付 曉，李敬林

(1.遼寧醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院中醫(yī)針灸科，遼寧錦州 121001; 2.遼寧中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院老年病科，沈陽 110032)

益氣解毒活絡(luò)中藥復(fù)方對(duì)糖尿病大鼠腎臟病理組織結(jié)構(gòu)的影響*

付 曉1，李敬林2

(1.遼寧醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院中醫(yī)針灸科，遼寧錦州 121001; 2.遼寧中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院老年病科，沈陽 110032)

目的:探討益氣解毒通絡(luò)中藥復(fù)方(YQJDHL)對(duì)糖尿病(DM)大鼠腎臟結(jié)構(gòu)的影響。方法:SPF級(jí)健康雄性SD大鼠72只，注射鏈脲佐菌素造成糖尿病及痰濁瘀毒中醫(yī)證候模型。應(yīng)用YQJDHL分別在造模成功及成模后2周灌胃給藥，觀察大鼠腎臟病理組織學(xué)變化。結(jié)果:YQJDHL能夠減輕糖尿病腎病(DN)大鼠腎小球肥大、系膜細(xì)胞增生等病理改變，中藥預(yù)防組療效優(yōu)于中藥治療組。結(jié)論:YQJDHL能夠預(yù)防和治療大鼠早期DN，其機(jī)制可能與延緩腎臟病理組織損害有關(guān)。

益氣解毒活絡(luò)中藥復(fù)方;糖尿病腎病;大鼠

糖尿病腎病(DN)是糖尿病(DM)最重要和最常見的并發(fā)癥之一，是慢性腎衰最常見的病因及DN患者死亡的主要原因。中醫(yī)藥防治早期DN有一定的臨床療效，但其病理機(jī)制和療效機(jī)理尚未完全闡明［1］。遼寧省名醫(yī)李敬林教授長期應(yīng)用益氣解毒活絡(luò)法及其方藥治療早期DN取得良好的臨床療效。本研究旨在觀察益氣解毒活絡(luò)(YQJDHL)中藥復(fù)方對(duì)實(shí)驗(yàn)性糖尿病大鼠早期腎臟結(jié)構(gòu)的影響，探討可能的機(jī)制，為臨床防治DN提供依據(jù)。

1 材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

選擇健康雄性SPF級(jí)SD大鼠72只，體質(zhì)量(200±20)g，購于北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司(合格證號(hào)0194036)，大鼠一般狀態(tài)良好，皮毛光澤，進(jìn)食與活動(dòng)正常。

1.2 環(huán)境及飼料

1.2.1 飼養(yǎng)環(huán)境 遼寧中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心SPF級(jí)實(shí)驗(yàn)室籠養(yǎng)，室內(nèi)通風(fēng)及光線良好，溫度、濕度適宜。

1.2.2 動(dòng)物飼料 普通飼料配方:40%玉米面，26%白面，10%麩子，10%魚粉，10%豆餅，2%礦物質(zhì)，1%粗鹽，1%復(fù)合維生素，購于沈陽市于洪區(qū)前民飼料廠。高糖高脂飼料配方:61.5%普通飼料，20%蔗糖，10%豬油，5%蛋黃粉，2.5%膽固醇，1.0%膽酸鹽，由沈陽市于洪區(qū)前民飼料廠配制。

1.3 藥物

1.3.1 受試藥物 YQJDHL中藥復(fù)方，由黃芪30 g、黃精50 g、黃連9g、虎杖15 g、澤蘭30 g、水蛭粉6 g組成。免煎中藥配方顆粒組成由遼寧中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院藥局提供，江陰天江藥業(yè)有限公司生產(chǎn)。臨用時(shí)蒸餾水配制成含生藥3 g/ml濃度湯劑。

1.3.2 西藥對(duì)照藥物 鹽酸貝那普利片(洛汀新)由北京諾華制藥有限公司生產(chǎn)(批號(hào)X1496，規(guī)格10 mg/片)。將藥物搗碎后用生理鹽水溶解，配成0.09 g/L濃度，按1 ml/100 g(體質(zhì)量)劑量，每日灌胃1次。

