史麗娟，彭勝，鄭陽，王志宏，彭密軍

(吉首大學(xué) 林產(chǎn)化工工程湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，杜仲湖南省工程實(shí)驗(yàn)室，湖南 張家界 427000)

離子液體(IL)近年來被越來越多的學(xué)者應(yīng)用于提取領(lǐng)域。Zhang［1］用［C4mim］［PF6］超聲波輔助法提取厚樸中厚樸酚，Du［2］用酸化［C4mim］Br 微波輔助法提取楊梅中楊梅黃酮和槲皮素，Yang Lei［3］用［C4mim］Br 超聲波輔助法提取刺五加中的刺五加苷b 和e。

杜仲系杜仲科杜仲屬多年生落葉喬木植物，其性甘、味微辛，具有提高機(jī)體抗缺氧耐力［4-5］等功效。杜仲中的主要活性成分包括環(huán)烯醚萜［6］、木脂素類［7］、苯丙素類［8］和黃酮類等［9］。其中木脂素類化合物具有抗腫瘤、舒血管作用［10］和降血壓作用［11-12］等活性。已報(bào)道的杜仲木脂素類化合物有28 種［13-15］，例如松脂醇二葡萄糖苷(PDG)。本實(shí)驗(yàn)采用離子液體超聲波輔助法提取杜仲皮總木脂素，用響應(yīng)面法對工藝條件進(jìn)行優(yōu)化，以期為杜仲的工業(yè)生產(chǎn)提供一定參考。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 材料與儀器

杜仲皮;離子液體［C2mim］Br、［C4mim］Br、［C6mim］Br、［C4mim］Cl、［C4mim］BF4均為化學(xué)純;松脂醇二葡萄糖苷(PDG)、甲醇、變色酸、濃硫酸均為分析純;蒸餾水。

XO-5200DT 超聲波清洗機(jī);U-3900 紫外可見分光光度計(jì);AEG-220 萬分之一天平;BM400 型數(shù)顯電熱恒溫水浴鍋。

1.2 杜仲皮總木脂素提取

杜仲皮50 ℃烘干，粉碎。準(zhǔn)確稱取2.00 g 杜仲皮粉于50 mL 錐形瓶中，加入濃度0.68 mol/L 的離子液體溶液，液料比15∶1 mL/g，充分?jǐn)嚢韬蠼? h。50 ℃下超聲提取30 min。過濾，并定容到100 mL。測定吸光度，計(jì)算總木脂素得率。

1.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作［16］

準(zhǔn)確稱取PDG 標(biāo)準(zhǔn)品6.1 mg，用甲醇溶解，分別配制不同濃度的PDG 標(biāo)準(zhǔn)溶液(0. 0，95. 3，190.6，381.3，762.5，1 525.0，3 050.0 μg/mL)，用變色酸比色法［17-18］測定吸光度。以濃度為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

杜仲皮總木脂素的測定方法同PDG 標(biāo)準(zhǔn)溶液。標(biāo)準(zhǔn) 曲 線 方 程A = 0. 000 2C + 0. 006 1，R2=0.999 5。A 為吸光度，C 為標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度。線性范圍95.3 ～3 050.0 μg/mL。

2 結(jié)果與討論

2.1 單因素實(shí)驗(yàn)

2.1.1 ILs 種類對總木脂素得率的影響 實(shí)驗(yàn)條件為濃度0.68 mol/L，液料比15∶1 mL/g，浸泡時(shí)間2 h，提取溫度50 ℃，提取時(shí)間30 min，提取1 次，考察ILs種類對杜仲總木脂素得率的影響，結(jié)果見表1。

表1 ILs 種類對總木脂素得率的影響Table 1 The influence of variety of ILs on the yield of total lignans

