陳榮劍，祝仲珍，王占科，袁小蘭，胡新華，寧麗萍，蘭小鵬

近年來，隨著住院患者抗菌藥物不合理使用現(xiàn)象日益嚴(yán)重，促進(jìn)和誘導(dǎo)了細(xì)菌耐藥的發(fā)生，研究導(dǎo)致細(xì)菌耐藥原因和機制已引起國內(nèi)外高度重視［1-3］。有文獻(xiàn)報道，低劑量氟喹諾酮類藥物可體外誘導(dǎo)從臨床感染患者標(biāo)本中分離出來的大腸埃希菌菌株發(fā)生細(xì)菌耐藥現(xiàn)象［4］，但低劑量抗菌藥物濃度體外誘導(dǎo)標(biāo)準(zhǔn)菌株耐藥性的研究報道國內(nèi)外不多見。金黃色葡萄球菌是外科感染患者的常見致病菌，也是醫(yī)院內(nèi)感染的常見菌［5］，阿莫西林克拉維酸鉀是臨床上治療感染的常用抗菌藥物［6］。雖然金黃色葡萄球菌標(biāo)準(zhǔn)菌株對阿莫西林克拉維酸鉀敏感，但患者感染的金黃色葡萄球菌菌株普遍存在耐藥現(xiàn)象［7-9］。為此，本文以金黃色葡萄球菌標(biāo)準(zhǔn)菌株為研究對象，通過阿莫西林克拉維酸鉀亞最低殺菌濃度(minimal bactericidal concentration，MBC)體外多步誘導(dǎo)培養(yǎng)，觀察金黃色葡萄球菌標(biāo)準(zhǔn)菌株MBC值變化，旨在證明MBC抗生素可誘導(dǎo)細(xì)菌耐藥的發(fā)生，為臨床合理使用抗生素劑量提供試驗依據(jù)，現(xiàn)報告如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 標(biāo)準(zhǔn)菌株:金黃色葡萄球菌標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC 29213，由江西省臨床檢驗中心提供。

1.1.2 抗菌藥物:阿莫西林克拉維酸鉀，規(guī)格為1.5 g/支，阿莫西林:克拉維酸鉀為4∶1，批號為20140316，有效期為2年，購自華北制藥集團有限公司。

1.1.3 主要試劑和設(shè)備:M-H肉湯細(xì)菌培養(yǎng)液，批號為20140318，有效期為3年，購自鄭州安圖綠科生物工程有限公司;M-H瓊脂固體培養(yǎng)平板，規(guī)格為直徑9 cm，批號為20131124B，購自鄭州安圖綠科生物工程有限公司。系列麥?zhǔn)蠘?biāo)準(zhǔn)比濁管，購自梅里埃診斷產(chǎn)品(上海)有限公司;LRHS-100型37℃恒溫培養(yǎng)箱，購自上海躍進(jìn)醫(yī)療器械有限公司。BSC1500RIB2X型生物安全柜，購自濟南博科生物技術(shù)有限公司。WALK AWAY 40SI型全自動藥敏鑒定分析儀及藥敏板條，均購自上海西門子醫(yī)療器械有限公司。

1.2 方法

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)菌株液制備:在生物安全柜中，金黃色葡萄球菌標(biāo)準(zhǔn)菌株解凍后，無菌操作條件下，將標(biāo)準(zhǔn)菌株接種在M-H瓊脂固體培養(yǎng)平板復(fù)活，然后接種環(huán)取少許菌落，接種于不含抗生素的M-H肉湯培養(yǎng)液中，37℃培養(yǎng)24 h后，用麥?zhǔn)蠘?biāo)準(zhǔn)管調(diào)整菌液濃度為 1 ×105cfu/ml，備用。

1.2.2 微量稀釋法測定MBC:用抗菌藥物微量稀釋法測定金黃色葡萄球菌標(biāo)準(zhǔn)菌株MBC［10］。在生物安全柜內(nèi)，無菌操作，首先用M-H細(xì)菌培養(yǎng)液對阿莫西林克拉維酸鉀分別進(jìn)行倍比稀釋，分別加入12×8孔聚苯乙烯無菌微孔培養(yǎng)板中，然后再分別加入金黃色葡萄球菌標(biāo)準(zhǔn)原始菌株或誘導(dǎo)菌株，使抗菌藥物終濃度分別為 1024、512、256、128、64、32、16、8、4、2、1 和 0．5 μg/ml，金黃色葡萄球菌標(biāo)準(zhǔn)原始菌株或誘導(dǎo)后菌株終濃度為1×105cfu/ml。同時，設(shè)空白對照孔和生長對照孔，空白對照孔加MH細(xì)菌培養(yǎng)液，但不加細(xì)菌液;生長對照孔加細(xì)菌液和M-H細(xì)菌培養(yǎng)液，但不加抗菌藥物。微孔細(xì)菌培養(yǎng)板37℃培養(yǎng)24 h后，肉眼觀察微孔內(nèi)細(xì)菌生長情況，取清晰透明底部無沉淀微孔細(xì)菌培養(yǎng)液，三線法接種在M-H瓊脂固體培養(yǎng)基，培養(yǎng)24 h后，觀察有無細(xì)菌生長。M-H瓊脂固體培養(yǎng)基上無細(xì)菌生長的最小抗生素濃度為MBC。為減少MBC測定試驗誤差以及確保亞MBC藥物濃度誘導(dǎo)，避免誤使用MBC藥物濃度導(dǎo)致細(xì)菌全部殺死造成誘導(dǎo)終止和失敗，本試驗同一菌株平行測定5次，MBC值均發(fā)生變化，才被認(rèn)定誘導(dǎo)后菌株MBC變化值。

