陳立強，王洋洋，司艷輝 綜述；梁潔玲，李海珠 審校(廣東省肇慶市第一人民醫(yī)院：.檢驗科；.血液內(nèi)科 56060)

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SNAREs蛋白復(fù)合物與囊泡融合分子調(diào)節(jié)機制的研究進展*

陳立強1，王洋洋1，司艷輝2綜述；梁潔玲1，李海珠1審校(廣東省肇慶市第一人民醫(yī)院：1.檢驗科；2.血液內(nèi)科 526060)

SNAREs； 囊泡融合； Synaptobrevins； Syntaxins； 突觸相關(guān)蛋白

細胞內(nèi)大分子物質(zhì)及顆粒性物質(zhì)不能自由穿過細胞膜，必須以囊泡運輸?shù)姆绞竭M行跨膜轉(zhuǎn)運，囊泡介導(dǎo)的轉(zhuǎn)運方式，無論是正向或是逆向轉(zhuǎn)運，都包括3個主要步驟，分別是外殼蛋白的選擇，囊泡的出芽與形成和轉(zhuǎn)運物質(zhì)的選擇[1]。研究表明在囊泡運輸過程中N-乙基馬來酰亞胺敏感因子附著蛋白受體(SNAREs)發(fā)揮著重要作用，自從SNAREs蛋白復(fù)合物被發(fā)現(xiàn)，它就作為細胞膜融合的關(guān)鍵組分而被廣泛深入研究[2]；現(xiàn)將SNAREs蛋白復(fù)合物與囊泡融合分子調(diào)節(jié)機制研究的最新進展進行綜述。

1 SNAREs核心蛋白的分子結(jié)構(gòu)與功能

SNARE復(fù)合物指的是N-乙基馬來酰亞胺敏感因子附著蛋白受體復(fù)合物，其由4個七肽重復(fù)序列的SNARE結(jié)構(gòu)組成的螺旋形結(jié)構(gòu)體[3-4]，其中3個SNARE結(jié)構(gòu)體會在細胞膜的特定位置進行錨定位，形成膜與膜之間的結(jié)合位點，被稱為定位-SNARE復(fù)合物(target-SNARE或t-SNARE)；而第4個SNARE結(jié)構(gòu)體可錨定在需要融合的膜上，稱為囊泡-SNARE復(fù)合物(vesicle-SNARE或v-SNARE)，膜融合過程需要一系列如Synaptobrevins、Syntaxins 和突觸相關(guān)蛋白等SNAREs核心蛋白的分子的協(xié)同作用共同完成[5-6]。

1.1 Synaptobrevins SNARE蛋白的氨基酸序列和胞吐作用已經(jīng)得到廣泛的研究，其中v-SNARE Synaptobrevins蛋白是由一組相對分子質(zhì)量為19×103的小分子蛋白組成，其參與Ca2+依賴的囊泡融合作用。Synaptobrevins蛋白通過其C-末端跨膜結(jié)構(gòu)域促進SNARE的“拉鏈樣結(jié)合”反應(yīng)而實現(xiàn)囊泡融合[7]。Synaptobrevins蛋白可被血清型為B、D、F和G的肉毒桿菌神經(jīng)毒素(肉毒毒素)裂解而失去生物學作用，造成胞吐作用受到抑制。Synaptobrevins 1和2在真核細胞均有表達，例如在神經(jīng)肌肉接頭、感覺細胞(如毛細胞等)和光感受器等，Synaptobrevins蛋白缺乏會使囊泡分泌功能嚴重受損以及完全抑制由Ca2+誘導(dǎo)的囊泡分泌作用[8-9]。

