馬 媛， 權國波， 洪瓊花

(1.云南省畜牧獸醫(yī)科學院，云南 昆明 650224；2.云南農業(yè)大學 動物科學技術學院，云南 昆明 650201)

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學科動態(tài)

羊卵母細胞冷凍保存研究進展

馬 媛， 權國波， 洪瓊花*

(1.云南省畜牧獸醫(yī)科學院，云南 昆明 650224；2.云南農業(yè)大學 動物科學技術學院，云南 昆明 650201)

近年來，綿羊、山羊胚胎工程技術的快速發(fā)展致使對卵母細胞的需求量越來越大。此外，作為家畜種質資源保護體系的組成部分,卵母細胞也是保存優(yōu)秀雌性家畜遺傳資源的重要方式之一。然而，作為胚胎生物技術的重要環(huán)節(jié),由于其自身特殊的結構功能特點，卵母細胞對低溫和冷凍極其敏感，其冷凍保存研究水平遠低于胚胎。因此，如何提高冷凍保存卵母細胞質量是低溫生物學和胚胎生物技術研究領域的熱點和難點。針對目前綿羊、山羊卵母細胞冷凍保存的最新研究進展和存在問題進行綜述，同時針對如何進一步提高綿羊、山羊卵母細胞冷凍保存質量提出建議，以期為之后的研究工作提供理論指導。

綿羊；山羊；卵母細胞；冷凍保存

卵母細胞的冷凍保存可以實現(xiàn)優(yōu)良母畜種質資源的長期保護,同時也為體細胞核移植、轉基因動物制作以及胚胎體外生產等胚胎工程技術提供充足的材料來源。卵母細胞冷凍保存對于胚胎工程的最大意義在于這種技術可以使胚胎工程技術研究不受時間、地域限制,隨時隨地進行。雖然卵母細胞的冷凍保存技術是基于胚胎冷凍保存技術發(fā)展而來的,但是由于卵母細胞較胚胎具有獨特的功能和結構特點，在冷凍和解凍過程中更易遭受各種冷凍損傷,使卵母細胞冷凍保存技術遠遠落后于胚胎冷凍保存技術的水平。我國綿羊、山羊品種資源豐富,然而相對于牛、豬等畜種而言，綿羊、山羊卵母細胞冷凍保存技術的研究水平相對較低。因此有必要加強其卵母細胞冷凍保存技術以及相應的損傷機制的研究。

1 卵母細胞冷凍損傷機制研究現(xiàn)狀

玻璃化對冷凍卵母細胞所帶來的損傷是多方面的，如減數(shù)分裂紡錘體和染色體破壞、DNA 損傷、膜破裂、皮質顆粒成熟前胞外分泌、質膜和微絨毛改變、透明帶硬化、線粒體分布改變、細胞質、核仁結構改變、滲透壓變化、細胞內脂滴分布變化等。這些方面損傷的共同作用導致卵母細胞冷凍/解凍后的發(fā)育能力降低。

此外，與胚胎相比，卵母細胞的體積與表面積比值較大[1],胞質相對豐富，對冷凍保護劑滲透性差，冷凍時不易充分脫水；在胚胎冷凍過程中，一些細胞損傷死亡后，剩余的細胞仍有可能修復進行正常的胚胎發(fā)育，但因卵母細胞為單一細胞，無法進行冷凍后修復，損傷后難以存活；另一方面，顆粒細胞和卵母細胞通過間隙連接相聯(lián)系，這種聯(lián)系是卵母細胞成熟發(fā)育的必要條件，有顆粒細胞和無顆粒細胞的綿羊卵母細胞培養(yǎng)27 h后達到MⅡ期的比率有顯著差異[2]；另外卵母細胞難以冷凍成功，可能與其特殊的內含物有關，例如豬卵母細胞內含有大量脂滴，牛卵母細胞中含有大量囊泡，這些結構對冷凍很敏感。

