喬劍楠，周曉輝

(新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院干部病房內(nèi)一科，新疆 烏魯木齊 830054)

新疆維吾爾族老年人低骨量與ADPN基因多態(tài)性的相關(guān)性研究

喬劍楠，周曉輝

(新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院干部病房內(nèi)一科，新疆 烏魯木齊 830054)

目的 研究ADPN基因2個單核苷酸多態(tài)性位點T45G(rs2241766)、G276T(rs1501299)與新疆維吾爾族老年人低骨量的相關(guān)性，探討該基因多態(tài)性維吾爾族的分布差異。方法收集2010年以來入住新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院干部病房的維吾爾族患者共490例，使用雙能X線骨密度儀測量腰椎或髖關(guān)節(jié)骨密度（BMD）值，根據(jù)BMD值進行分組，其中低骨量病例組(骨量減低組+骨質(zhì)疏松組)250例，對照組(骨量正常組)240例。采用多重SNaPshot SNP方法對ADPN基因T45G及G276T位點進行基因分型。結(jié)果(1)ADPN基因多態(tài)性在病例組與對照組間整體進行比較，基因型及等位基因分布差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)；(2)ADPN基因T45G、G276T兩位點按性別分組，該基因多態(tài)性在男性、女性之間的分布差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)；(3)Logistic回歸分析提示女性及高血壓是影響骨質(zhì)疏松的獨立危險因素。結(jié)論ADPN基因T45G、G276T多態(tài)性與新疆地區(qū)維吾爾族老年人群低骨量發(fā)生無明顯相關(guān)性。

ADPN基因；低骨量；骨密度；維吾爾族

骨質(zhì)疏松癥(Osteoporosis，OP)是以骨量低下、骨微結(jié)構(gòu)破壞、導(dǎo)致骨脆性增加和骨折為特征的一種全身性骨病[1]。它是一種患病風險隨年齡增長而逐漸增加的退行性疾病，已成為人類健康的重要殺手。脂聯(lián)素(ADPN)是近年新發(fā)現(xiàn)的一種由脂肪細胞特異分泌的細胞因子，在調(diào)節(jié)糖和脂肪代謝、抗炎、抗動脈粥樣硬化等過程發(fā)揮重要作用[2-3]。

脂聯(lián)素基因位于染色體3q27，是代謝綜合征的易感位點，其基因全長16 kb，由3個外顯子和2個內(nèi)含子組成，編碼244個氨基酸。體外研究和動物實驗均表明脂聯(lián)素可通過抑制破骨細胞的骨吸收活性，增加成骨細胞的活性和骨基質(zhì)的礦化，增加骨量[4]。

本研究擬探討新疆維吾爾族老年人的ADPN基因多態(tài)性與低骨量的關(guān)系及分布差異，為該人群骨質(zhì)疏松的遺傳學(xué)機制研究提供一定的理論基礎(chǔ)。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2010年3月至2014年6月以來連續(xù)收集入住新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院干部病房住院的維吾爾族老年患者490例，根據(jù)BMD測定結(jié)果進行分組。病例組250例(骨量減低168例+骨質(zhì)疏松82例)，年齡平均(71.290±7.430)歲；對照組240例，年齡60～88歲，平均(69.894±6.789)歲。

1.2 納入標準 嚴格參照2011年世界衛(wèi)生組織(WHO)推薦的最新OP診斷標準[1]，根據(jù)DEXA測定結(jié)果：以骨量正常(T＞-1)為對照組，將骨量減低患者(-2＜T≤-1)和骨質(zhì)疏松患者(T≤-2)合稱為低骨量病例組(T≤-1)。意識清楚，語言表達能力正常，年齡≥60歲，長期居住新疆達10年以上；遵循自愿原則，并與患者簽訂知情同意書。