1.3.3 造模藥物 STZ為美國Sigma公司生產(chǎn)，購于沈陽博瑞斯特商貿(mào)有限公司，臨用前用0.1 mol/L無菌枸櫞酸—枸櫞酸鈉緩沖液(PH 4.2)配制成濃度為10 mg/ml的STZ液。

1.4 主要儀器

LEICA-RM2235型超薄切片機(jī):瑞典;顯微攝影機(jī):Nikon UFX-II型，日本;照相機(jī):Nikon FX-35型，日本。

2 方法

2.1 動(dòng)物模型的建立

造模組給予高脂高糖飼料喂養(yǎng)4周，使體質(zhì)量達(dá)到300 g以上;禁食12 h，按照35 mg/kg(體質(zhì)量) STZ單次尾靜脈注射(注射前用0.1 mol/L無菌枸櫞酸緩沖液(pH4.2)配制);正常組注入等量的無菌枸櫞酸鈉緩沖液。72 h后斷尾取血，測大鼠全血空腹血糖≥16.7 mmol/L者確定為DM模型，血糖穩(wěn)定1周后列入觀察對(duì)象。造模期間有5只大鼠血糖值偏低未列入觀察對(duì)象，成模率為91.94%(57/ 62)。

2.2 動(dòng)物分組及給藥方法

將成模的57只大鼠按照血糖值再次進(jìn)行隨機(jī)分組，分為模型組13只，中藥預(yù)防組11只，中藥低劑量治療組11只，中藥高劑量治療組11只，陽性西藥對(duì)照組11只。模型組及各治療組觀察2周后測大鼠空腹血糖值，代謝籠收集大鼠24 h尿液待測尿微量白蛋白值(遼寧中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科檢測)。注射STZ 2周后，除中藥預(yù)防組外，模型組2只大鼠、中藥低劑量治療組與陽性西藥對(duì)照組各有1只大鼠血糖值恢復(fù)至正常值以下，均舍棄不用。

正常組和模型組給予等量生理鹽水2 ml灌服;將中藥顆粒劑溶于蒸餾水中，中藥預(yù)防組、中藥低劑量治療組及陽性西藥對(duì)照組大鼠每日用藥量按人體(g/kg)－大鼠體表面積比值的等效劑量，即6.3倍計(jì)算;中藥高劑量治療組的用藥量為中藥低劑量治療組的3倍。中藥預(yù)防組在注射STZ成模后立即開始灌服中藥復(fù)方，共計(jì)給藥6周;中藥低劑量治療組、中藥高劑量治療組及陽性西藥對(duì)照組均在成DM模2周后灌胃給藥，共計(jì)給藥4周。實(shí)驗(yàn)期間自由飲水，不使用胰島素和其他降糖藥。

2.3 取材

實(shí)驗(yàn)結(jié)束代謝籠收集尿液后，大鼠禁食不禁水12 h，上午9時(shí)稱重，10%水合氯醛3 ml/kg體質(zhì)量腹腔注射麻醉大鼠，置于解剖臺(tái)上，取仰臥位于腹部切開皮膚，剝離腹腔臟器露出腹主動(dòng)脈，行腹部主動(dòng)脈穿刺取血。大鼠處死后剝離并迅速取出雙側(cè)腎臟，生理鹽水清洗，濾紙吸去臟器表面血液，去除包膜;將左腎縱向?qū)Π肫书_，一半置于多聚甲醛中固定，待用于組織形態(tài)學(xué)和免疫組織化學(xué)光鏡檢查。