1.2 Syntaxins Syntaxins 是鑲嵌于胞膜的t-SNARE跨膜蛋白，在膜融合過程和Ca2+誘導(dǎo)的胞吐過程中，不同的Syntaxins 蛋白功能結(jié)構(gòu)域在融合過程的各環(huán)節(jié)都發(fā)揮著重要作用。Syntaxins 具有單一的跨膜區(qū)結(jié)構(gòu)域和胞內(nèi)組成的SNARE復(fù)合體結(jié)構(gòu)域(H3)和調(diào)節(jié)結(jié)構(gòu)域(Habc)[10]。Syntaxin 蛋白的核心結(jié)構(gòu)域由特定的synaptobrevin和SNAP-25蛋白復(fù)合體組成；最近的研究表明，Syntaxin 可被神經(jīng)毒素BoNT/C裂解，而抑制了Ca2+誘導(dǎo)的神經(jīng)元細胞和神經(jīng)內(nèi)分泌細胞分泌神經(jīng)遞質(zhì)。Habc 結(jié)構(gòu)域是由3個α-螺旋折疊形成的一個封閉蛋白結(jié)構(gòu)，在囊泡融合過程中封閉結(jié)構(gòu)會解開而暴露SNARE結(jié)構(gòu)域。Syntaxin 與一系列融合調(diào)節(jié)蛋白相互作用，例如synaptotagmin，Ca2+通道蛋白和存在于毛細胞的otoferlin蛋白，對胞膜融合起到精細的調(diào)節(jié)作用[11]。Syntaxin 1A和syntaxin 1B是大腦中主要的syntaxin 異構(gòu)體，但syntaxins 3和3A主要存在于神經(jīng)分泌細胞和視網(wǎng)膜細胞中；哺乳動物毛細胞表達syntaxin 1A和syntaxin 3，然而毛細胞SNARE復(fù)合物的分子確切機制還有待深入研究[12]。

1.3 突觸相關(guān)蛋白(SNAP) SNAP是廣泛表達于原核和真核生物中的t-SNARE，在膜融合過程中起著重要作用。SNAP是缺乏跨膜結(jié)構(gòu)域的胞質(zhì)蛋白，其通過位于中心分子的棕櫚酰側(cè)鏈半胱氨酸殘基形成的硫酯鍵附著于突觸前膜上，SNAP-25的兩個蛋白螺旋結(jié)構(gòu)是SNARE核心復(fù)合體的組成部分，在鈣觸發(fā)的胞吐作用中發(fā)揮重要作用[13-14]。研究表明SNAP-25基因敲除小鼠的鈣觸發(fā)胞吐作用嚴重受損，表明SNAP-25在神經(jīng)分泌的重要性；肉毒桿菌神經(jīng)毒素BoNT/A可裂解SNAP-25，使t-SNARE形成陷阱，從而抑制胞吐作用。SNAP-23與SNAP-25是同源異構(gòu)體，是突觸后膜谷氨酸受體蛋白的組成部分，這兩個SNAP亞型是通過棕櫚酰側(cè)鏈連接到胞膜上；然而它們對肉毒毒素的敏感性不同，SNAP-25的可被肉毒毒素BoNT/A，C和E裂解，而SNAP-23被肉毒毒素BoNT/A和E裂解[15-16]。

2 SNAREs在囊泡融合中的作用

SNAREs通過其穩(wěn)定存在的三分子結(jié)構(gòu)來連接囊泡膜和細胞膜，三個分子結(jié)構(gòu)各由約60個氨基酸組成，其一是由synaptobrevin蛋白和syntaxin 蛋白組合而成，另外兩個由SNAP-25組合構(gòu)成的。SNAREs復(fù)合體精細的分子結(jié)構(gòu)通過許多平行排列的α-蛋白螺旋結(jié)構(gòu)相互纏繞，形成一個“亮氨酸拉鏈樣”的嵌入式結(jié)構(gòu)，該結(jié)構(gòu)外周由1個亮氨酸殘基和3個谷氨酰胺殘基組合而成的重復(fù)模塊組件[17-18]。嵌入式結(jié)構(gòu)延伸進入胞膜脂質(zhì)雙層，參與囊泡膜融合體的形成?！傲涟彼崂湗印鼻度胧浇Y(jié)構(gòu)的相互連接，促使囊泡和細胞膜之間互相靠近，連接結(jié)構(gòu)的構(gòu)象改變與syntaxin 和synaptobrevin蛋白特定結(jié)構(gòu)氨基酸序列改變在囊泡融合中起到關(guān)鍵作用[19-20]。