由表1 可知，從［C2mim］Br 到［C4mim］Br，總木脂素得率隨著碳鏈長度的增加而增大，從［C4mim］Br到［C6mim］Br，總木脂素得率隨碳鏈長度的增加而降低。這可能是因?yàn)樘兼溸^短，空間位阻太小，溶出目標(biāo)成分木脂素的同時(shí)也溶出大量非目標(biāo)成分;碳鏈過長，空間位阻太大，不利于木脂素的溶出。所以選擇［C4mim］+作為實(shí)驗(yàn)提取溶劑的陽離子。

ILs 中的陰離子主要控制水溶性，陰離子對木脂素的多重交互作用如ρ-ρπ 鍵、氫鍵、溶劑效應(yīng)等各不相同，其水溶性也各不相同，因而對木脂素的水溶性也各不相同，鹽在3 種離子液體中提取杜仲皮總木脂素的得率最高，選擇［C4mim］BF4作為提取試劑。

2.1.2 液料比對總木脂素得率的影響 實(shí)驗(yàn)條件為0.68 mol/L［C4mim］BF4溶液，浸泡時(shí)間2 h，提取溫度50 ℃，提取時(shí)間30 min，提取1 次，考察液料比對杜仲總木脂素得率的影響，結(jié)果見圖1。

圖1 液料比對總木脂素得率的影響Fig.1 The influence of liquid-solid ratio on the yield of total lignans

由圖1 可知，總木脂素得率隨著溶劑用量的增加而提高，當(dāng)液料比超過15∶1 mL/g 后總木脂素得率無明顯增加。這可能是因?yàn)槎胖倨さ牧恳欢?，在一定程度上增大溶劑用量，?huì)提高總木脂素得率，但當(dāng)液料比過高時(shí)，杜仲組織中的總木脂素幾乎全部溶出，故繼續(xù)增大液料比，總木脂素得率增加不顯著。因此，確定液料比為15∶1 mL/g。

2.1.3 ［C4mim］BF4濃度對總木脂素得率的影響實(shí)驗(yàn)條件為15∶1 mL/g［C4mim］BF4溶液，浸泡時(shí)間2 h，提取溫度50 ℃，提取時(shí)間30 min，提取1 次，考察［C4mim］BF4濃度對杜仲總木脂素得率的影響，結(jié)果見圖2。

圖2 ［C4mim］BF4濃度對總木脂素得率的影響Fig.2 The influence of［C4mim］BF4’s concentrations on the yield of total lignans

由圖2 可知，隨［C4mim］BF4的濃度增加，總木脂素得率增長;［C4mim］BF4濃度＞0.68 mol/L，總木脂素得率變緩。其原因可能與溶液粘度有關(guān)。當(dāng)濃度進(jìn)一步增加，溶液粘度也會(huì)繼續(xù)增大，［C4mim］-BF4繼續(xù)滲透到杜仲組織的能力和總木脂素溶出的能力都降低，得率增加不顯著。為節(jié)約成本，［C4mim］BF4濃度選0.68 mol/L。

2.1.4 提取溫度對總木脂素得率的影響 實(shí)驗(yàn)條件為0. 68 mol/L［C4mim］BF4溶 液，液 料 比15∶1 mL/g，浸泡時(shí)間2 h，提取時(shí)間30 min，提取1次，考察提取溫度對杜仲總木脂素得率的影響，結(jié)果見圖3。

圖3 提取溫度對總木脂素得率的影響Fig.3 The influence of ultrasonic temperatureon the yield of total lignans

由圖3 可知，隨著提取溫度的升高，總木脂素得率升高，＞50 ℃后變緩。這可能與超聲波提取技術(shù)的基本原理有關(guān)。超聲波產(chǎn)生的強(qiáng)烈振動(dòng)、強(qiáng)烈空化效應(yīng)、機(jī)械效應(yīng)、熱效應(yīng)等能破壞杜仲組織細(xì)胞，增大溶劑的運(yùn)動(dòng)頻率和速度，使溶劑滲透到杜仲組織細(xì)胞中，加速木脂素類物質(zhì)間的溶出，從而增加總木脂素得率。但溫度過高，對這些效應(yīng)及其協(xié)同作用的貢獻(xiàn)不大，因而其對總木脂素得率的貢獻(xiàn)不明顯。從總木脂素得率及節(jié)約能源的角度出發(fā)，提取溫度為50 ℃。

