蘭玉菲，蔚承祥，王慶武，崔 曉

（山東泰安市農(nóng)業(yè)科學研究院，山東 泰安 271000）

〈病蟲害防治〉

一種山東地栽香菇病害病原菌的分離及鑒定*

蘭玉菲，蔚承祥，王慶武，崔 曉

（山東泰安市農(nóng)業(yè)科學研究院，山東 泰安 271000）

從山東肥城采集到香菇病害樣品，分離得到病原菌分離物FC，提取其基因組總DNA，利用真菌通用引物ITS1/ITS4擴增其rDNA ITS區(qū)域序列并進行測序。將獲得的序列進行同源性比對和構建系統(tǒng)進化樹，發(fā)現(xiàn)FC分離物與GenBank中8個米根霉（R.oryzae）分離物同源性最高，為98．27%，結(jié)合形態(tài)學特征，證明該分離物為米根霉（R.oryzae）。

香菇；病害；ITS；分子鑒定

香菇 [Lentinula edodes(Berk．)Sing．]又名香信、冬菇，其味道鮮美、營養(yǎng)豐富，含有較高的蛋白質(zhì)、氨基酸、維生素以及礦質(zhì)元素，素有山珍、菇中之王等美稱[1]，具有增強免疫力、抗腫瘤、降血壓、降血脂、保肝護肝等藥用功效[2]。據(jù)中國食用菌協(xié)會統(tǒng)計2013年全國香菇產(chǎn)量達710．32萬t，是年產(chǎn)量最大的品種，產(chǎn)量比2012年增長11．78%。

近年，通過對山東省香菇主產(chǎn)區(qū)進行病害調(diào)查，在地栽香菇大棚中發(fā)現(xiàn)了一種新病害，該病害一旦發(fā)生，菌棒就不再出菇，給地栽香菇生產(chǎn)造成了嚴重損失。本研究對該病的病原菌進行分離鑒定，以期為病害的防控提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

供試樣品采自山東肥城市邊院鎮(zhèn)過村，栽培模式為大棚內(nèi)覆土地栽，品種為香菇931，代料栽培原料主要為棉籽殼和木屑。

1.2 主要試劑

真菌總DNA提取試劑盒（E．Z．N．A．@ FungalDNA Kit）購自北京全式金公司；PCR所用試劑均為大連寶生物公司產(chǎn)品。常規(guī)試劑為進口分裝或國產(chǎn)分析純試劑。

1.3 病原菌的分離純化

將采集的病原菌在無菌環(huán)境下接種于涂布有2滴～3滴乳酸（濃度為25%）的PDA培養(yǎng)基中，置于25℃黑暗培養(yǎng)。待菌絲萌發(fā)后，進行3次純化獲得其純培養(yǎng)物，保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 病原菌的形態(tài)學鑒定

將分離的病原菌接種于PDA培養(yǎng)基上，置于25℃恒溫黑暗培養(yǎng)。采用十字交叉法測量菌落直徑，計算菌絲日生長速度，觀察并記錄初生菌絲顏色、菌落顏色變化、表面特征、有無色素產(chǎn)生等。參照方水琴[3]的方法挑取菌株產(chǎn)孢器及菌絲制成水封片，利用顯微成像系統(tǒng)（Olympus BX41） 觀察孢子形態(tài)和大小、菌絲特征及分支情況等，并拍照。

1.5 病原菌的分子生物學鑒定

參照蘭玉菲[4]的方法制備病原菌菌絲體；利用真菌總DNA提取試劑盒提取其基因組總DNA；參照White[5]所報道的用于真菌ITS區(qū)域擴增的通用引物ITS1/ITS4進行PCR擴增，PCR反應體系和程序參照蘭玉菲[4]；PCR結(jié)束后，取4 μL反應液進行瓊脂糖凝膠電泳，檢測擴增結(jié)果，將有目的條帶的PCR產(chǎn)物送北京博尚生物公司測序；將所得DNA序列輸入GenBank進行 Blast檢 索 ， 采 用 Clustalx1．81、DNASTAR、DNAMAN和MEGA 5軟件對所得到的核苷酸序列與GenBank中收錄分離物的相應序列進行比較和分析，并構建系統(tǒng)進化樹。

2 結(jié)果與分析

2.1 病原菌的形態(tài)特征

發(fā)生在菇棚中的病害癥狀見圖 1。分離純化獲得的病原菌菌株的形態(tài)特征觀察結(jié)果見圖2。

圖1 擬鑒定的病害癥狀Fig．1 Symptoms of Lentinula edodes disease

圖2 病原菌菌株的形態(tài)特征觀察Fig．2 An observation on morphological characters of strain FC

分離純化獲得的病原菌（編號為FC） 在PDA培養(yǎng)基上菌落初為白色，無定形，氣生菌絲發(fā)達，呈棉絮狀；后期產(chǎn)生黑色小顆粒，菌絲呈灰色，2 d～3 d即可長滿整個平板（圖2A）；培養(yǎng)5 d后顯微觀察可見菌絲白色透明，無橫隔（圖2B），孢囊梗叢生，不分支，有假根（圖2C），孢子囊頂生，球形或近球形，深褐色（圖2B、圖2D），孢囊孢子呈卵形、球形或近球形，大小不等，淡褐色（圖2E）。