1.2.3 MBC抗菌藥物多步誘導(dǎo)耐藥菌株:首先用微量稀釋法測定抗菌藥物MBC，測定金黃色葡萄球菌標(biāo)準(zhǔn)原始菌株MBC值，記為MBC0。取10μl金黃色葡萄球菌標(biāo)準(zhǔn)原始菌株(MBC0)加入5．0 ml MH液態(tài)培養(yǎng)基中，調(diào)整阿莫西林克拉維酸鉀終濃度為1/2 MBC0，37℃誘導(dǎo)培養(yǎng)24 h，測定誘導(dǎo)后菌株MBC值，如果MBC值沒有變化，保持抗菌藥物濃度不變，繼續(xù)誘導(dǎo)培養(yǎng)細(xì)菌，每天均測定MBC值，并觀察有無變化。如果經(jīng)多次誘導(dǎo)培養(yǎng)后菌株MBC值發(fā)生變化，記作MBC1，改變抗菌藥物誘導(dǎo)終濃度為1/2 MBC1，繼續(xù)誘導(dǎo)培養(yǎng)，繼續(xù)每天測定MBC值。如果多次誘導(dǎo)培養(yǎng)后，菌株MBC值又發(fā)生變化，再記作MBC2，改變抗菌藥物終濃度為1/2 MBC2，再繼續(xù)誘導(dǎo)培養(yǎng)。以此類推，阿莫西林克拉維酸鉀誘導(dǎo)組連續(xù)誘導(dǎo)35 d，每天測定并記錄MBC變化值及其誘導(dǎo)變化時間。

1.2.4 誘導(dǎo)后耐藥菌株的鑒定:本組試驗誘導(dǎo)出的耐藥菌株(MBC升高10倍以上)，經(jīng)不含任何抗菌藥物M-H液態(tài)增菌培養(yǎng)基，穩(wěn)定傳代3次，用麥?zhǔn)蠘?biāo)準(zhǔn)管調(diào)整菌液濃度為1×105cfu/ml(0．5個麥?zhǔn)蠁挝?，經(jīng)WALK AWAY 40SI型全自動西門子藥敏鑒定分析儀，自動判斷對阿莫西林和阿莫西林克拉維酸鉀的耐藥性，重復(fù)測定10次，并與誘導(dǎo)前標(biāo)準(zhǔn)菌株耐藥性進(jìn)行分析。

2 結(jié)果

2.1 亞MBC阿莫西林克拉維酸鉀不同誘導(dǎo)時間對金黃色葡萄球菌耐藥性的影響 金黃色葡萄球菌ATCC 29213標(biāo)準(zhǔn)菌株阿莫西林克拉維酸鉀MBC0值為2．0 μg/ml，通過1．0 μg/ml(1/2 MBC0)阿莫西林克拉維酸鉀濃度誘導(dǎo)10 d發(fā)現(xiàn)，金黃色葡萄球菌ATCC 29213標(biāo)準(zhǔn)菌株阿莫西林克拉維酸鉀MBC升高到4．0μg/ml(MBC1)。第11天開始，阿莫西林克拉維酸鉀誘導(dǎo)劑量升高到 2．0μg/ml(1/2 MBC1);繼續(xù)誘導(dǎo)到18 d，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，金黃色葡萄球菌阿莫西林克拉維酸鉀MBC升高到8．0μg/ml(MBC2)。第19天開始，阿莫西林克拉維酸鉀誘導(dǎo)劑量再升高到4．0μg/ml(1/2 MBC2);繼續(xù)誘導(dǎo)到25 d發(fā)現(xiàn)，金黃色葡萄球菌阿莫西林克拉維酸鉀MBC升高到16．0μg/ml(MBC3)。以此類推，繼續(xù)增加阿莫西林克拉維酸鉀誘導(dǎo)劑量發(fā)現(xiàn)在誘導(dǎo)后30和35 d金黃色葡萄球菌阿莫西林克拉維酸鉀MBC 升高到32．0μg/ml(MBC4)和 64．0 μg/ml(MBC5)。本組試驗數(shù)據(jù)表明，隨著亞MBC阿莫西林克拉維酸鉀誘導(dǎo)時間增加，金黃色葡萄球菌菌株耐藥性增強，經(jīng)過35 d誘導(dǎo)細(xì)菌耐藥性增加了32倍。