1.3 排除標準 (1)影響骨代謝性疾病(如甲狀腺疾病、甲狀旁腺疾病、嚴重肝腎功能疾病及免疫性疾病等)；(2)長期服用促骨形成及抑制骨形成制劑、激素、抗腫瘤藥物、免疫抑制劑等影響骨代謝的藥物；(3)惡性腫瘤，如惡性淋巴瘤、肺癌、多發(fā)性骨髓瘤、胃癌、白血病等；(4)骨折、手術(shù)史等。

1.4 方法

1.4.1 調(diào)查內(nèi)容 研究對象均接受了流行病學(xué)問卷調(diào)查，問卷調(diào)查內(nèi)容包括：(1)一般社會人口學(xué)資料；(2)個人生活習(xí)慣；(3)家族史及既往疾病史；(4)疾病診斷及服藥情況；(5)骨質(zhì)疏松的風險評估。

1.4.2 骨密度測定 利用法國DMS公司生產(chǎn)的DEXA骨密度檢測腰椎前后位和(或)髖關(guān)節(jié)BMD，開機后用體模對設(shè)備進行BMD校準。當體模測量值的變異系數(shù)(腰椎為1.2%，股骨近端為2.0%)在正常范圍內(nèi)時即可開始檢測，每部位重復(fù)操作3次，每次均重新定位。骨密度檢測人員是經(jīng)過專門培訓(xùn)的同一個技術(shù)人員，骨密度分析系統(tǒng)可自動獲得BMD結(jié)果。

1.4.3 基因組DNA提取 采集空腹外周靜脈全血2 ml于EDTA抗凝管中，1 h內(nèi)儲存在備用的-80℃冰箱中。使用DNA快速提取試劑盒提取靜脈全血基因組DNA，其方法按照DNA提取試劑盒操作規(guī)程說明進行。然后根據(jù)估計的濃度將樣本稀釋至工作濃度5～10 ng/μl。

1.4.4 引物設(shè)計 設(shè)計用于擴增本研究中所要求SNP位點片段的PCR引物，及相鄰SNP位點的延伸引物用于單堿基延伸。用Primer3.0軟件設(shè)計引物，引物由上海生工生物工程股份有限公司合成，見表1。

表1 引物序列

1.4.5 PCR反應(yīng) ADPN基因T45G、G276T多態(tài)進行所在片段的PCR擴增反應(yīng)，經(jīng)3 U SAP酶和1 U Exonuclease I酶純化后，得到純化的PCR產(chǎn)物。再進行SNaPshot單堿基延伸純化反應(yīng)，最后獲得純化的延伸產(chǎn)物。

1.4.6 基因測序 取0.5 μl純化后的延伸產(chǎn)物，與0.5 μl Liz120 SIZESTANDARD，9 μl Hi-Di(美國ABI)混勻，95oC變性5 min后上ABI3730XL測序儀，在該測序儀上收集原始數(shù)據(jù)，并用GeneMapper 4.1來分析進行基因測序。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS17.0統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計處理，利用檢驗判斷等位基因及各基因型頻率是否符合Hardy-Weinberg平衡。采用均數(shù)±標準差(±s)對計量資料進行描述，數(shù)據(jù)進行正態(tài)性檢驗和方差齊性檢驗后，符合正態(tài)性和方差齊者，其兩組間比較采用t檢驗；不符合正態(tài)性分布及方差不齊者，其兩組間比較采用秩和檢驗。采用χ2檢驗或Fisher精確概率法對計數(shù)資料進行比較；建立Logistic回歸模型對相關(guān)因素進行分析，所有統(tǒng)計檢驗均為雙側(cè)概率檢驗，以P＜0.05(雙尾)作為檢驗水準。

2 結(jié)果

2.1 低骨量病例組與對照組的一般資料比較 兩組老年患者的性別、年齡、體重指數(shù)、甘油三酯、膽固醇、高血壓、糖尿病、冠狀動脈粥樣硬化性心臟病等指標比較顯示，除了性別和高血壓比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)外，其余各項指標比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)，見表2。

