竇會(huì)娟，孫連海，郭文濤

（漯河醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)部，河南 漯河 462002）

早在19 世紀(jì)70 年代，人們就發(fā)現(xiàn)多種擔(dān)子菌子實(shí)體、食用菌深層發(fā)酵液和固體培養(yǎng)物水浸液對(duì)植物病毒有抑制作用[1-2]。后又有多人研究結(jié)果表明，食用菌多糖具有抑菌作用[3-6]，本研究組也有研究表明，香菇的液體發(fā)酵產(chǎn)物對(duì)機(jī)體致病菌也有一定的抑菌作用[7]。近幾年，由于抗生素的廣泛使用，臨床上出現(xiàn)的耐藥菌日漸增多，給治療帶來麻煩。我國(guó)藥食用真菌資源豐富，無毒副作用，而且大型藥食用真菌可以較方便地通過菌絲體或孢子發(fā)酵培養(yǎng)[8]，但其發(fā)酵液對(duì)耐藥菌的抑菌情況的研究較少。

本研究選用香菇（Lentinula edodes）、雞腿菇（Coprinus comaus）、金針菇（Flammulina velutipes）、茶樹菇（Agrocybe aegerita）、杏鮑菇（Pleurotus eryngi）、木耳（Auricularia auricula）、猴頭菇（Hericium erinaceus）7種較常見的食用菌菌種，采用液體深層發(fā)酵的方法獲得其發(fā)酵液，以兒科臨床分離得到的3種耐藥菌較強(qiáng)的肺炎鏈球菌（Streptococcus pneumoniae）、金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、大腸埃希菌（Escherichia coli）為指示菌，用管碟法測(cè)定發(fā)酵液對(duì)細(xì)菌的抑菌圈，通過抑菌率反映其對(duì)耐藥菌的抑菌效果，為更好地開發(fā)食用菌相關(guān)產(chǎn)品提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 食用菌與指示菌

供試食用菌分別是香菇、雞腿菇、金針菇、茶樹菇、杏鮑菇、木耳、猴頭菇：本實(shí)驗(yàn)室保存菌種；供試耐藥菌分別為肺炎鏈球菌（Streptococcus pneumoniae）、金黃色葡萄球菌（Staphyloccocus aureus）、大腸埃希菌（Escherichia coli）：漯河市某醫(yī)院兒科臨床分離標(biāo)本并保存；肺炎鏈球菌ATCC 49619、金黃色葡萄球菌ATCC 2592、大腸埃希菌ATCC25922標(biāo)準(zhǔn)菌株：中國(guó)工業(yè)微生物菌種保藏管理中心。

1.1.2 培養(yǎng)基

馬鈴薯葡萄糖瓊脂（potato dextrose agar，PDA）培養(yǎng)基[9]：馬鈴薯（去皮）200 g，葡萄糖20 g，磷酸二氫鉀（KH2PO4）0.5g，硫酸鎂MgSO4·7H2O0.25g，瓊脂20g，加水至1 000 mL。

一級(jí)搖瓶液體培養(yǎng)基[10]：蔗糖30 g，蛋白胨3 g，酵母2 g，硫酸胺2 g，磷酸二氫鉀1 g，硫酸鎂0.5 g，加水至1 000 mL，調(diào)pH值至7.0。

液體發(fā)酵培養(yǎng)基：蔗糖30 g，玉米粉20 g，麩皮40 g，加水至1 000 mL，調(diào)pH值至7.0。

1.1.3 化學(xué)試劑

磷酸二氫鉀（KH2PO4）：天津市風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司；硫酸銨：鄭州辰尼化學(xué)試劑廠；七水硫酸鎂（MgSO4·7H2O）、葡萄糖：天津市科密歐科技有限公司。以上試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