SNARE的兩個結(jié)構(gòu)域通過跨膜結(jié)構(gòu)域錨定在相互融合的兩膜上，而t-SNARE和v-SNARE的介導(dǎo)使連接的兩膜在特定的位置發(fā)生融合作用[21]。絕大多數(shù)t-SNARE復(fù)合體在螺旋束的中心位置都含有相對保守的谷氨酰胺序列，稱為“Q-SNARE蛋白”，而在v-SNARE的這個位置含有的是精氨酸序列，稱為“R-SNARE蛋白”。所有的SNARE復(fù)合物在膜融合的過程中產(chǎn)生催化功能，不同類型SNARE復(fù)合物在不同的膜轉(zhuǎn)運過程中發(fā)揮作用[22-23]。大量研究表明SNARE復(fù)合物參與酵母細胞內(nèi)膜系統(tǒng)轉(zhuǎn)運過程，包括那些參與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)到高爾基體，高爾基體到囊泡，高爾基體到細胞膜轉(zhuǎn)運和同型液泡融合等，大多數(shù)的酵母或哺乳動物的SNARE同源基因的功能相似[24]。酵母含有5種R-SNAREs (Snc 1p，Snc 2p，Nyv 1p，Sec22p和Ykt 6p)，而哺乳動物細胞中含有至少10種(包括VAMPs 1，2，3，4，5，7，8，sec22b，ykt 6和tomosyn[25]。因此，R-SNAREs對哺乳動物細胞膜轉(zhuǎn)運過程和協(xié)調(diào)哺乳動物生理功能起關(guān)鍵作用。在某些情況下，多細胞生物完成正常生理功能需要專門的膜結(jié)構(gòu)，而在這些膜結(jié)構(gòu)之間轉(zhuǎn)運需要特定的SNAREs，稱為組織特異性SNAREs。例如組織特異性SNAREs(包括syntaxin 1A，SNAP-25和VAMP 2)能調(diào)節(jié)哺乳動物細胞囊泡的胞吐作用，而在酵母中沒有同源蛋白的表達[26]。VAMP 5，屬于質(zhì)膜SNARE，主要是在肌肉細胞中，在誘導(dǎo)肌肉收縮過程中發(fā)揮作用。此外，syntaxin 17主要在于類固醇激素合成細胞的滑面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中表達，而syntaxin 11在免疫系統(tǒng)的特定轉(zhuǎn)運過程中發(fā)揮重要角色[27]。

3 小 結(jié)

SNAREs蛋白復(fù)合物在囊泡融合中起到核心的作用，亮氨酸拉鏈模式是詮釋囊泡融合機制最有代表性的解說，然而其機制有待進一步的完善。對SNARE蛋白及其調(diào)控因素的研究，有利于更加深入了解SNAREs蛋白復(fù)合體調(diào)節(jié)囊泡融合未知的相關(guān)機制，從而為揭示囊泡融合過程提供可靠地科學依據(jù)。

[1]Yany L,Dun AR,Martin KJ,et al.Secretory vesicles are preferentially targeted to areas of low molecular SNARE density[J].PLOS One,2012,7(11):e49514.

[2]Kato N,Expression BH.Localization and interaction of SNARE proteins in arabidopsis are selectively altered by the dark[J].Plant Signal Behav,2010,5(11):1470-1472.

[3]Wesolowski J,Paumet F.SNARE motif:a common motif used by pathogens to manipulate membrane fusion[J].Virulence,2010,1(4):319-324.

[4]Brewer KD,Li W,Horne BE,et al.Reluctance to membrane binding enables accessibility of the synaptobrevin SNARE motif for SNARE complex formation[J].Proc Natl Acad Sci U S A,2011,108(31):12723-12728.[5]Lobingier BT,Merz AJ.Sec1/Munc 18 protein Vps 33 binds to SNARE domains and the quaternary SNARE complex[J].Mol Biol Cell,2012,23(23):4611-4622.

[6]Cheng KK,Lam KS,WU Dong-hai,et al.APPL1 potentiates insulin secretion in pancreatic beta cells by enhancing protein kinase Akt-dependent expression of SNARE proteins in mice[J].Proc Natl Acad Sci U S A,2012,109(23):8919-8924.

[7]Alpadi K,Kulkarni A,Comte V,et al.Sequential analysis of Trans-SNARE formation in intracellular membrane fusion[J].PLOS Biol,2012,10(1):e1001243.

[8]Nair U,Jotwani A,Geng JF,et al.SNARE proteins are required for macroautophagy[J].Cell,2011,146(2):290-302.