2.1.5 提取時(shí)間對總木脂素得率的影響 實(shí)驗(yàn)條件 為0. 68 mol/L ［C4mim］BF4溶 液、液 料 比15∶1 mL/g，浸泡時(shí)間2 h，提取溫度50 ℃，提取1次，考察提取時(shí)間對杜仲總木脂素得率的影響，結(jié)果見圖4。

圖4 提取時(shí)間對總木脂素得率的影響Fig.4 The influence of ultrasonic time on the yield of total lignans

由圖4 可知，總木脂素得率隨著提取時(shí)間的增加而增加，30 min 后降低。因?yàn)榭偰局貜亩胖俳M織中溶出時(shí)需要一定時(shí)間，故而延長超聲提取時(shí)間，溶解度增大，總木脂素得率會(huì)增大，但提取時(shí)間過長，有些木脂素可能會(huì)發(fā)生分解反應(yīng)，而雜質(zhì)會(huì)繼續(xù)溶出，從而使得木脂素的得率降低。從得率、節(jié)約能源、節(jié)約時(shí)間等方面考慮，提取時(shí)間為30 min。

2.1.6 浸泡時(shí)間對總木脂素得率的影響 實(shí)驗(yàn)條件 為0. 68 mol/L ［C4mim］BF4溶 液，液 料 比15∶1 mL/g，提取溫度50 ℃，提取時(shí)間30 min，提取1次，考察浸泡時(shí)間對杜仲總木脂素得率的影響，結(jié)果見圖5。

圖5 浸泡時(shí)間對總木脂素得率的影響Fig.5 The influence of soaking time on the yield of total lignans

由圖5 可知，總木脂素得率隨著浸泡時(shí)間的增加而增加;2 h 后，總木脂素得率逐漸趨于平緩。這可能是因?yàn)槿軇B透到杜仲組織和總木脂素從杜仲組織中溶出均需要一定時(shí)間，故適當(dāng)延長浸泡時(shí)間，總木脂素得率會(huì)增加;繼續(xù)延長浸泡時(shí)間，溶劑滲透到杜仲組織和總木脂素從杜仲組織中溶出的過程都達(dá)到平衡，故得率增加不顯著。因此，浸泡時(shí)間選2 h。

2.1.7 提取次數(shù)對總木脂素得率的影響 實(shí)驗(yàn)條件為0. 68 mol/L［C4mim］BF4溶 液，液 料 比15∶1 mL/g，浸泡時(shí)間2 h，提取溫度50 ℃，提取時(shí)間30 min，考察提取次數(shù)對杜仲總木脂素得率的影響，結(jié)果見表2。

表2 提取次數(shù)對總木脂素得率的影響Table 2 The influence of number of extractioncycles on the yield of total lignans

由表2 可知，隨提取次數(shù)的增加，杜仲總木脂素得率增加不顯著，因此，提取1 次即可。

2.2 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)

2.2.1 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)結(jié)果 參照單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，根據(jù)Box-Behnken 的設(shè)計(jì)原理，確定［C4mim］BF4濃度、液料比和提取溫度3 個(gè)因素為影響杜仲總木脂素得率比較顯著的因素，對其進(jìn)行3 因素3 水平實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)。各因素水平見表3，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表4。

表3 響應(yīng)面因素水平表Table 3 Factors and levels of RSM analysis

表4 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 4 The experiment results of RSM

回歸模型為:Y =29. 161 54A +0. 776 41B +0.468 54C－0.260 58AB+0.511 06AC－3.010 00E-003BC－133.006 66A2－0.015 576B2－4.744 00E-003C2－11.537 90。其方差分析見表5。