DHZ-CA 大容量恒溫振蕩器：江蘇太倉市實(shí)驗(yàn)設(shè)備廠；LRH-250-HS恒溫恒濕培養(yǎng)箱：廣東省醫(yī)療器械廠。

1.3 方法

1.3.1 食用菌菌種的活化

取出保存菌種，用接種環(huán)取出一小塊，在含有玻璃珠的無菌水中振蕩，用無菌吸管吸取0.2 mL涂平板，28 ℃培養(yǎng)6 d，挑取單菌落移接到斜面PDA培養(yǎng)基上，加上棉塞，置恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)，28 ℃培養(yǎng)6 d后可見組織塊上長(zhǎng)出絨毛狀菌絲，菌絲長(zhǎng)滿斜面即得斜面菌種。

1.3.2 液體種子制備

用300 mL三角瓶裝液體種子培養(yǎng)基100 mL，接入活化的斜面菌種（0.4 cm2大小5塊）。放入28 ℃、180 r/min下的搖床培養(yǎng)5 d，即得液體搖瓶種子。

1.3.3 發(fā)酵培養(yǎng)

參照香菇液體發(fā)酵產(chǎn)抑菌物質(zhì)活性最高的發(fā)酵條件[11]，發(fā)酵液初始pH 值為5，300 mL三角瓶裝液體發(fā)酵培養(yǎng)100 mL，接入7%的液體菌種，于28 ℃、180 r/min的搖床中培養(yǎng)8 d。

1.3.4 細(xì)菌菌懸液制備

將細(xì)菌菌株接種于PDA斜面，37 ℃培養(yǎng)48 h，用生理鹽水配成106～107CFU/mL的菌懸液備用。

1.3.5 管碟法[12]測(cè)定抑菌活性

采用密集劃線法將細(xì)菌接種于PDA平板培養(yǎng)基上，在培養(yǎng)皿中間放置1個(gè)滅菌牛津杯（高10 mm、內(nèi)徑6 mm），每個(gè)牛津杯中加入200 μL液體發(fā)酵液，置30 ℃恒溫培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)，48 h后測(cè)量抑菌圈直徑，細(xì)菌的標(biāo)準(zhǔn)菌株和相應(yīng)的臨床分離菌株同時(shí)進(jìn)行，每個(gè)處理重復(fù)3次，計(jì)算菌落直徑和相對(duì)抑菌率[13]。

2 結(jié)果與分析

2.1 食用菌發(fā)酵液對(duì)肺炎鏈球菌的抑制

采用管碟法測(cè)定食用菌發(fā)酵液對(duì)肺炎鏈球菌標(biāo)準(zhǔn)菌株和臨床分離菌株的抑菌圈，并計(jì)算相對(duì)抑菌率，結(jié)果見表1。

表1 食用菌發(fā)酵液對(duì)肺炎鏈球菌的抑菌情況Table 1 The inhibition effect of mushroom fermentation broth to Streptococcus pneumoniae

由表1可知，各食用菌發(fā)酵液對(duì)肺炎鏈球菌的抑菌活性是較低的，雞腿菇發(fā)酵液的抑菌圈直徑4.433 mm為最大值，杏鮑菇發(fā)酵液的抑菌圈直徑1.033 mm，為最小值。且各食用菌發(fā)酵液對(duì)分離到的肺炎鏈球菌的相對(duì)抑菌率也都較低，雞腿菇發(fā)酵液的相對(duì)抑菌率30.370%為最大值，金針菇和杏鮑菇發(fā)酵液的相對(duì)抑菌率最低，均在10%以下。結(jié)果表明，食用菌發(fā)酵液對(duì)肺炎鏈球菌的抑菌效果較差。

2.2 食用菌發(fā)酵液對(duì)金黃色葡萄球菌的抑制

采用管碟法測(cè)定食用菌對(duì)金黃色葡萄球菌標(biāo)準(zhǔn)菌株和臨床分離菌株的抑菌圈，并計(jì)算相對(duì)抑菌率，結(jié)果見表2。