2.2 誘導(dǎo)出的耐藥菌株對阿莫西林克拉維酸鉀耐藥率 本組試驗誘導(dǎo)出的金黃色葡萄球菌耐藥菌株，經(jīng)全自動細(xì)菌藥敏鑒定分析儀進(jìn)行藥敏鑒定，結(jié)果發(fā)現(xiàn)對阿莫西林克拉維酸鉀耐藥率為100%，而原始菌株耐藥率為0。

3 討論

臨床患者、包括普通外科感染患者不合理使用抗菌藥物，不僅包括使用抗生素種類不合理，經(jīng)驗用藥嚴(yán)重，而且也包括使用劑量不合理，劑量使用過小或過大，抗菌藥物使用種類不合理和抗菌藥物使用劑量不合理可能是導(dǎo)致細(xì)菌耐藥的主要原因［11］。金黃色葡萄球菌標(biāo)準(zhǔn)菌株常用于臨床微生物實驗室細(xì)菌藥敏試驗質(zhì)量控制，標(biāo)準(zhǔn)菌株表現(xiàn)為對某種抗菌藥物存在天然敏感或耐藥［12］。本試驗采用亞MBC抗菌藥物誘導(dǎo)的菌株為金黃色葡萄球菌ATCC 29213標(biāo)準(zhǔn)菌株，其阿莫西林克拉維酸鉀MBC值為2．0 μg/ml，最小抑菌濃度(minimum inhibitory concentration，MIC)為 1．0 μg/ml，說明金黃色葡萄球菌ATCC 29213標(biāo)準(zhǔn)菌株對阿莫西林克拉維酸鉀均敏感。本組研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，阿莫西林克拉維酸鉀誘導(dǎo)金黃色葡萄球菌ATCC 29213標(biāo)準(zhǔn)菌株10 d，MBC值開始升高 1倍，誘導(dǎo)第 18、25、30、35天，金黃色葡萄球菌 MBC值由 2．0μg/ml升高到64．0μg/ml。本試驗證明阿莫西林克拉維酸鉀亞MBC均可以誘導(dǎo)金黃色葡萄球菌ATCC 29213標(biāo)準(zhǔn)敏感菌株出現(xiàn)耐藥現(xiàn)象。

抗菌藥物突變選擇窗(mutation selection window，WSW)可指導(dǎo)臨床合理選擇抗菌藥物治療劑量，WSW一般介于抗菌藥物的耐藥變異預(yù)防濃度(mutation prevention concentration，MPC)和 MIC之間［13-15］。值得注意的是，臨床上細(xì)菌出現(xiàn)耐藥現(xiàn)象，并不是突然發(fā)生的，細(xì)菌從敏感到耐藥，有一個漸變的過程，表現(xiàn)為MIC和MBC逐步發(fā)生變化。因此，WSW濃度也在變化，這就是本研究每天都要對誘導(dǎo)菌株進(jìn)行MBC值檢測的原因。

本試驗通過每天觀察被誘導(dǎo)細(xì)菌MBC值變化，并不斷提高抗菌藥物誘導(dǎo)濃度，能誘導(dǎo)出金黃色葡萄球菌標(biāo)準(zhǔn)菌株的耐藥菌株，可能原因為:①同一菌株在繁殖過程中存在藥物耐藥性差異;②亞MBC殺死絕大多數(shù)藥物敏感細(xì)菌后，留下對藥物耐藥的極少部分“逃逸細(xì)菌”株;③“逃逸細(xì)菌”株耐藥出現(xiàn)遺傳學(xué)改變可被穩(wěn)定傳代。本組研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，金黃色葡萄球菌ATCC 29213標(biāo)準(zhǔn)敏感菌株經(jīng)過連續(xù)誘導(dǎo)5次MBC升高，歷經(jīng)35 d最終變成耐藥菌株。細(xì)菌發(fā)生耐藥的機制很復(fù)雜，不僅涉及細(xì)菌耐藥質(zhì)粒的產(chǎn)生、基因的突變、細(xì)菌細(xì)胞膜改變、藥物外輸?shù)燃?xì)菌內(nèi)部因素，也涉及細(xì)菌微環(huán)境的改變［16-18］。

本試驗研究發(fā)現(xiàn)，阿莫西林克拉維酸鉀可以成功誘導(dǎo)金黃色葡萄球菌耐藥，提示亞MBC誘導(dǎo)細(xì)菌耐藥的機制復(fù)雜，可能涉及細(xì)菌外膜通透性改變，阻止抗菌藥物進(jìn)入細(xì)菌體內(nèi)、細(xì)菌突變具備藥物分子主動外排系統(tǒng)及抗菌藥物作用靶點改變等。已有文獻(xiàn)報道，亞MIC抗菌藥物可通過誘導(dǎo)細(xì)菌生物膜形成以及SOS基因損傷修復(fù)等機制導(dǎo)致細(xì)菌耐藥的發(fā)生［19-20］。本組研究結(jié)果提示，臨床長時間低劑量使用抗菌藥物可誘導(dǎo)耐藥菌株即“逃逸細(xì)菌”的發(fā)生，臨床不僅要合理使用抗菌藥物種類，更要重視和合理使用抗菌藥物使用劑量。

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