2.4 指標(biāo)檢測和方法

用生理鹽水清洗取出腎組織，濾紙吸去臟器表面液體，除去包膜在4%多聚甲醛中固定24 h，75%、85%、95%、100%乙醇梯度脫水12 h，50～60℃的蠟浸1～2 h，標(biāo)本包埋，制作成蠟塊，冷臺(tái)冷凍2 h后，LEICA-RM2235型超薄切片機(jī)切成5 μm厚度的薄片，按實(shí)驗(yàn)分組進(jìn)行編號(hào)，置于70℃烤片機(jī)中烤片2 h;切片脫臘至水:二甲苯Ⅰ、Ⅱ各15 min，無水乙醇Ⅰ、Ⅱ各5 min，95%、85%、70%乙醇各5 min;蒸餾水洗2 min，蘇木素(HE)染色10 min，自來水沖洗;1%鹽酸酒精分化1 min，自來水沖洗，0.5%氨水返藍(lán)30 min;自來水沖洗，伊紅染液5 min;70%、80%、90%、95%乙醇各3 min，無水乙醇Ⅰ、Ⅱ各5 min，二甲苯Ⅰ、Ⅱ各15 min，中性樹膠封固;光學(xué)顯微鏡下觀察腎臟的基本病理變化并拍照。

3 結(jié)果

腎組織光鏡病理形態(tài)學(xué)觀察，HE染色、腎組織細(xì)胞核在光鏡下呈現(xiàn)紫藍(lán)色，細(xì)胞漿、腎小球基底膜(GBM)和膠原纖維呈粉紅色。正常組可見正常腎小球，細(xì)胞未見明顯增大或萎縮，腎小球系膜區(qū)較窄，ECM與系膜細(xì)胞分布正常，毛細(xì)血管腔呈現(xiàn)開放狀態(tài)，紅細(xì)胞滿視野。模型組大鼠腎臟體積多數(shù)增大，光鏡下可見腎小球細(xì)胞增大明顯，GBM增厚，部分腎小球系膜細(xì)胞呈中度增生、系膜區(qū)增寬，部分腎小管出現(xiàn)上皮空泡變性，管腔內(nèi)可見蛋白樣物。經(jīng)干預(yù)治療后，各治療組大鼠上述病變均有不同程度改善;腎臟體積與模型組比較大多減小，但仍較正常組腎臟有所增大;光鏡下可見，腎小球細(xì)胞輕度增大，GBM輕度增厚、系膜區(qū)輕度增寬及腎小管空泡變等病變范圍，與模型組比較小且輕，未見腎小球硬化及腎間質(zhì)纖維化。治療組間未見明顯差異(見圖1)。每個(gè)樣本分別在腎臟皮質(zhì)與近髓質(zhì)區(qū)隨機(jī)取5個(gè)腎小球，觀察腎臟系膜細(xì)胞的增生情況。分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)參照鄭旭［2］等分級(jí)方法，將腎小球系膜增生分為0～Ⅲ級(jí)。0級(jí):正常腎小球系膜細(xì)胞;Ⅰ級(jí):系膜增生寬度小于毛細(xì)血管直徑，呈節(jié)段性分布;Ⅱ級(jí):系膜增生寬度大于毛細(xì)血管直徑，呈彌漫性分布;Ⅲ級(jí):系膜增生寬度呈團(tuán)塊狀聚集，彌漫指狀分布，擠壓血管腔。腎組織半定量分析結(jié)果顯示，經(jīng)YQJDHL中藥復(fù)方治療后的中藥實(shí)驗(yàn)組和陽性對(duì)照組分別與模型組比較，腎臟病理損傷均明顯減輕(P＜0.05);中藥實(shí)驗(yàn)組與陽性對(duì)照組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，說明實(shí)驗(yàn)大鼠注射STZ后，大鼠腎臟出現(xiàn)較明顯的病理損害，而給予YQJDHL中藥復(fù)方治療后，病理損害明顯減輕。

圖1 成模后4周末各組大鼠腎臟病理的變化(HE染色，光鏡×200)