2.2 基因測序結(jié)果 基因測序后上ABI3730XL測序儀，在該測序儀上收集原始數(shù)據(jù)，并用GeneMapper 4.1來分析進行基因測序，見圖1～圖3，峰值右側(cè)方標示代表其基因型，單峰表示純合，雙峰表示雜合。

表2 兩組老年患者的一般資料比較[例(%)，±s]

表2 兩組老年患者的一般資料比較[例(%)，±s]

組別病例組對照組χ2/t值P值性別(男性) 115(46.0) 168(70.0) 18.612 0.000冠心病114(45.6) 102(42.5) 0.582 0.649高血壓190(76.0) 126(52.5) 17.770 0.000糖尿病116(46.4) 132(55.0) 0.036 0.319年齡(歲) 71.290±7.430 69.894±6.789 1.032 0.079 BMI(kg/m2) 24.462±2.592 23.692±3.256 -0.343 0.663甘油三酯(mmol/L) 1.907±1.576 1.993±3.276 -0.369 0.725膽固醇(mmol/L) 4.562±1.138 4.378±1.333 1.323 0.195

圖1 ADPN基因T45G、G276T位點野生純合型

圖2 ADPN基因T45G、G276T位點突變雜合型

圖3 ADPN基因T45G、G276T位點突變雜合型

2.3 ADPN基因T45G、G276T多態(tài)性在兩組維吾爾族老年人群低骨量的分布頻率比較 T45G、G276T基因型及等位基因頻率在病例組與對照組間整體進行比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)；在病例組中與對照組中分別進行維吾爾族的比較，ADPN基因T45G、G276T多態(tài)性中各基因型及等位基因頻率分布差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)，見表3和表4。

2.4 兩組不同性別維吾爾族老年人ADPN基因T45G、G276T多態(tài)性的比較 由于性別在一般資料中存在差異，為進一步明確維吾爾族中性別與ADPN基因多態(tài)性是否存在一定的相關(guān)性，故將ADPN基因多態(tài)性與性別之間進行了相關(guān)分析。由表5、表6可見，ADPN基因T45G、G276T兩位點各基因型及等位基因頻率在男、女性別之間的分布差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)，且在同性別的病例組與對照組之間，及同組別的男、女性別之間的差異比較也均無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。

表3 兩組維吾爾族老年人ADPN基因T45G多態(tài)性的分布[頻數(shù)（%）]

表4 兩組維吾爾族老年人ADPN基因G276T多態(tài)性的分布[頻數(shù)（%）]

表5 不同性別的維吾爾族老年人ADPN基因T45G多態(tài)性的分布[頻數(shù)(%)]

表6 不同性別的維吾爾族老年人ADPN基因G276T多態(tài)性的分布[頻數(shù)(%)]

2.5 新疆維吾爾族老年人低骨量相關(guān)因素的非條件Logistic回歸分析 由表2一般資料比較可見，在病例組及對照組之間分布存在差異，為進一步明確民族、性別、高血壓病、身高與ADPN基因位點T45G、G276T多態(tài)性等因素與低骨量之間的關(guān)系，本研究將上述因素共同納入Logistic回歸分析中(表7)。從表7可見，性別、高血壓病是獨立危險因素。民族、身高及ADPN基因位點T45G、G276T多態(tài)性與低骨量發(fā)生無明顯相關(guān)性(P＞0.05)。

表7 維吾爾族老年人低骨量相關(guān)因素的非條件Logistic回歸分析

3 討論

新疆是中國多民族聚居突出的地區(qū)之一，本研究通過維吾爾族老年人群基因多態(tài)性，對于探索骨質(zhì)疏松癥致病基因和易感基因的分布特征、研究骨質(zhì)疏松癥的發(fā)病機理及基因水平的診斷和治療有重要意義。脂聯(lián)素具有抗動脈粥樣硬化、調(diào)節(jié)血糖和抗炎等作用[3]。