[9]Vrljic M,Strop P,Ernst JA,et al.Molecular mechanism of the Synaptotagmin-Snare interaction in Ca2+-Triggered vesicle fusion[J].Nat Struct Mol Biol,2010,98(3):325-331.

[10]Sudhof TC,Rizo J.Synaptic vesicle exocytosis[J].Cold Spring Harb Perspect Biol,2011,3(12):112-115..

[11]Gao Y,Zorman S,Gundersen G,et al.Single reconstituted neuronal SNARE complexes zipper in three distinct stages[J].Science,2012,337(610):1340-1343.

[12]Reverter M,Rentero C,Vila de Muga SA,et al.Cholesterol transport from late endosomes to the Golgi regulates t-SNARE trafficking,assembly,and function[J].Mol Biol Cell,2011,22(21):4108-4123.

[13]Hernandez JM,Stein A,Behrmann EA,et al.Membrane fusion intermediates via directional and full assembly of the SNARE complex[J].Science,2012,336(688):1581-1584.

[14]Murray DH,Tamm LK.Molecular mechanism of cholesterol-and Polyphosphoinositide-Mediated syntaxin clustering[J].Biochemistry,2011,50(42):9014-9022.

[15]Diao JJ,Su ZL,Ishitsuka Y,et al.A single-vesicle content mixing assay for SNARE-mediated membrane fusion[J].Nat Commun,2010,1(1):54.

[16]Morgera F,Sallah MR,Dubbke ML,et al.Regulation of exocytosis by the exocyst subunit Sec6 and the SM protein Sec1[J].Mol Biol Cell,2012,23(2):337-346.

[17]Xia T,Tong J,Rathore SS,et al.Network motif comparison rationalizes Sec1/Munc 18-SNARE regulation mechanism in exocytosis[J].BMC Syst Biol,2012,6(1):19.

[19]Meijer M,Burkhardt P,de Wit H,et al.Munc 18-1 mutations that strongly impair SNARE-complex binding support normal synaptic transmission[J].EMBO J,2012,31(9):2156-2168.

[20]Fraldi A,Annunziata F,Lombardi AA,et al.Lysosomal fusion and SNARE function are impaired by cholesterol accumulation in lysosomal storage disorders[J].EMBO J,2010,29(21):3607-3620.

[21]Lorentz A,Baumann A,Vitte J,et al.The SNARE Machinery in Mast Cell Secretion[J].Front Immunol,2012,3:143.

[22]Wu Y,Gu YW,Morphew MK,et al.All three components of the neuronal SNARE complex contribute to secretory vesicle docking[J].J Cell Biol,2012,198(3):323-330.

[23]Boswell KL,James DJ,Esquibel JM,et al.Munc 13-4 reconstitutes calcium-dependent SNARE-mediated membrane fusion[J].J Cell Biol,2012,197(2):301-312.

[24]Domanska MK,Kiessling V,Tamm LK.Docking and fast fusion of synaptobrevin vesicles depends on the lipid compositions of the vesicle and the acceptor SNARE Complex-Containing target membrane[J].Biophysical J,2010,99(9):2936-2946.

[25]Liu W,Parpura V.SNAREs:could they be the answer to an energy landscape riddle in exocytosis[J].Scientific World Journal,2010,10(3):1258-1268.

[26]van den Bogaart G,Holt MG,Bunt GA,et al.One SNARE complex is sufficient for membrane fusion[J].Nat Struct Mol Biol,2010,17(3):358-360.

[27]Khodthong C,Kabachinski G,James DJ.Munc 13 homology domain-1 in CAPS/UNC31 mediates SNARE binding required for priming vesicle exocytosis[J].Cell Metabolism,2011,14(2):254-263.

[28]Ramakrishnan NA,Drescher MJ,Drsecher DG.The SNARE complex in neuronal and sensory cells[J].Mol Cell Neurosci,2012,50(1):58-69.

廣東省科技廳產(chǎn)業(yè)技術(shù)研究與開發(fā)資金計劃項目資助(2012B031800498)；廣東省肇慶市科技創(chuàng)新計劃項目資助(2012E284)。

10.3969/j.issn.1672-9455.2015.10.057

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1672-9455(2015)10-1462-02

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