卵母細胞的低溫敏感性還與其成熟階段密切相關，冷凍不同時期卵母細胞仍存在許多問題，不同成熟階段的卵母細胞冷凍效果及冷凍后的存活率也不盡相同。目前大多數(shù)研究主要集中于MⅡ期成熟卵母細胞，認為處于MⅡ期階段的卵母細胞不管是體外成熟還是體內成熟都比未成熟卵母細胞(GV期或GVBD期)冷凍效果好，因為在冷凍/解凍過程中，卵丘細胞和卵母細胞之間的間隙連接易遭到破壞，甚至會導致顆粒細胞脫落，從而阻礙未成熟卵母細胞的進一步發(fā)育[2]；另一方面未成熟卵母細胞膜表面有微絨毛伸人透明帶中,與透明帶聯(lián)系較緊密,卵母細胞收縮時,容易造成膜和微絨毛破壞，而成熟卵母細胞由于微絨毛已從透明帶中撤出,卵母細胞收縮時,沒有透明帶對微絨毛的牽拉作用,因而對質膜和微絨毛的破壞小[3]。劉海軍[4]對用OPS玻璃化冷凍后的山羊卵母細胞進行了超微結構觀察，發(fā)現(xiàn)MⅡ期卵母細胞超微結構比GV期和GVBD期損傷輕，表現(xiàn)為質膜損傷；GV期卵母細胞未見微絨毛，線粒體有損傷；GVBD和MⅡ期卵母細胞微絨毛保存較好，線粒體結構完整；GVBD卵母細胞內質網出現(xiàn)擴張，而MⅡ期卵母細胞內質網正常。Gook 等[5]發(fā)現(xiàn)凍融人GV期卵母細胞可正常受精，核型分析和DNA染色并未發(fā)現(xiàn)紡錘體和染色體異常率增加。但是Park等[5]發(fā)現(xiàn)，凍存復蘇的GV期鼠卵母細胞經體外培養(yǎng)成熟后紡錘體和染色體的異常率增加。所以，目前對于凍存GV 期卵母細胞是否真正優(yōu)于凍存MⅡ期卵母細胞還存在一定爭議，需要進一步的研究。

2 羊卵母細胞冷凍保存技術研究現(xiàn)狀

Whittingham[6]首次用慢速冷凍法冷凍小鼠成熟卵母細胞獲得成功，之后這項技術迅速擴展至人和其他動物，并取得重大進展。但是家畜卵母細胞冷凍保存主要集中在牛上，而羊卵母細胞冷凍保存的研究進展相對滯后。進入21世紀以后，特別是近幾年來，人們對綿、山羊卵母細胞冷凍保存的研究逐漸增多，相關研究主要集中于成熟階段對卵母細胞冷凍效果的影響、新型抗凍保護劑的篩選、冷凍載體的優(yōu)化以及山羊卵母細胞損傷機制的研究等。而且越來越多的證據(jù)表明，在冷凍綿羊和山羊卵母細胞時,對冷凍方法、抗凍保護劑以及保存載體的選擇會導致卵母細胞冷凍保存效果的差異,因此要進行合理的優(yōu)化和篩選。

2.1 冷凍保存方法的篩選

2.1.1 慢速冷凍法 程控降溫慢速冷凍方法是一種平衡冷凍方法，其原理是通過低濃度的抗凍保護劑，緩慢降溫,將卵母細胞內的水分在凍結前脫去，阻止冷凍過程中形成細胞內冰晶而使卵母細胞受到損傷。該法的優(yōu)點是細胞脫水完全，細胞內不易形成冰晶；缺點是費時，冷凍保護劑處理細胞時間過長，保存效果不理想，需要昂貴的降溫設備，使得其在家畜生產中推廣有一定的困難。宋繼梅[7]采用程控降溫慢速冷凍法分別冷凍GV期、成熟培養(yǎng)10 h和24 h的山羊卵母細胞，解凍后進行孤雌激活，卵裂率分別為39.8%、52.2%和69.9%，桑椹胚發(fā)育率分別為4.1%、14.4%和33.7%，說明慢速冷凍法對卵母細胞結構和功能損傷較大，使之后期發(fā)育比較困難。Jack等[8]用慢速冷凍法和玻璃化冷凍法冷凍小鼠卵母細胞，發(fā)現(xiàn)玻璃化法冷凍后小鼠卵母細胞存活率、體外受精后的卵裂率，囊胚率均高于慢速冷凍法，這也說明慢速冷凍法的冷凍效果沒有玻璃化法好。由于程控降溫慢速冷凍法無法完全避免細胞內外冰晶的形成，而且卵母細胞長時間接觸化學試劑，這導致其冷凍/解凍后的發(fā)育潛力受到嚴重損傷，因此玻璃化冷凍保存法可能更適合于卵母細胞的冷凍保存。目前，研究者多傾向于用玻璃化冷凍法冷凍家畜卵母細胞。