脂聯(lián)素可以從以下途徑影響骨代謝[5]：骨骼局部產(chǎn)生的脂聯(lián)素以自分泌或旁分泌的途徑促進骨形成，而循環(huán)中的脂聯(lián)素則以內(nèi)分泌的途徑抑制骨形成，另外，脂聯(lián)素通過影響胰島素信號通路間接促進骨的形成，對骨代謝的作用是上述三者綜合作用的結(jié)果。Sodi等[6]發(fā)現(xiàn)高分子量多聚體脂聯(lián)素/總脂聯(lián)素比率與護骨素呈負相關(guān)，表明脂聯(lián)素能影響骨代謝是通過改變成骨細胞產(chǎn)生護骨素從而影響破骨細胞調(diào)控的骨吸收。張向梅等[7]認為脂聯(lián)素可通過抑制護骨素表達、誘導(dǎo)成骨細胞RANKL表達，誘導(dǎo)破骨細胞生成。臨床研究方面，一些學(xué)者認為脂聯(lián)素與骨密度呈負相關(guān)，而另一些研究者卻末能找到脂聯(lián)素與骨密度相關(guān)的證據(jù)[7]。

3.1 ADPN水平與骨密度關(guān)系 Frost等[8]和Barbour等[9]發(fā)現(xiàn)20～29歲的健康男性脂聯(lián)素與峰值骨量、髖部BMD負相關(guān)，與股骨頸骨髓腔大小正相關(guān)。來自美國的報道：年齡70～79歲的健康老人，只有女性髖部和全身骨密度每年丟失率與脂聯(lián)素有關(guān)，而男性無關(guān)，然而同一組人群男性而不是女性血清脂聯(lián)素水平越高，骨折風險越大，這種關(guān)系獨立于身體組分和骨密度。Johansson等[10]發(fā)現(xiàn)老年男性，脂聯(lián)素獨立于骨折其他危險因素，可以預(yù)測骨折風險，推斷脂聯(lián)素水平的高低有可能是骨折的一個危險因素。最近的META分析顯示脂聯(lián)素與BMD負相關(guān)突出明顯，然而只有在男性高水平脂聯(lián)素可以預(yù)測脊柱骨折的風險。最新報道高水平血清脂聯(lián)素可以預(yù)測老年男性骨折風險。也有相反的報道，意大利的研究年齡在29～97歲的男性，脂聯(lián)素與BMD無明顯相關(guān)性。

3.2 ADPN單核苷酸多態(tài)性與骨密度的關(guān)系 甘潔民等[11]發(fā)現(xiàn)上海地區(qū)絕經(jīng)后婦女脂聯(lián)素基因單核苷酸多態(tài)性與骨質(zhì)疏松癥無相關(guān)性，與骨轉(zhuǎn)換率也無相關(guān)性。Lee等[12]對韓國249例女性和80例男性進行脂聯(lián)素基因第2外顯子T45G和第2內(nèi)含子G276T多態(tài)性與骨密度關(guān)系分析，發(fā)現(xiàn)韓國婦女攜帶T45G位點的G等位基因的個體的腰椎骨密度比那些攜帶TT基因型的低，而男性T45G各組基因型的骨密度則差異無統(tǒng)計學(xué)意義。因此，T45G(rs2241766)、G276T(rs1501299)的基因型可能與骨量或者骨形成有關(guān)。本實驗結(jié)果顯示，校正年齡、體質(zhì)量、身高及體質(zhì)指數(shù)之后，ADPN基因T45G、G276T兩位點分析顯示，2個位點均存在多態(tài)性；但與老年維吾爾族人群骨密度無明顯相關(guān)性?？赡苁窃摱鄳B(tài)位點與疾病位點存在連鎖不平衡所致。同一基因多態(tài)性在更大的人群中是否表現(xiàn)出同樣的結(jié)果還需要深入研究。實驗結(jié)果還提示T45G(rs2241766)、G276T(rs1501299)多態(tài)性并沒起重要的病因?qū)W作用，或者位點通過與其他位點相互作用、相互影響而協(xié)同致病，而其本身沒有起主因子的作用，故與骨密度無相關(guān)性。

