于 萍，隋飛飛，陳艷秋

（延邊大學(xué)農(nóng)學(xué)院，吉林 延吉 133002）

長(zhǎng)白山野生白耙齒菌菌株ITS序列鑒定及其人工馴化栽培試驗(yàn)

于 萍，隋飛飛，陳艷秋*

（延邊大學(xué)農(nóng)學(xué)院，吉林 延吉 133002）

試驗(yàn)以長(zhǎng)白山野生白耙齒菌菌株為試驗(yàn)材料，進(jìn)行ITS序列鑒定及人工馴化栽培試驗(yàn)。利用通用引物ITS1和ITS4進(jìn)行ITS序列鑒定，同時(shí)利用農(nóng)作物下腳料對(duì)白耙齒菌進(jìn)行人工馴化栽培。原種培養(yǎng)料設(shè)置6個(gè)處理，栽培種培養(yǎng)料設(shè)置8個(gè)處理，通過(guò)ITS序列分析結(jié)果得出該菌株ITS序列與NCBI中登錄號(hào)為JX290578．1、FJ462768．1、EU301643．1等9個(gè)白耙齒菌菌株相似性達(dá)100%，驗(yàn)證了其為白耙齒菌（Irpex lacteus）；最佳原種培養(yǎng)料配方為木屑41．5%、豆秸41．5%、麥麩10%、黃豆粉5%、石膏1%、白糖1%，菌絲生長(zhǎng)速度最快，為7．571 mm·d-1，且菌絲濃密，潔白，粗壯；最佳栽培種培養(yǎng)料配方為木屑54%、玉米芯29%、麥麩10%、黃豆粉5%、石膏1%、白糖1%，菌絲生長(zhǎng)速度及長(zhǎng)勢(shì)顯著高于其他處理。

白耙齒菌；ITS序列分析；人工馴化

白耙齒菌（Irpex lacteus） 又名白囊孔菌、白囊耙齒菌。分類(lèi)學(xué)上隸屬于擔(dān)子菌亞門(mén) （Basidiomycetes）層菌綱（Hymenomycetes）非褶菌目（A－phyllophorales） 多孔菌科（Polyporaceae） 耙齒菌屬（Irpex Fr．）[1]。在我國(guó)主要分布于吉林省、河北、山西、江西、甘肅、云南、福建、西藏等省區(qū)[2]。

由于白耙齒菌中含有多種藥用成分[3-4]，已被廣泛應(yīng)用于藥物制劑，經(jīng)深層發(fā)酵物中提取的“乳白耙齒菌多糖”[2，5]，已經(jīng)制成膠囊制劑，用于治療慢性腎小球腎炎，臨床效果良好，是一種極具市場(chǎng)開(kāi)發(fā)潛力的藥用菌。但白耙齒菌對(duì)生長(zhǎng)發(fā)育的環(huán)境條件要求較苛刻，隨著市場(chǎng)開(kāi)發(fā)速度加快，野生資源不斷減少，已呈現(xiàn)供不應(yīng)求的現(xiàn)象。針對(duì)這一現(xiàn)象，本試驗(yàn)對(duì)采自長(zhǎng)白山林區(qū)的野生白耙齒菌菌株進(jìn)行ITS序列分析，驗(yàn)證形態(tài)學(xué)鑒定結(jié)果，通過(guò)人工馴化栽培體系的研究，篩選出適宜長(zhǎng)白山林區(qū)野生白耙齒菌菌絲生長(zhǎng)的原種及栽培種配方，為開(kāi)發(fā)、利用這一野生資源提供理論依據(jù)和技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 供試菌株

供試菌株子實(shí)體于2010年采自長(zhǎng)白山林區(qū)，吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)圖力古爾教授通過(guò)形態(tài)學(xué)鑒定為白耙齒菌（Irpex lacteus）。將子實(shí)體在無(wú)菌條件下進(jìn)行組織分離，經(jīng)PDA培養(yǎng)基純化后獲得供試菌株。菌種由延邊大學(xué)農(nóng)學(xué)院應(yīng)用真菌實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2 試驗(yàn)方法

1．2．1 ITS序列分析

采用改良十六烷基三甲基溴化銨法（Hexadecyltrimethy Ammonium Bromide,CTAB）法[6]提取白耙齒菌DNA，將提取的DNA用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，然后放入-20℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

利用ITS序列通用引物ITS1（5’-TCCGTAGGT GAACCTGCGG-3’） 和 ITS4（5’-TCCTCCGCT TATTGATATGC-3’）對(duì)樣本進(jìn)行擴(kuò)增，其擴(kuò)增體系為：2．5 μL 10×PCR Buffer，2 μL dNTP Mixture，1 μL引物，2 μL模版，0．25 μL Taq DNA聚合酶，ddH2O補(bǔ)置25 μL；反應(yīng)程序?yàn)椋?4℃預(yù)變性5 min，94℃變性 30 s，55℃退火 30 s，72℃延伸 1 min，72℃最后延伸10 min，35個(gè)循環(huán)，4℃保存。將擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行序列測(cè)定，其測(cè)序結(jié)果同GenBank中其他白耙齒菌菌株ITS序列進(jìn)行比較，分析其親緣關(guān)系，驗(yàn)證形態(tài)學(xué)鑒定結(jié)果。