表5 二次回歸模型方差分析Table 5 Variance analysis for the regression model

由表5 可知，該回歸模型F =28.27，概率P =0.000 1 ＜0.01，表明模型顯著，該實(shí)驗(yàn)方法可行;確定系數(shù)R2=0.97，調(diào)整確定系數(shù)Radj2=0.94，說明回歸模型擬合度較好，線性關(guān)系比較好;失擬項(xiàng)F =4.10，概率P =0.10 ＞0.05，表明失擬項(xiàng)不顯著，那些未知因素對本實(shí)驗(yàn)結(jié)果干擾比較小，可用該模型代替真實(shí)實(shí)驗(yàn)點(diǎn)對實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析;變異系數(shù)c.v. =1.78%，說明該回歸模型精密度比較好。由表5 以及回歸模型知，3 個(gè)因素對總木脂素得率的影響順序?yàn)?［C4mim］BF4濃度＞液料比＞提取溫度。

杜仲皮總木脂素得率的響應(yīng)曲面圖見圖6。

圖6 兩兩交互作用與總木脂素得率的三維響應(yīng)面圖Fig.6 Response surface plots for the interation of two factors on the yield of total lignans

2.2.2 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn) 根據(jù)Box-Behnken 實(shí)驗(yàn)結(jié)果以及回歸模型，利用Design Expert 8.0.6 軟件，得到最佳工藝條件:0.87 mol/L［C4mim］BF4溶液，液料比18.27∶1 mL/g，浸泡時(shí)間2 h，提取溫度54.28 ℃，提取時(shí)間30 min，提取1 次?？紤]到實(shí)驗(yàn)方便可行，改為0.87 mol/L［C4mim］BF4溶液，液料比18∶1 mL/g，提取溫度54 ℃，提取時(shí)間30 min，浸泡時(shí)間2 h，提取1 次。重復(fù)3 次，得率為11.03%，RSD=0.41%。表明該工藝重現(xiàn)性好。

2.3 與普通溶劑、傳統(tǒng)提取法的比較

采用乙醇-超聲輔助提取法［16］提取得到的杜仲總木脂素得率為7. 83%;采用乙醇-熱回流提取法［19］得到的杜仲總木脂素得率為10.07%;用［C4mim］BF4-超聲波輔助法提取得到的杜仲總木脂素得率為11.03%，比用乙醇熱回流法高9.53%，但縮短了83 min，說明離子液體超聲輔助提取法是一種快速、高效的提取法;比用乙醇超聲波輔助法提取時(shí)高40.87%。這是因?yàn)閷㈦x子液體用作溶劑時(shí)，超聲的空化效應(yīng)能加速離子液體［C4mim］BF4穿透植物組織，促進(jìn)植物組織內(nèi)的木脂素類物質(zhì)溶出，且［C4mim］BF4為陽離子表面活性劑，對杜仲皮總木脂素有增溶作用，同時(shí)［C4mim］BF4可能作為一種運(yùn)載體將木脂素從植物細(xì)胞內(nèi)運(yùn)出，增大了其溶出率，從而提高了杜仲總木脂素得率。這也可能是因?yàn)椋跜4mim］BF4的溶劑效應(yīng)很強(qiáng)，對糖苷的溶出起著關(guān)鍵性的作用。也可能是氫鍵和p-p π 鍵共同作用，有利于含糖苷和苯環(huán)等結(jié)構(gòu)的木脂素的溶出。

3 結(jié)論

用離子液體超聲波輔助法提取杜仲皮總木脂素較優(yōu)的離子液體為［C4mim］BF4，最優(yōu)的提取工藝為:濃度0. 87 mol/L［C4mim］BF4溶液，液料比18∶1 mL/g，浸泡時(shí)間2 h，提取溫度54 ℃，提取時(shí)間30 min，提取1 次，得率為11.03%。該工藝提取時(shí)間短、能耗低、操作簡便、提取效率高、所需溶劑少，為杜仲資源的深度開發(fā)利用提供了一定的依據(jù)。

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