徐 敏,田 輝,杜金城,丁秀云,于上富,霍貴成*
(東北農(nóng)業(yè)大學(xué) 乳品科學(xué)教育部重點實驗室,黑龍江 哈爾濱 150030)
枸杞(Lycium chinense)又名“卻老子”,含有大量VA、VB1、VB2及鐵、鈣等多種礦物質(zhì)元素。紅棗又名大棗,含有豐富的維生素C等,被譽為“天然維生素丸”[1]。NEDOVIC V A等[2]通過共固定酵母菌和明串珠菌后,研究其對蘋果酒的連續(xù)發(fā)酵的影響,結(jié)果表明,該方法可以較好地改善蘋果酒的風(fēng)味與質(zhì)量。另外,SCOTT J A等[3]用海綿狀材料將酵母菌與風(fēng)味菌種共固定,然后用于蘋果酒飲料的生產(chǎn),結(jié)果表明,應(yīng)用共固定化技術(shù),酒精發(fā)酵和蘋果酸-乳酸發(fā)酵兩個過程,這兩個發(fā)酵過程可以在一個反應(yīng)器中同時進行,大大簡化了蘋果酒的生產(chǎn)工藝。在國內(nèi)對細胞共固定化技術(shù)的研究始于陳佩華等[4]采用吸附-包埋的方式,將酵母菌、黑曲霉及其產(chǎn)生的糖化酶共同固定在甘蔗渣上,經(jīng)過增殖培養(yǎng),直接將淀粉轉(zhuǎn)化為酒精。本研究期望為枸杞紅棗乳酸飲料產(chǎn)業(yè)提供技術(shù)依據(jù),為提高水果產(chǎn)業(yè)的附加值提供新的動力支持。
枸杞和鮮大棗:市售;保加利亞乳桿菌和嗜熱鏈球菌混合菌粉:乳品科學(xué)教育部重點實驗室。
蛋白胨、牛肉膏:北京奧博星生物技術(shù)有限公司;胰蛋白胨、酵母粉:英國OXOID公司;葡萄糖、瓊脂、磷酸氫二鉀:天津光復(fù)科技發(fā)展有限公司;硫酸錳、檸檬酸氫二胺、乙酸鈉:天津東麗區(qū)天大化學(xué)儀器廠;Tween-80:天津光復(fù)精細化工研究所;以上試劑均為分析純。
MRS培養(yǎng)基:蛋白胨5 g,牛肉膏5 g,酵母粉5 g,胰蛋白胨10 g,葡萄糖20 g,吐溫-80 1.1 g,磷酸氫二鉀2 g,檸檬酸氫二氨2 g,乙酸鈉5 g,硫酸鎂0.58 g,硫酸錳0.25 g,蒸餾水950 mL;固體培養(yǎng)基添加1.6%的瓊脂粉,121 ℃高壓滅菌15 min。
豆?jié){機:九陽公司;DU800紫外可見分光光度計:美國BECKMAN公司;GL-21M離心機:上海市離心機械研究所;DHP-9272電熱恒溫培養(yǎng)箱:上海一恒科技有限公司;PL2002電子天平:梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司;HVE-50全自動高壓滅菌鍋:日本HIRAYAMA公司;XK96-A快速混勻器:姜堰市新康醫(yī)療器械有限公司。
1.3.1 枸杞紅棗乳酸飲料生產(chǎn)工藝流程
1.3.2 工藝要點
枸杞原汁制備:鮮枸杞清洗后,用豆?jié){機榨汁后用3層紗布過濾后5 000 r/min離心10 min,得澄清枸杞原汁,4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>
棗汁的制備:將新鮮的大棗清洗后人工去核,用豆?jié){機榨汁后紗布過濾,以去除大的棗皮,最后5 000 r/min離心20 min,得澄清棗汁,4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>
菌種活化及菌落觀察:
(1)菌種的活化
將從-20 ℃冰箱取出的乳酸菌在室溫條件下融化,以2%的接種量接種到5 mL的MRS液體培養(yǎng)基中進行活化,37 ℃培養(yǎng)14 h后,用混勻器將培養(yǎng)液充分混勻,用接種環(huán)在培養(yǎng)液中輕沾少許液體,在MRS固體培養(yǎng)基上進行三區(qū)劃線,37 ℃培養(yǎng)。
(2)菌體及菌落形態(tài)的觀察
菌株在MRS固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)24 h后,選取一個較大菌落,挑取其中的1/2菌落,進行革蘭氏染色和油鏡觀察,并照相。
(3)生長曲線的測定
用接種環(huán)挑取另外的1/2菌落,接種于MRS液體培養(yǎng)基中,培養(yǎng)約14 h,以2%的接種量接種于MRS液體培養(yǎng)基中,培養(yǎng)約14 h時,再以2%接種量分別接種于54個盛有MRS液體培養(yǎng)基的試管中,并在54個試管分別標(biāo)上0、1 h、2 h、3 h、4 h、6 h、8 h、10 h、12 h、14 h、16 h、18 h、20 h、22 h、24 h、26 h、28 h、30 h(共18個時間段,每個時間段3個平行),37 ℃恒溫培養(yǎng),從起點開始計時當(dāng)?shù)竭_上述時間時,將對應(yīng)的3支試管取出放入4 ℃冰箱中,待18個時間段全部取出后一起用紫外分光光度計測定pH;采用梯度平板稀釋法測定0~30 h內(nèi)的活菌數(shù),重復(fù)3次,作生長曲線。