3.3 低骨量與高血壓病、女性的關(guān)系 女性一生中受骨量的影響因素主要與體內(nèi)雌激素水平有關(guān)。邢晨芳等[13]將153例女性分為絕經(jīng)組及未絕經(jīng)組進行比較研究發(fā)現(xiàn)，前者的骨密度較后者嚴重偏低。表明女性骨量下降主要受體內(nèi)雌激素水平的控制。導(dǎo)致破骨細胞活性相對增強，成骨細胞活性絕對降低，從而引起骨吸收增加及骨形成減少，血液中鈣離子明顯增加，由于負反饋作用抑制體內(nèi)甲狀旁腺激素的分泌，維生素D合成也減少，進一步引起鈣離子在胃腸道內(nèi)的吸收減少，加速骨量丟失。

目前關(guān)于高血壓病導(dǎo)致骨量減少的機制研究尚不成熟，主要考慮有以下幾方面：(1)腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)(RASS)可使血管收縮從而升高血壓，同時血管緊張素Ⅱ也可激活破骨細胞前體分化成熟，誘導(dǎo)該類細胞中核因子配合體受體激動劑的表達，使破骨細胞活動增強，從而導(dǎo)致骨量減少；(2)維生素D缺乏可間接激活RASS，從而引起血壓升高，同時可激活甲狀旁腺激素，減少鈣離子的吸收，導(dǎo)致骨量減低；(3)體內(nèi)鈣隨尿液排除增多可引起血清鈣離子水平降低，機體為升高血鈣通過負反饋作用引起甲狀旁腺功能亢進，進而促進腸鈣吸收，破骨細胞活性相對增強，進而出現(xiàn)血鈣和軟組織鈣含量增加而骨鈣減少的“遷徙”現(xiàn)象，引起骨代謝失衡，出現(xiàn)OP。

綜上所述，本研究未發(fā)現(xiàn)ADPN基因T45G、G276T兩位點多態(tài)性在維吾爾族分布存在差異，可能ADPN基因T45G、G276T多態(tài)性與新疆地區(qū)維吾爾族老年人群低骨量發(fā)生無明顯相關(guān)性。女性、高血壓病是低骨量發(fā)生的獨立危險因素。故這兩個位點多態(tài)性可能不是本研究維吾爾族老年人群納入對象低骨量發(fā)生的危險因子。

[1]中華醫(yī)學(xué)會骨質(zhì)疏松和骨礦鹽疾病分會.原發(fā)性骨質(zhì)疏松癥診治指南(2011年)[J].中華骨質(zhì)疏松和骨礦鹽疾病雜志,2011,4(3): 2-17.

[2]Cheong MY,Bang OS,Cha MH,et al.Association of theadiponectin gene variations with risk of ischemic stroke in a Korean population[J].Yonsei Med J,2011,52(1):20-25.

[3]Mohammadzadeh G,Zarghami N.Associations between single-nucleotide polymorphisms of the adiponectin gene,serumadiponectin levels and increased risk of type 2 diabetes mellitus inIranian obese individuals[J].Scand J Clin Lab Invest,2009,69(7):764-771.

[4]Jee SH,Sull JW,Lee JE,et al.Adiponectin concentrations:agenome-wide association study[J].Am J Hum Genet,2010,87(4): 545-552.

[5]Shinoda Y,Yamaguchi M,Ogata N,et al.Regulation of bone formation by adiponectin through autocrine/paracrine andendocrine pathways[J].J Cell Biochem,2006,99(1):196-208.

