV E6/E7 基因的治療手段時，需要考慮針對優(yōu)勢變異株如E6 G542T 的堿基改變進(jìn)行治療效果的優(yōu)化。

HPV變異株數(shù)據(jù)庫對于其診斷、疫苗制備及其他治療方法的研究都具有深遠(yuǎn)意義。本試驗(yàn)針對中國成都地區(qū)HPV-33亞型E6和E7基因進(jìn)行了多態(tài)性分析。該數(shù)據(jù)補(bǔ)充并拓展了早期對HPV-33亞型的研究。在以后的研究中，將會擴(kuò)大樣本量，做一個更全面的關(guān)于HPV-33基因突變帶來的致癌性改變的評估。

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Analysis on HPV-33 E6/E7 polymorphism in Chengdu area

CHENZu-yi1,DINGXian-ping1,2△,JINGYa-ling1,WENQiang1,ZHANGShun1,CAOMan1
(1.ResearchInstituteofGeneticMedicine,SchoolofLifeScience,SichuanUniversity,Bio-ResourceResearchandUtilizationJointKeyLaboratoryofSichuanandChongqing,Chengdu,Sichuan610041,China; 2.NanchuanBiotechnologyAcademy,Chongqing408400,China)

Objective To investigate human papillomavirus(HPV)33 E6/E7 gene variation in Chengdu area to provide the molecular level data for the prevention and treatment of HPV infection.Methods The HPV-33 E6/E7 genes in cervical exfoliated cells from the patients with HPV positive were amplified by PCR.The results were sequenced and compared with referencel sequence in GenBank for finding the mutant sites.Then the variations were preliminarily analyzed.Results Compared with the reference sequence,the variation rate of HPV-33 E6 in Chengdu area was 56.00%(28/50) and which of HPV-33 E7 was 54.00%(27/50).Conclusion The variation degree of HPV-33 E6/E7 in CINⅢ/CC sample is higher than that in cervicitis,the sequence mutations may increase the risk suffering from cervical cancer.

cervical cancer; human papillomavirus; variation

陳祖翼,男,在讀博士,碩士,主要從事醫(yī)學(xué)分子檢驗(yàn)技術(shù)研究?！?/p>

，E-mail:brainding@scu.edu.cn。

10.3969/j.issn.1672-9455.2015.22.027

A

1672-9455(2015)22-3364-02

2015-05-16

2015-09-23)