梯度平板稀釋法:無菌操作,將培養(yǎng)好的菌液搖勻,吸取1 mL加入9 mL無菌生理鹽水中,制成1∶10的稀釋液,再依次進行10倍遞減梯度稀釋,至適當(dāng)稀釋度,吸取1 mL置于滅菌的培養(yǎng)皿中,倒入約15 mL、50 ℃左右的MRS瓊脂培養(yǎng)基,輕輕搖勻。待培養(yǎng)基凝固后,置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)48 h后進行菌落計數(shù),結(jié)果以CFU/mL表示。
將混合菌粉接種于MRS液體培養(yǎng)基內(nèi),37 ℃培養(yǎng)24 h,傳代2~3次后,取將對數(shù)期后穩(wěn)定期初的嗜熱鏈球菌、保加利亞乳桿菌菌液離心(5 000×g,4 ℃,10 min)收集菌體,無菌磷酸鹽緩沖液(phosphate butter saline,PBS)清洗3次,用無菌PBS重懸菌體,制備細胞懸液,并調(diào)整菌濃度為108CFU/mL,于4 ℃儲存,備用。
微生物細胞固定化方法:將10 mL(菌數(shù)約為108CFU)保加利亞乳桿菌嗜熱鏈球菌細胞懸液,加入一定含量的海藻酸鈉溶液(固定化載體溶液),用渦旋振蕩器混勻5 min,用一次性注射器取20 mL左右的海藻酸鈉溶液,滴進氯化鈣溶液(固定化顆粒),進行造粒,4 ℃條件,固定化20 h左右備用。
發(fā)酵原液的調(diào)配:取適量的枸杞汁,然后用飽和碳酸鈉溶液調(diào)pH,當(dāng)pH值約為7.0時,對發(fā)酵原液進行巴氏消毒,然后室溫條件下冷卻20 min,再按一定的比例加入大棗汁,以此,制備發(fā)酵原液[5-7]。
1.3.3 測定方法
固定化載體機械強度的測定方法:在固定化載體的正面,用50 g砝碼按壓,以其能承受的最大壓力來表示固定化載體的機械強度;固定化載體的機械強度計算公式[8]:
式中:d為施壓前后固定化載體的直徑差,mm;50為砝碼質(zhì)量,g;R為施壓前固定化載體的半徑,mm;r1、r2、r3為施壓后固定化載體的半高度,mm;π為圓周率3.14;Pi為固定化載體的機械強度,g/mm2;P為平均固定化載體的機械強度,g/mm2。
還原糖及乳酸測定方法:還原糖的含量測定采用DNS法;乳酸的含量測定采用酸堿滴定法[9]。
感官評價指標(biāo):隨機選取50名性別不同、年齡各異、語言表達能力強的人員進行感官評價,每組20人均進行評分,排除偏差,試驗結(jié)果取平均值,然后進行分析,枸杞紅棗乳酸飲料的感官評分標(biāo)準(zhǔn)如表1(滿分100分)。
表1 枸杞紅棗乳酸飲料的感官評分標(biāo)準(zhǔn)Table 1 Sensory evaluation standard of Lycium chinense and date yoghourt drink
枸杞汁、大棗汁的比例一定程度上影響著乳酸菌的發(fā)酵效果,以枸杞汁與大棗汁體積比1∶6、1∶4、1∶2、1∶1、2∶1、4∶1、6∶1的比例[10-12],接種量為10%的混合菌株,37 ℃發(fā)酵26 h進行試驗,以感官評價為標(biāo)準(zhǔn),篩選出兩種果汁最佳配比,結(jié)果見表2。
表2 發(fā)酵原液配比對發(fā)酵的影響Table 2 Effect of fermentation broth ratio on fermentation
由表2可知,隨著枸杞汁所占比例的增大,組織狀態(tài)逐漸變差、酸味逐漸變?nèi)?;枸杞汁與大棗汁的體積比為1∶2時能達到較好的產(chǎn)酸效果又不會出現(xiàn)嚴(yán)重分層現(xiàn)象;所以選擇枸杞汁和大棗汁的比例為1∶2進行后續(xù)試驗。
氯化鈣和海藻酸鈉是影響固定化載體特性的主要因素;故選取氯化鈣濃度和海藻酸鈉質(zhì)量分?jǐn)?shù)的不同比例,以機械強度為評價指標(biāo)進行試驗,從而選出適宜的兩者比例用于制備紅棗枸杞乳酸飲料。參考相關(guān)文獻[13],本試驗設(shè)置了4個氯化鈣濃度:0.05 mol/L、0.10 mol/L、0.15 mol/L、0.20 mol/L和4個海藻酸鈉質(zhì)量分?jǐn)?shù):4%、5%、6%、7%;試驗結(jié)果見表3。
表3 海藻酸鈉含量和氯化鈣濃度對固定化顆粒特性的影響Table 3 Effect of calcium chloride and sodium alginate concentration on immobilized yeast characteristics