[6]Sodi R,Hazell MJ,Durham BH,et al.The circulatingconcentration and ratio of total and high molecular weight adiponectin in post-menopausal women with and without osteoporosis and its association with body mass index and biochemical markers of bone metabolism[J].Clin Biochem,2009,42(13-14):1375-1380.

[7]張向梅,謝 輝,袁凌青,等.脂聯(lián)素對人成骨細胞護骨素和核因子B化受體活素配體表達的影響[J].中華醫(yī)學(xué)雜志,2008,88 (22):1562-1565.

[8]Frost M,Abrahamsen B,Nielsen TL,et al.Adiponectin and peak bone mass in men:across-sectional,population-based study[J].Calcif Tissue Int,2010,87(1):36-43.

[9]Barbour KE,Zmuda JM,BoudreauR,et al.The Health ABC Study The effects of adiponectin and leptin on changes in bone mineral density[J].Osteoporos Int,2012,23(6):169-710.

[10]Johansson H,Oden A,Lerner UH,et al.High serum adiponectin predicts incident fractures inelderly men:Osteoporotic fractures in men(MrOS)Swden[J].J Bone Miner Res,2012,27(6):1390-1396.

[11]甘潔民,繆應(yīng)新,施 泓,等.脂聯(lián)素基因多態(tài)性與老年婦女骨質(zhì)疏松癥相關(guān)性研究[J].老年醫(yī)學(xué)與保健,2009,15(3):175-177.

[12]Lee WY,Rhee EJ,Oh KW,et al.Identification of adiponectin andits receptors in human osteoblast-like cells and association of T45G polymorphism in exon 2 of adiponectin gene with lumbar spine bone mineral density in Korean women[J].Clin Endocrinol(Oxf), 2006,65(5):631-637.

[13]邢晨芳,范國裕,段言峰,等.絕經(jīng)和中老年婦女骨密度的關(guān)系[J].實用醫(yī)學(xué)雜志,2010,26(8):1361-1362.

Correlation of polymorphisms of ADPN gene with low bone mineral density in elderly Uyghur people in Xinjiang province.

QIAO Jian-nan,ZHOU Xiao-hui.The First Department of Internal Medicine,Cadre Wards,the First Affiliated Hospital of Xinjiang Medical University,Urumqi 830054,Xinjiang,CHINA

ObjectiveTo study the correlation of polymorphisms of ADPN gene T45G(rs2241766)and G276T(rs1501299)with low bone mineral density in elderly Uyghur people in Xinjiang province,and to explore the distribution differences of polymorphisms of the gene in ethnic people.MethodsA total of 490 elderly Uyghur patients were selected from cadre wards of the First Affiliated Hospital of Xinjiang Medical University since 2010.Dual energy X-ray absorptiometry was used to detect bone mineral density(BMD)of lumbar spine and hip.All the patients were divided into the low BMD case group(with osteopenia and osteoporosis,250 cases)and control group(normal BMD,240 cases)according to the value of BMD.Genotype of ADPN T45G and G276T polymorphisms were done by multiplex SNaPshot reaction.Results(1)ADPN gene polymorphisms were compared between the low BMD case group and control group,which showed that there was no significant difference in the distribution of genotypes and alleles(P＞0.05).(2)The polymorphism of ADPN gene(T45G,G276T)showed no statistically significant difference in the distribution between male and female(P＞0.05);(3)Logistic regression analysis showed that women and hypertension were the independent risk factors for low osteoporosis.ConclusionADPN gene(T45G,G276T)polymorphism showes no significant correlation with low bone mineral density in elderly Uyghur people in Xinjiang province.

ADPN gene;Osteopenia;Bone mineral density;Uyghur

R68

A

1003—6350（2015）10—1418—05

10.3969/j.issn.1003-6350.2015.10.0508

2014-10-19)

喬劍楠。E-mail：358838581@qq.com