1．2．2 原種培養(yǎng)料配方篩選

原種培養(yǎng)料分別選用雜木屑、玉米芯、豆秸為主料，麥麩、黃豆粉、石膏、白糖為輔料，培養(yǎng)料組成和編號(hào)見(jiàn)表1。按上述原種培養(yǎng)料配方及常規(guī)方法拌好新鮮、無(wú)霉變、無(wú)蟲(chóng)害的主料和輔料，裝入500 mL的原種瓶中，用聚丙烯膜封口后在121℃下滅菌90 min。每個(gè)處理重復(fù)5次。接種后置于25℃恒溫箱中進(jìn)行暗培養(yǎng)。待菌絲萌發(fā)后，定時(shí)記錄菌絲體生長(zhǎng)速度，觀察菌絲體長(zhǎng)勢(shì)、顏色、密度及滿(mǎn)瓶時(shí)間。采用Excel 2003和SPSS11．7進(jìn)行數(shù)據(jù)整理和差異顯著性分析。

表1 白耙齒菌原種培養(yǎng)料配方Tab．1 Original media formula of Irpex lacteus

1．2．3 栽培種培養(yǎng)料配方篩選

栽培種培養(yǎng)料分別選用雜木屑、玉米芯、豆秸為主料，麥麩、黃豆粉、石膏、白糖為輔料，培養(yǎng)料組成和編號(hào)見(jiàn)表2。按上述栽培種培養(yǎng)料配方及常規(guī)方法拌好新鮮、無(wú)霉變、無(wú)蟲(chóng)害的主料和輔料，裝入規(guī)格為17 cm×33 cm栽培袋中，裝料重為450 g，高約8 cm～9 cm，每個(gè)配方重復(fù)5次，在121℃下滅菌90 min，其他試驗(yàn)方法、步驟、測(cè)定項(xiàng)目同1．2．2。

表2 白耙齒菌栽培種培養(yǎng)料配方Tab．2 Plant media formula of Irpex lacteus

2 結(jié)果與分析

2.1 ITS序列分析鑒定結(jié)果

通過(guò)改良CTAB法提取的DNA質(zhì)量較好，符合下一步試驗(yàn)要求。利用引物ITS1和ITS4進(jìn)行PCR擴(kuò)增成功得到ITS序列片段，見(jiàn)圖1。將ITS序列結(jié)果在NCBI中進(jìn)行BLAST比對(duì)，

圖1 白耙齒菌ITS區(qū)域堿基序列Fig．1 Nucleotide sequence of ITS region of DNA from Irpex lacteus

發(fā)現(xiàn)目標(biāo)序列與登錄號(hào)為JX290578．1、FJ462768．1、

EU301643．1等9個(gè)白耙齒菌菌株相似性達(dá)100%，進(jìn)一步驗(yàn)證了其形態(tài)學(xué)鑒定結(jié)果。

2.2 不同原種培養(yǎng)料配方對(duì)白耙齒菌菌絲生長(zhǎng)影響不同原種培養(yǎng)料配方對(duì)白耙齒菌菌絲生長(zhǎng)的影響見(jiàn)表3、圖2。

表3 不同原種培養(yǎng)料配方對(duì)白耙齒菌菌絲生長(zhǎng)的影響Tab．3 Effects of different stock medium on mycelia growth of Irpex lacteus

如表3所示，在配方5中生長(zhǎng)的菌絲生長(zhǎng)速度最快，為7．571 mm·d-1，滿(mǎn)瓶時(shí)間最短。

圖2 不同原種培養(yǎng)料配方中白耙齒菌菌絲生長(zhǎng)情況Fig．2 Mycelia growth condition of Irpex lacteus in different stock medium

由圖2中可以看出，配方5菌絲濃密，潔白，粗壯。配方6中無(wú)論是菌絲生長(zhǎng)速度、濃密度及長(zhǎng)勢(shì)較其他配方差，說(shuō)明白耙齒菌菌絲對(duì)玉米芯利用率不高。綜上所述，配方5（木屑41．5%、豆秸41．5%、麥麩10%、黃豆粉5%、石膏1%、白糖1%）為白耙齒菌菌絲生長(zhǎng)最適原種培養(yǎng)料，其菌絲對(duì)木屑和豆秸有較好的利用率。

2.3 不同栽培種培養(yǎng)料配方對(duì)白耙齒菌菌絲生長(zhǎng)的影響

不同栽培種培養(yǎng)料配方對(duì)白耙齒菌菌絲生長(zhǎng)的影響不同，見(jiàn)表4、圖3。

表4 不同栽培種培養(yǎng)料配方對(duì)白耙齒菌菌絲生長(zhǎng)的影響Tab．4 Effects of different culture medium on mycelia growth of Irpex lacteus

圖3 不同栽培種培養(yǎng)料配方中白耙齒菌菌絲生長(zhǎng)情況Fig．3 Mycelia growth condition of Irpex lacteus in different culture medium