4 討論

根據(jù)DN的病因病機(jī)及臨床表現(xiàn)，可將其歸屬于中醫(yī)“腎消”、“尿濁”、“腎勞”、“水腫”、“消渴”等范疇［3］。中醫(yī)理論認(rèn)為，DN的成因多是由于先天不足、后天失養(yǎng)。先天不足主要為腎精虧虛所致，后天失養(yǎng)多為飲食不節(jié)、情志失調(diào)、過勞過逸所致。中醫(yī)學(xué)對(duì)DN病機(jī)的認(rèn)識(shí)不一，但多數(shù)認(rèn)為DN乃本虛標(biāo)實(shí)之證。本虛多指氣血陰陽不足及五臟虧虛;標(biāo)實(shí)則指痰濕、濁毒、瘀血等病理產(chǎn)物堆積。李敬林教授結(jié)合其多年對(duì)DN的臨床研究，認(rèn)為早期DN患者乃脾腎虧虛、氣陰兩傷、痰濕濁毒、瘀血損傷腎絡(luò)所致，故治療以益氣解毒活絡(luò)立法，自擬YQJDHL中藥復(fù)方，臨床治療DN療效確切［4］。方中黃芪益氣固表、利尿托毒、排膿斂瘡生肌;黃精味甘、性平，益氣養(yǎng)陰、健脾益腎、潤心肺、強(qiáng)筋骨;黃連清熱燥濕、瀉火解毒;澤蘭活血、通經(jīng)、利尿，為治療消渴瘀阻水停之良藥;水蛭具有破血、逐瘀、通經(jīng)之功效。上述藥物巧妙組合，取其益氣補(bǔ)腎、健脾潤肺、清熱解毒、活血通絡(luò)之功，體現(xiàn)了中醫(yī)學(xué)對(duì)DN“扶正祛邪、標(biāo)本兼治”的治療大法。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，應(yīng)用具有益氣健脾、祛痰解毒、活血通絡(luò)作用的中藥復(fù)方能夠減輕腎臟肥大及腎小球系膜基質(zhì)增生、硬化，早期應(yīng)用作用尤為顯著，表明益氣解毒活絡(luò)中藥復(fù)方能夠預(yù)防和治療大鼠早期DN。本研究為臨床應(yīng)用益氣解毒活絡(luò)法防治DN提供了實(shí)驗(yàn)理論基礎(chǔ)。

［1］付曉，李敬林.中醫(yī)藥綜合治療早期DN臨床療效觀察類文獻(xiàn)質(zhì)量初步分析［J］.中國中醫(yī)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)雜志，2011，17(4): 409-410.

［2］鄭旭，羅杰，楊文英，等.一氧化氮在糖尿病腎病中的作用［J］.中華腎臟病雜志，1999，15(4):91-94.

［3］封翠云.DN的中醫(yī)病名探討［J］.國醫(yī)論壇，2007，22(2): 22.

［4］李敬林，王東.從“脾主運(yùn)化”論治消渴［J］.中國中醫(yī)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)雜志，2002，8(12):43-44.

Effect of Yiqi Jiedu activating effects of Chinese medicine compound on the structure of kidney in diabetic rats

FU Xiao1，LI Jing-lin2
(1.Acupuncture and Moxibustion Department of the First Affiliated Hospital of Liaoning Medical University，Jinzhou，Liaoning 121001，China;2.Geriatrics Affiliated Hospital of Liaoning University of TCM，Shenyang，Liaoning 110032，China)

Objective:To investigate the effects of Yiqi Jiedu activating Chinese herbal compound(YQJDHL)on structure of kidney of experimental diabetes mellitus(DM)rats.Methods:72 SPF healthy male SD rats，each treatment group were injected STZ causing diabetes and phlegm，stasis and poison in syndrome model.Application of YQJDHL after DN model taking shape and taking shape for 2 weeks，low and high dose groups of traditional Chinese medicine and western medicine group were fed Chinese herbal compound.The pathological changes of rat kidney was observed.Results: YQJDHL can relieve diabetic nephropathy(DN)in the rat glomerular hypertrophy，glomerular mesangial cell proliferation and renal tubular epithelial cavity，such as Chinese medicine prevention treatment group is superior to the traditional Chinese medicine treatment group.Conclusion:YQJDHL can prevent and treat early DN rats，the mechanism may be related to delay the renal pathological tissue damage.

Yiqi Jiedu Huoluo Chinese herbal compound;Diabetic nephropathy;Rat

R255.4

B

1006-3250(2015)01-0047-03

2014-09-19

國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(30973778);遼寧省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(2013022014)

付 曉(1974-)，女，錦州人，副主任醫(yī)師，副教授，醫(yī)學(xué)博士，從事中西醫(yī)結(jié)合防治糖尿病及其慢性并發(fā)癥的臨床與研究。