由表3可知,隨著氯化鈣含量的減小,固定化顆粒的機械強度呈現(xiàn)增大的趨勢;而同時,隨著海藻酸鈉含量的減小,整體上,固定化顆粒的機械強度的趨勢為減小趨勢;氯化鈣濃度與機械強度呈負(fù)相關(guān),而海藻酸鈉含量與機械強度之間呈正相關(guān)。當(dāng)氯化鈣濃度為0.05 mol/L,海藻酸鈉含量為7%時,固定化顆粒的機械強度可達23.11 g/mm2;因此13號處理為最優(yōu)組合,即氯化鈣濃度為0.05 mol/L,海藻酸鈉含量為7%,選擇此組合進行后續(xù)試驗。
在上述最優(yōu)條件獲得的基礎(chǔ)上,參考相關(guān)文獻[14-15],關(guān)于乳酸菌的接種量,分別選取2%、6%、10%、14%、18%五個梯度,37 ℃發(fā)酵26 h;以乳酸飲料組織狀態(tài)、口感為指標(biāo),篩選出混合菌株最佳接種量,結(jié)果見表4。
表4 混合菌株接種量對產(chǎn)品組織狀態(tài)的影響Table 4 Effect of mixed strains inoculum on organization status of product
由表4可知,隨著接種量的增加,組織狀態(tài)越差,容易分層,而酸味隨著接種量的增加而增加;綜合考慮,選取混合菌株的接種量為10%。
在上述最優(yōu)條件的基礎(chǔ)上,參考相關(guān)文獻[16],在接種量為10%,37 ℃條件下分別發(fā)酵15 h、25 h、35 h、45 h,以乳酸飲料色澤、口感為評價指標(biāo),篩選出混合菌株最佳發(fā)酵時間,結(jié)果見表5。
表5 發(fā)酵時間對產(chǎn)品品質(zhì)的影響Table5 Effect of fermentation time on product quality
從表5可以看出,隨著發(fā)酵時間的延長,乳酸飲料的顏色越深;然而,隨著發(fā)酵時間的延長,乳酸飲料的酸味越重;當(dāng)浸提時間為35 h時,飲料的色澤和口感較佳,故選擇的發(fā)酵時間為35 h。
參考本研究預(yù)試驗的結(jié)果及相關(guān)參考文獻,選取蔗糖添加量4%、6%、8%、10%4個添加梯度[17],按照工藝流程圖與枸杞紅棗果汁混合物混合,斡旋振蕩器振蕩10 min,然后加入嗜熱鏈球菌保加利亞乳桿菌進行發(fā)酵,以感官評價得分為評價指標(biāo),確定制備枸杞紅棗乳酸飲料蔗糖的最佳添加量。
表6 蔗糖添加量對乳酸飲料品質(zhì)的影響Table 6 Effect of sucrose addition on product quality
由表6看出,隨著蔗糖添加量的變大,組織狀態(tài)越來越有厚重感,而味道越來越甜;當(dāng)添加量為8%時,產(chǎn)品的組織狀態(tài)與風(fēng)味均達到了較好的狀態(tài),綜合各方面的因素考慮,初定確定蔗糖添加量為8%。
根據(jù)上述試驗結(jié)果,本研究初步認(rèn)為影響枸杞紅棗乳酸飲料品質(zhì)的主要因素為保加利亞乳桿菌嗜熱鏈球菌混合菌接種量、蔗糖添加量和發(fā)酵時間,所以以接種量、蔗糖添加量和發(fā)酵時間為3個試驗因素,每個因素選取3個水平,進行正交試驗,其因素與水平見表7。
表7 枸杞紅棗乳酸飲料發(fā)酵條件優(yōu)化正交試驗因素與水平Table 7 Factors and levels of orthogonal experiment for Lycium chinense and date drink fermentation conditions optimization
表8 枸杞紅棗乳酸飲料發(fā)酵條件優(yōu)化正交試驗結(jié)果與分析Table 8 Results and analysis of orthogonal experiment for Lycium chinense and date drink fermentation conditions optimization
由表8可知,影響品質(zhì)的重要因素為接種量,其次為蔗糖添加量;從9個處理可以直觀的看出,最好的組合是A2B2C3,即接種量為10%,發(fā)酵時間為35 h,蔗糖添加量為9%。在此最佳條件下,感官評分為92分。
研究結(jié)果表明,當(dāng)枸杞汁、紅棗汁的體積比為1∶2,氯化鈣物質(zhì)的量濃度為0.05 mol/L,海藻酸鈉質(zhì)量分?jǐn)?shù)為7%,接種量為10%,發(fā)酵時間為35 h,蔗糖添加量為9%,添加適量甜味劑、乳酸鈣等輔料時,枸杞紅棗乳酸飲料產(chǎn)品品質(zhì)良好,發(fā)酵速度適宜。
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