2.1.2 玻璃化冷凍法 玻璃化冷凍法是Rall和Fahy[9]建立的一種快速、簡便而有效的超低溫冷凍保存方法，最先運用于小鼠8細胞胚胎的冷凍保存。實現(xiàn)冷凍保護液的玻璃化必須包括三個關鍵因素：非常高的保護劑濃度(通常在6 M以上)、極快的冷凍/解凍速度和極少的溶液體積。盡管高濃度的保護劑可以提高保護液的玻璃化程度、降低細胞內外冰晶的形成，但與此同時卵母細胞也面臨著非常嚴重的化學毒性和滲透損傷。傳統(tǒng)的塑料細管法由于細管管壁較厚，所需的玻璃化液較多，因此造成其卵母細胞冷凍和解凍后存活率和發(fā)育率較低。Ebrahimi等[10]分別用傳統(tǒng)塑料細管法、Cryoloop和SSV法冷凍綿羊GV期卵母細胞，解凍后細胞存活率分別為6．09%、48．81%、36.6%，表明用傳統(tǒng)塑料細管法對羊卵母細胞的損傷較大；Rao等[11]研究發(fā)現(xiàn)用傳統(tǒng)塑料細管法冷凍GV期山羊卵母細胞后，其顆粒細胞擴散率(66.3%)和極體排除率(24.1%)均顯著降低。因此傳統(tǒng)塑料細管法可能并不適合卵母細胞冷凍保存。

為了克服傳統(tǒng)塑料細管法冷凍速度低的缺陷，研究人員對其進行了改進，主要以降低管壁厚度和縮小玻璃化溶液體積為目的[12]。這些改進主要包括：微滴法[13]、固體表面玻璃化法(SSV)[14]、半細管法(HS)[15]、尼龍網法(nylon mesh，NM)[16]、直接覆蓋玻璃化冷凍法(direct cover vitrification，DCV)[17]、塑料薄片法(fiber plug，F(xiàn)P)[18]，電子顯微鏡銅網法(GME)[19]、開放式拉長細管法(OPS)[20]、密閉式拉長細管法(CPS)[21]、超細開放式拉長細管法(SOPS)[22]、玻璃微細管法(GMP)[23]、冷凍環(huán)法(cryoloop)[24]、Cryotop[25]等。微滴法接觸液體面小，但是液滴小，容易上浮，其沒有承載物，不易進行標記，且容易造成污染。Papis[26]系統(tǒng)地研究了微滴法玻璃化冷凍牛卵母細胞的冷凍效果,獲得了76%的卵裂率，30%的囊胚率。SSV法將含有卵母細胞的玻璃化小液滴(1～2 μL)滴在冷金屬表面，極大地提高了冷凍速率，同時清潔的金屬表面有利于微滴的無菌操作。Begin等[27]用SSV法冷凍保存山羊MⅡ期卵母細胞，解凍后發(fā)現(xiàn)卵母細胞存活率為86%；而用CV法冷凍保存山羊成熟卵母細胞,解凍后發(fā)現(xiàn)卵母細胞存活率為74%，和SSV法差異不顯著。Adel[28]用SSV法冷凍綿羊GV期卵母細胞，解凍后74.8%的卵母細胞形態(tài)正常，細胞恢復率75.7%，體外受精率為39.3%，說明用SSV法可以使綿羊卵母細胞解凍后繼續(xù)生長發(fā)育。與傳統(tǒng)細管玻璃化方法相比，OPS在冷凍和解凍過程中的速度高10倍(約20000℃/min)[29]，使細胞快速度過危險溫區(qū)，減少冷凍損傷的發(fā)生，提高了玻璃化冷凍效果。許丹寧[30]研究發(fā)現(xiàn)用常規(guī)程序冷凍和OPS 玻璃化冷凍法冷凍山羊GV期卵母細胞，其成熟率分別為21.3%和29.9%，受精率分別為6.3%和9.1%，表明用OPS 玻璃化冷凍法較常規(guī)程序冷凍法效率高。