表2 食用菌發(fā)酵液對(duì)金黃色葡萄球菌的抑菌情況Table 2 The inhibition effect of mushroom fermentation broth to Staphyloccocus aureus

由表2可知，金針菇發(fā)酵液對(duì)金黃色葡萄球菌的抑菌圈直徑最大，達(dá)到6.733 mm，香菇發(fā)酵液對(duì)金黃色葡萄球菌的抑菌圈直徑次之，為5.068 mm。香菇的相對(duì)抑菌率最高，為62.017%；金針菇次之，58.686%。相對(duì)于肺炎鏈球菌及大腸桿菌來說，7種食用菌發(fā)酵液對(duì)金黃色葡萄球菌的抑菌圈直徑和相對(duì)抑菌率均較高，有較好的抑菌活性。

2.3 食用菌發(fā)酵液對(duì)大腸桿菌的抑制

采用管碟法測(cè)定食用菌對(duì)金黃色葡萄球菌標(biāo)準(zhǔn)菌株和臨床分離菌株的抑菌圈，并計(jì)算相對(duì)抑菌率，結(jié)果見表3。

表3 食用菌液體發(fā)酵液對(duì)大腸桿菌的抑菌情況Table 3 The inhibition effect of mushroom submerged fermentation broth to Escherichia coli

由表3可知，金針菇發(fā)酵液對(duì)大腸桿菌的抑菌圈直徑最高，達(dá)到了5.267 mm，但其相對(duì)抑菌率很低（＜10%）；其他食用菌發(fā)酵液對(duì)大腸桿菌的相對(duì)抑菌率均＜30%。結(jié)果表明，食用菌發(fā)酵液對(duì)肺炎鏈球菌的抑菌效果較差。

3 結(jié)論

從實(shí)驗(yàn)結(jié)果來看，同一種食用菌對(duì)不同病原菌的抑菌作用差別較大，可能是不同細(xì)菌的致病機(jī)制不同而引起的，也可能是由于不同細(xì)菌的耐藥機(jī)制不同而引起的。

本實(shí)驗(yàn)中的相對(duì)抑菌率實(shí)質(zhì)上體現(xiàn)的是食用菌發(fā)酵液對(duì)標(biāo)準(zhǔn)菌株和臨床分離菌株的抑菌情況的比率，相對(duì)抑菌率高就代表該食用菌對(duì)耐藥菌的抑菌效果好。李孫洋等[14]研究結(jié)果表明，相對(duì)抑菌率在50%以上有開發(fā)利用價(jià)值。本實(shí)驗(yàn)選用的臨床分離菌株金黃色葡萄球菌中，耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（methicillin-resistantStaphylococcus aureus，MRSA）檢出率為53.8%，而且該菌株對(duì)青霉素、頭孢唑啉、環(huán)丙沙星、左氧氟沙星、四環(huán)素、阿奇霉素、克林霉素的耐藥性均較高，MRSA的耐藥率明顯高于對(duì)甲氧西林敏感的金黃色葡萄球菌（methicillin susceptibleStaphylococcus aureus，MSSA）[15]，所以對(duì)于臨床分離到的耐藥性較強(qiáng)的金黃色葡萄球菌，下一步可以考慮開發(fā)食用菌的液體發(fā)酵產(chǎn)物來控制其感染。但對(duì)于大腸桿菌和肺炎鏈球菌來說，由于各食用菌發(fā)酵液對(duì)其抑菌圈和相對(duì)抑菌都較低，想要考慮利用食用菌發(fā)酵產(chǎn)物來進(jìn)行抑菌意義就不大了。

本研究所選用的食用菌品種均比較常見，其液體發(fā)酵方法也比較成熟，但其對(duì)臨床耐藥菌的抑菌研究還鮮有報(bào)道。由于發(fā)酵液只進(jìn)行了初步純化，下一步有必要對(duì)發(fā)酵液的活性物質(zhì)和發(fā)酵條件進(jìn)行進(jìn)一步深入研究。

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