2.2 病原菌ITS基因的擴增

FC菌株ITS區(qū)PCR擴增結(jié)果見圖3。

以提取的病原菌總DNA為模板，經(jīng)PCR擴增，得到長度約為600 bp的目的片段。

2.3 病原菌ITS的序列同源性及系統(tǒng)發(fā)育分析

圖3 病原菌菌株ITS區(qū)PCR擴增Fig.3 PCR amplification of rDNA ITS region of strain FC

序列測定結(jié)果表明，擴增產(chǎn)物長度為604 bp（GenBank登錄號為KT222809），其中包括13 bp 18S rDNA基因序列、199 bp內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū) 1（ITS1）、155 bp 5．8S編碼序列、210 bp內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)2（ITS2）和27 bp的28S rDNA。Blast分析顯示，F(xiàn)C與多株Rhizopus oryzae菌株最大相似性達100%。以黑曲霉（Aspergillus niger） 為外組，構建系統(tǒng)發(fā)育樹，結(jié)果表明FC分離物與GenBank中下載的8個米根霉（R.oryzae）分離物和4個戴爾根霉（R. delemar）分離物聚為一簇。同源性比對結(jié)果表明FC分離物與8個米根霉分離物同源性為98.27%；而與戴爾根霉4個分離物同源性為93.87%；與少孢根霉（R.microsporus）2個分離物的同源性為86.43%；與匍枝根霉（R.stolonifer） 分離物的同源性最低，為85.09%。FC分離物與引起甜菜根腐病病原菌（KJ744361） 的ITS核苷酸一致率達到100%，而與引起桑樹根部腐爛的致病菌（JN003653） 核苷酸一致率為98.76%，綜上說明該分離物為米根霉（R.oryzae）。

圖4 基于ITS序列構建的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.4 Phylogenetic tree based on the ITS sequences and constructed using the Maximum Likelihood method

3 討論

本研究從山東肥城市邊院鎮(zhèn)香菇大棚中分離到真菌菌株FC，對該病原菌的ITS序列與GenBank中的ITS序列進行BLAST比對，并構建系統(tǒng)發(fā)育樹，結(jié)合病原菌形態(tài)特征，將其鑒定為米根霉（R.oryzae）。FC分離物與引起甜菜根腐病病原菌（KJ744361）的ITS核苷酸一致率達到100%。

根霉屬（Rhizopus）屬于接合菌亞門（Zygomycotina） 接合菌綱（Zygomycetes） 毛霉目 （Mucorales）毛霉科（Mucoraceae）[6]。根霉為喜高溫的競爭性雜菌，廣泛分布于空氣、水塘、土壤及有機殘體中，菌絲能分解吸收富含淀粉、糖分等速效性養(yǎng)分基質(zhì)。熟化的培養(yǎng)基在高溫期間接種和發(fā)菌時極易遭受侵害。香菇菌絲能在被根霉侵染過的培養(yǎng)基中繼續(xù)生長，但養(yǎng)分吸收不完全，菌棒板結(jié)，開袋后轉(zhuǎn)色困難[7]。根霉是香菇代料栽培中主要污染真菌之一，分離頻率為4.08%[8]，而危害食用菌的主要為黑根霉 [R.stolonifer（Ehrenb:Fr.Vuill）][6]。本研究分離純化到的FC分離物通過形態(tài)學和分子生物學鑒定結(jié)果發(fā)現(xiàn)病原菌為米根霉，與GenBank中的2個匍枝根霉（R.stolonifer） ITS同源性僅為85.09%，這說明米根霉對食用菌生產(chǎn)也可產(chǎn)生危害，生產(chǎn)中應加以預防和控制。

[1]黃年來.中國香菇栽培學[M].上海：上?？茖W技術文獻出版社，1994.

[2]趙妍，林鋒，宋春艷，等.香菇主要育種技術研究進展[J].生物學雜志，2015，32（2）：92-95.

[3]方水琴，吳福安，陳明勝，等.一種引起成年桑樹根部腐爛的病害及致病菌分離與初步鑒定[J].蠶業(yè)科學，2011，37（5）：785-791.

[4]蘭玉菲，安秀榮，王慶武，等.一種雞腿菇病害病原菌的分離及鑒定[J].山東農(nóng)業(yè)科學，2012，44（3）：84-87.

[5]White TJ,Bruns T,Lee S,et al.PCR protocols:a guide to methods and applications[M].San Diego:Academic Press, 1990:315-322.

[6]張學敏，楊集昆，譚琦.食用菌病蟲害防治[M].北京：金盾出版社，1994.

[7]宋金俤，曲紹軒，馬林.食用菌病蟲識別與防治原色圖譜[M].北京：中國農(nóng)業(yè)出版社，2013.

[8]徐耀波.平菇和香菇代料栽培過程中的污染真菌研究[D].成都：四川農(nóng)業(yè)大學，2003.

Isolation and Molecular Identification of a Pathogen in Lentinula edodes

LAN Yu-fei,YU Cheng-xiang,WANG Qing-wu,CUI Xiao
(Edible Fungi Research Institute,Taian Academy of Agricultural Sciences,Taian 271000,China)

A fungi strain,FC,was isolated from Lentinula edodes and its genome total DNA was obtained．The internal transcribed spacers(ITS)was amplified by PCR using fungi universal primers ITS1 and ITS4．Homology analysis and constructed phylogenetic tree showed that FC shared nucleotide identity of 98．27%with eight Rhizopus oryzae isolates．Combined morphological characteristics,the FC was R.oryzae.

Lentinula edodes;pathogen;internal transcribed spacers(ITS);molecular identification

S646.1

A

1003-8310（2015）06-0074-03

10．13629/j．cnki．53-1054．2015．06．019

山東省食用菌創(chuàng)新團隊病蟲害防控崗位（SDAIT-11-011-05）；國家食用菌產(chǎn)業(yè)體系建設專項（CARS-24）。

蘭玉菲（1980-），女，博士，高級農(nóng)藝師，主要從事食（藥）用菌遺傳多樣性分析、新品種選育、病蟲害防控及栽培技術開發(fā)推廣研究。E-mail:lanyufei526@163．com

2015-09-12