總之，近幾年來學者們對各種冷凍保存卵母細胞的方法都有所探究，但是需要注意的是，盡管這些冷凍載體可以大大提高冷凍/解凍速度，但是由于其直接和液氮接觸，有可能造成一定的污染。目前，細菌污染對冷凍保存的生殖細胞的影響也是低溫生物學研究領域的一個新熱點。

2.2 抗凍保護劑的選擇

抗凍保護劑的選擇對于綿羊、山羊卵母細胞的玻璃化冷凍保存具有非常重要的意義。在卵母細胞的冷凍、解凍過程中,細胞內冰晶的形成是造成卵母細胞冷凍損傷的主要因素。在冷凍過程中添加抗凍保護劑能夠使卵母細胞充分脫水，對降低甚至避免細胞內冰晶的形成是非常重要的。近年來，隨著研究的深入，人們認識到抗凍保護劑的種類、濃度和使用方式都會影響玻璃化冷凍的效果，所以實驗是否成功與抗凍保護劑的選擇密切相關。

常規(guī)的抗凍保護劑主要包括滲透性有機溶劑和非滲透性保護劑：滲透性保護劑主要包括甘油(GL)、二甲亞砜(DMSO),丙二醇(PROH)、乙二醇(EG)等,它們可以滲透進細胞內，從而代替細胞內水分，降低細胞內冰晶形成對卵母細胞的損傷。目前在綿羊、山羊卵母細胞冷凍保存研究中普遍采用兩種滲透保護劑聯(lián)合的方式，這樣在提高有機溶劑的滲透性同時，也降低了單一有機溶劑對細胞的不利影響。例如，DMSO是卵母細胞冷凍保存研究中常使用的滲透性保護劑，但是已有研究證明DMSO可以導致卵母細胞的孤雌活化[31]。如何降低滲透性有機溶劑對卵母細胞的毒性影響也是該領域的研究熱點之一。近幾年研究發(fā)現(xiàn)，在滲透性保護劑中，EG毒性低，滲透性較好，將其與形成玻璃化能力強的抗凍保護劑進行組合，組成效果較好的玻璃化冷凍液。Martinez[32]研究表明EG和GL混合作為綿羊胚胎冷凍保護劑有著較高的發(fā)育率和孵化率,分別為87.3%和76.4%,他還發(fā)現(xiàn)用不同濃度的DMSO作為冷凍保護劑處理綿羊卵母細胞，1.0 M和1.5 M是最佳濃度，低濃度(0.5 M)會使細胞內形成冰晶，高濃度(2.0 M或2.5 M)會加大細胞毒性，造成卵母細胞損傷。Bhat等[33]將綿羊IVM卵母細胞用OPS法冷凍保存，解凍后用33% EG處理組(87.6%)卵母細胞存活率顯著高于用33%DMSO組(77.43%)和17.5%DMSO+17.5%EG組(69.36%)，但是卵裂率和囊胚率DMSO+EG處理組要明顯高于DMSO組和EG組，分別為46.81%和15.5%,說明EG毒性較小，而EG和DMSO聯(lián)合使用使卵母細胞發(fā)育更好。