從表4和圖3中可以看出，配方8中菌絲生長(zhǎng)速度顯著優(yōu)于其他配方，為5.044 mm·d-1，圖3中可以觀察到配方8菌絲體濃密，粗壯，沒(méi)有污染情況。配方6僅次于配方8。配方4中菌絲生長(zhǎng)一段時(shí)間后出現(xiàn)生長(zhǎng)停滯現(xiàn)象，未滿(mǎn)袋。待所有菌袋長(zhǎng)滿(mǎn)后，配方1、配方2、配方5、配方8菌袋中均有原基出現(xiàn)。綜上所述，白耙齒菌菌絲生長(zhǎng)的最佳栽培種培養(yǎng)料配方為配方8（木屑54%、玉米芯29%、麥麩10%、黃豆粉5%、石膏1%、白糖1%）。

3 結(jié)論

將ITS序列結(jié)果在NCBI中進(jìn)行BLAST比對(duì)，發(fā)現(xiàn)目標(biāo)序列與登錄號(hào)為JX290578.1、FJ462768.1、EU301643.1等9個(gè)白耙齒菌菌株相似性達(dá)100%，進(jìn)一步驗(yàn)證其形態(tài)學(xué)鑒定結(jié)果。在試驗(yàn)范圍內(nèi)，原種培養(yǎng)料配方5（木屑41.5%、豆秸41.5%、麥麩10%、黃豆粉5%、石膏1%、白糖1%）中菌絲生長(zhǎng)速度快，菌絲濃密，粗壯，滿(mǎn)瓶時(shí)間為20 d，為最佳原種培養(yǎng)料配方。以配方8（木屑54%、玉米芯29%、麥麩10%、黃豆粉5%、石膏1%、白糖1%）為栽培料時(shí)，菌絲生長(zhǎng)速度顯著高于其他配方，長(zhǎng)勢(shì)較好，為最佳栽培種培養(yǎng)料配方。在出菇試驗(yàn)過(guò)程中，部分栽培料中已經(jīng)形成原基，而有關(guān)原基生長(zhǎng)、分化所需要的最佳培養(yǎng)條件需要進(jìn)一步研究。

[1]Yan ZK,Li WL.Colour pictures of medicinal plants of Changbai mountain of China[M].Peking:People’s Medical Publishing House,1992:324.

[2]戴玉成，圖力古爾.中國(guó)東北野生食藥用真菌圖志[M].北京：科學(xué)出版社，2007：100.

[3]楊真威，姜瑞芝，陳英紅，等.耙齒菌糖蛋白I 1-2-1的化學(xué)研究[J].中草藥，2005（36）：1130-1132.

[4]楊真威，姜瑞芝，陳英紅，等.耙齒菌糖蛋白的提取和分離、理化性質(zhì)及抗炎活性[J].天然產(chǎn)物研究與開(kāi)發(fā)，2005，3（17）：280-282.

[5]袁文彬，王淑敏，翁麗麗，等.白耙齒菌發(fā)酵物多糖及蛋白含量測(cè)定[J].長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2012，28（3）：537 -538.

[6]吳發(fā)紅，黃東益，黃小龍，等.幾種真菌DNA提取方法的比較[J].中國(guó)農(nóng)學(xué)通報(bào)，2009（8）：62-64.

ITS Sequence Identification and Artificial Domesticated Cultivation Test of Irpex lacteus from Changbai Mountain

YU Ping,SUI Fei-fei,CHEN Yan-qiu
(College of Agronomy,Yanbian University,Yanji 133002,China)

Taking Irpex lacteus strain of Changbai Mountain as the tested material,its molecular identification and artificial domesticated cultivation were studied．The ITS1 and ITS4 of universal primers were used to identify the sequence of ITS,at the same time,the agricultural residues were used in the I.lacteus domestication．We set 6 disposes for original media formula and 8 disposes for plant media formula,then each dispose have 5 times．The identities of ITS sequence indicate the tested material is I.lacteus.It is similarity with nine I.lacteus of sequence,suce as JX290578．1,FJ462768．1,EU301643．1．The original media formula for I.lacteus cultivation is considered to be that within composed of sawdust 41．5%,beanstalk 41．5%,wheat bran 10%, soybean meal 5%,gypsum 1%,sugar 1%,and the mycelia had the fast growth speed with 7．571 mm·d-1．The mycelia is very thick,white and strong．The most suitable medium is composed of sawdust 54%,corncob 29%,wheat bran 10%,soybean flour 5%,gypsum 1%,sugar 1%．Its mycelia growth rate was significantly higher than other disposes．

Irpex lacteus;ITS sequence analysis;artificial domestication cultivation

S646.9

A

1003-8310（2015）06-0038-04

10．13629/j．cnki．53-1054．2015．06．010

于萍 (1990-)，女，在讀碩士研究生，研究方向?yàn)樘胤N植物資源利用與生物技術(shù)。E-mail:912568268@qq．com

*通信作者：陳艷秋（1963-），女，博士，教授，主要從事食 (藥)用真菌資源、栽培生理及分子生物學(xué)應(yīng)用研究。E-mail:cyq326@126．com

2015-09-28