非滲透性保護劑無法進入細胞內，而只能在細胞外發(fā)生作用，主要包括高分子聚合物、糖類、牛血白蛋白(BSA)、血清等。這些保護劑的作用機制主要包括促進細胞外液玻璃化形成和降低滲透性保護劑對卵母細胞的滲透損傷等。目前，寡聚糖，尤其是海藻糖，對生殖細胞的冷凍保存效果是低溫生物學學研究領域的熱點。海藻糖作為一種非還原性雙糖，被廣泛的應用于生物冷凍領域。海藻糖自身性質非常穩(wěn)定，在體內可被酶水解成為葡萄糖而利用。其在高溫、高寒、高滲透壓及干燥、脫水、冷凍時等惡劣環(huán)境條件下能在細胞表面形成獨特的保護膜，有效保護蛋白質分子不變性失活，從而維持生命體的生命過程和生物特征,而蔗糖、葡萄糖等其他糖類均不具備這一功能[34]。它的作用機制包括：(1)“水替代假說”：海藻糖可在失水部位以羥基和分子形成氫鍵，這使得分子在缺水條件下仍然能夠保持其原有結構，而不喪失活性；(2)“玻璃態(tài)”假說：阻止細胞內蛋白質聚合，穩(wěn)定蛋白質的結構；(3)通過滲透調節(jié)作用抵御滲透壓、化學作用及低氧對細胞的影響。而且海藻糖與其他糖類比較具有更強的水合能力，因而抗冷凍脫水的能力更強，玻璃化相變溫度(Tg)高于其他糖類，高濃度的海藻糖溶液比其他糖類更不容易形成冰晶[35]。

此外，在上述抗凍保護劑的基礎上，研究人員嘗試采用一些新型抗凍保護劑，如抗凍蛋白 (antifreeze protein,AFP)、細胞松弛素B(cytochalasin B,CB)、紫杉醇(taxol)、脂解作用促進劑(福司柯林)等降低卵母細胞的冷凍損傷程度。莫顯紅等[36]在用OPS法冷凍綿羊MII期卵母細胞之前分別用0.5μM紫杉醇和7.5 μg/mLCB進行預處理，結果表明玻璃化冷凍后卵母細胞的存活率、受精率，CB預處理組卵裂率和囊胚率最高，其次為紫杉醇預處理組，這說明紫杉醇和CB有益于玻璃化冷凍，其作用機制可能與防止冷凍過程中細胞骨架被破壞有關。有研究將牛卵母細胞分別用AFPI、AFPII、AFPIII處理，結果發(fā)現(xiàn)卵膜的完好程度、體外成熟率、可受精能力均較未用抗凍蛋白處理的對照組有明顯提高,說明了AFP具有在低溫下保護哺乳動物卵母細胞的作用[37]。但是AFP可能與質膜相互作用，在一些樣品中呈保護效應，在一些樣品中呈解體效應。這些效應既受到溫度、AFP類型、組份和濃度等因素的影響，也可能改變了冰凍保護劑(如EG、DMSO等)與細胞膜的相互作用，從而使AFP對低溫和超低溫保存的效果呈現(xiàn)復雜性[38]。

3 羊卵母細胞冷凍保存中存在的問題

3.1 卵巢來源復雜、質量參差不齊

由于目前綿羊、山羊卵母細胞主要來源于屠宰場廢棄卵巢，質量參差不齊，而且成熟發(fā)育階段差異較大，這直接導致綿羊、山羊卵母細胞冷凍保存效果不穩(wěn)定、重復性差。

3.2 卵母細胞自身結構功能有其特殊性

盡管近幾年來綿羊、山羊卵母細胞的冷凍保存研究發(fā)展較快，但是由于卵母細胞結構功能的特殊性，其冷凍水平遠低于胚胎。目前建立的各種玻璃化冷凍保存方法均不能獲得令人滿意的保存效果。此外，卵母細胞冷凍損傷機制尚不明確，仍需要從細胞、蛋白、核酸水平進行深入探討。

3.3 卵母細胞質量評價體系不完善

在卵母細胞選擇方面，冷凍時所選用的卵母細胞只是通過肉眼來判別其質量好壞，沒有一種客觀的檢驗手段，以至于可能肉眼判別的質量好的卵母細胞已經死亡，對之后的解凍效果以及培養(yǎng)效果影響較大。此外，對綿羊、山羊卵母細胞的冷凍效果沒有一個統(tǒng)一的標準，從而無法判斷冷凍方法和抗凍保護劑選擇的適當性。

3.4 玻璃化操作水平尚未實現(xiàn)標準化

目前大多數(shù)研究認為卵母細胞的玻璃化冷凍保存效果要優(yōu)于傳統(tǒng)的慢速冷凍法，但是這種方法對操作人員專業(yè)技術水平要求較高。目前對冷凍保存操作人員并沒有一個專業(yè)的培訓，不同的實驗室，甚至不同操作人員之間，對于卵母細胞玻璃化冷凍保存的效果存在一定差異。因此，如何實現(xiàn)卵母細胞玻璃化冷凍保存程序的標準化仍是未來需要解決的一個重大課題。

4 展 望

近年來各方面的研究為今后山羊和綿羊卵母細胞冷凍保存的深入探索打下了堅實的理論和實踐基礎。雖然目前普遍認為玻璃化冷凍保存卵母細胞效果要優(yōu)于傳統(tǒng)的程控降溫慢速冷凍法，但仍存在解凍后卵母細胞的成熟率、受精率和胚胎發(fā)育率低及效果不穩(wěn)定等問題。為了解決這些問題，大量研究集中于抗凍保護劑的篩選和冷凍載體的優(yōu)化，盡管這些研究在一定程度上改善了解凍后卵母細胞的質量，但是冷凍對卵母細胞的損傷程度仍要大于胚胎。

對于在冷凍中出現(xiàn)的問題，首先在挑選卵母細胞時，一定要嚴格按照卵母細胞的質量分級進行篩選。其次，由于綿羊、山羊卵母細胞特殊的結構功能特點和低溫敏感性，增加了優(yōu)化冷凍保存技術體系的難度，所以在保護劑篩選方面，應該進一步優(yōu)化傳統(tǒng)的滲透性保護劑，如DMSO、EG、GL、PROH等的濃度和配比，從而緩解其對卵母細胞的化學毒性和滲透影響。此外，也應該關注一些新型抗凍保護劑，如AFP、化學來源的冰晶抑制劑、抗氧化劑以及海藻糖等。在冷凍載體篩選方面，為了進一步提高冷凍和解凍速度，需要對冷凍載體的材質和構造進行優(yōu)化。卵母細胞冷凍損傷機制的研究水平直接影響著卵母細胞質量評價技術體系的完善和標準化，在今后的研究中，我們要繼續(xù)從表觀遺傳學和分子生物學等角度探討冷凍對卵母細胞的損傷機制，并在此基礎上進一步完善卵母細胞的質量評價技術體系。最后，鑒于玻璃化冷凍效果與操作人員的技術水平密切相關，應當盡快尋求建立一套適宜于不同實驗室、不同實驗環(huán)境下的標準冷凍體系，消除人為因素的影響，實現(xiàn)操作者操作技能的標準化。

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Research Progress of Sheep Oocytes Cryopreservation

MA Yuan， QUAN Guobo， HONG Qiong-hua*

(1.YunnanAcademyofAnimalandVeterinaryScience，Kunming650224China；2.YunnanAgriculturalUniversity，Kunming，Yunnan650201)

In recent years，the rapid development of the sheep and goat embryo engineering technology propeled the growing demand of oocytes, which are important cells to preserve super female livestock genetic resources in the animal germplasm resources protection system，However，oocytes is extremely sensitive to low temperature and freeze due to the special structure and function and study on its cryopreservation lagged behind that on embryo technology, leaving how to improve the quality of cryopreservation oocytes a challenging focus in the subzero biology and embryo biotechnology research．This article reviewed the latest research progress and existing problems of goat oocyte cryopreservation，and thereafter proposed effective measures on how to further improve the quality of sheep and goat oocyte cryopreservation to provide theoretical guidance for future research．

sheep；goats；oocytes；cryopreservation

2014-06-25，

2014-09-22

國家絨毛羊產業(yè)技術體系(CARS-40)

馬 媛(1989-)，女，云南香格里拉人，在讀碩士，研究方向：動物遺傳育種與繁殖。E-mail：649831740@qq.com

*[通訊作者] 洪瓊花(1968-)，女，云南大理人，碩士，研究員，研究生導師，研究方向：動物遺傳育種與繁殖。E-mail：yxh7168@126.com

S811.6

A

1005-5228(2015)01-0001-05