陶歡，高俊，柏銀蘭

第四軍醫(yī)大學(xué)a.藥學(xué)院；b.基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院微生物學(xué)教研室；陜西 西安 710032

基因水平轉(zhuǎn)移（horizontal gene transfer，HGT）是指細(xì)菌通過轉(zhuǎn)化、接合、轉(zhuǎn)導(dǎo)、溶原性轉(zhuǎn)換及轉(zhuǎn)座子等獲得非自身基因的過程[1]。細(xì)菌在進(jìn)化過程中，發(fā)展了一系列防御機(jī)制來抵御外源DNA 入侵，以維持自身基因結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定。1987 年，Ishino 等[2]在大腸桿菌K12 的堿性磷酸酶同工酶基因（isozyme-converting alkaline phosphatase，iap）上游序列中發(fā)現(xiàn)14個(gè)29 bp 的重復(fù)序列及32～33 bp 的非重復(fù)間隔序列。2000年，Mojica等[3]發(fā)現(xiàn)該結(jié)構(gòu)廣泛存在于細(xì)菌與古細(xì)菌基因組中，并具有一定的保守性。2002年，Jansen 等[4]將該重復(fù)序列命名為規(guī)律成簇的間隔短回文重復(fù)（clustered regularly interspaced short palindromic repeats，CRISPR），同時(shí)發(fā)現(xiàn)了4 個(gè)與CRISPR 重復(fù)序列功能相關(guān)的基因（CRISPR-associated，cas）。Barrangou 等[5]發(fā)現(xiàn)整合非自身基因的細(xì)菌具有免疫記憶，當(dāng)含有相似序列的噬菌體和質(zhì)粒DNA再次感染時(shí)，CRISPR-Cas系統(tǒng)可以限制噬菌體感染和質(zhì)粒的接合，從而抑制外源性DNA 進(jìn)入自身基因組，因此稱為細(xì)菌的獲得性免疫。此外，CRISPR-Cas 系統(tǒng)對細(xì)菌的毒力、耐藥性傳遞和生物膜形成等生理特性均有影響。

1 CRISPR-Cas系統(tǒng)概述

1.1 CRISPR-Cas系統(tǒng)組成

CRISPR-Cas 系統(tǒng)由重復(fù)序列（repeat）、前導(dǎo)序列（leader）和cas基因構(gòu)成。

CRISPR 結(jié)構(gòu)以連續(xù)相同的重復(fù)序列為主要特征，一般長24～47 bp。在重復(fù)序列間含有高度特異性的插入短序列，又稱間隔序列（spacer）。細(xì)菌獲得的新間隔序列若與入侵噬菌體某段序列相同，則細(xì)菌可以對該噬菌體起獲得性免疫作用[5]。

CRISPR 的5'端與第一個(gè)重復(fù)序列相連的一段富含AT 的序列被稱為前導(dǎo)序列。前導(dǎo)序列在細(xì)菌種內(nèi)相對保守，但存在種間差異[6]。前導(dǎo)序列為新的插入序列提供了識別位點(diǎn)，該識別位點(diǎn)為研究細(xì)菌的進(jìn)化提供了重要依據(jù)。

cas基因常出現(xiàn)在CRISPR 側(cè)翼區(qū)域，目前已發(fā)現(xiàn)多種cas基因，該基因在不同的細(xì)菌中差別較大。cas基因編碼CAS 蛋白，CAS 蛋白與核酸的重組和修復(fù)、新間隔序列的獲得、重復(fù)序列的維持等有關(guān)[6-7]。根據(jù)其保守程度，可將cas基因分為核心cas基因、亞型特異性cas基因和RAMP（repeat-associated mysterious proteins）組件基因。其中RAMP可編碼CAS蛋白超家族，該家族蛋白含有RNA 識別結(jié)構(gòu)域（RNA recognition motif，RRM），并含有富含甘氨酸的莖環(huán)結(jié)構(gòu)[7]，具有RNA 酶活性，與crRNA（CRISPR RNA）前體的轉(zhuǎn)錄及加工過程有關(guān)[8-10]。

1.2 CRISPR-Cas系統(tǒng)分類

2011 年，Makarova 等[11]將CRISPR-Cas 系統(tǒng)分為3 類，即TypeⅠ、Ⅱ、Ⅲ。典型的TypeⅠ系統(tǒng)均含有cas3基因，該基因在解旋酶及DNA 酶等作用下可編碼大量蛋白。TypeⅡ系統(tǒng)的基因相對保守，且僅存在于細(xì)菌中，而不存在于古細(xì)菌中，根據(jù)cas1、cas2和cas9基因的變異分為3 個(gè)亞型，即具有cas2附加基因的TypeⅡ-A 系統(tǒng)、具有cas4附加基因的TypeⅡ-B 系統(tǒng)和無附加基因的TypeⅡ-C 系統(tǒng)[11]，TypeⅡ系統(tǒng)的cas9基因可編碼大量蛋白質(zhì)，參與crRNA 的轉(zhuǎn)錄加工并裂解靶DNA。TypeⅢ系統(tǒng)編碼聚合酶和RAMP 分子，分為2 個(gè)亞型，即可識別靶DNA 序列的TypeⅢ-A系統(tǒng)和識別RNA的TypeⅢ-B系統(tǒng)。

1.3 CRISPR-Cas作用機(jī)制

CRISPR-Cas 系統(tǒng)使細(xì)菌對外源性DNA 的侵襲免疫，而不降解自身的基因。Jiang 等[12]發(fā)現(xiàn)當(dāng)細(xì)菌中轉(zhuǎn)入有益的傳遞基因時(shí)，CRISPR 基因功能會缺失，使細(xì)菌通過HGT 獲得某些新性狀；而當(dāng)轉(zhuǎn)入基因?qū)?xì)菌的生存構(gòu)成威脅時(shí)，CRISPR 的表達(dá)會發(fā)生上調(diào)。Marraffini 等[13]將CRIPSR 在細(xì)菌中的適應(yīng)性免疫作用稱為CRISPR 干擾，并將CRISPR 干擾分為3 個(gè)階段：首先，細(xì)菌從病毒、噬菌體的侵入基因或外源質(zhì)粒中特異性整合短序列，并將其插入基因組形成新的間隔序列，使細(xì)菌可以快速適應(yīng)環(huán)境中的入侵者，稱為CRISPR發(fā)揮功能的“適應(yīng)階段”；其次，新的間隔序列在CRISPR位點(diǎn)插入后，重復(fù)序列和插入序列可編碼出一條crRNA，使細(xì)菌進(jìn)入特異性的防御階段；最后，crRNA經(jīng)剪切加工后形成的小RNA與CAS 蛋白組成效應(yīng)復(fù)合物，通過堿基互補(bǔ)配對與再次入侵的目標(biāo)DNA 相結(jié)合，隨后CAS 蛋白對外源性靶DNA進(jìn)行斷裂和裂解。

2 CRISPR-Cas在細(xì)菌生理中的作用

2.1 CRISPR對細(xì)菌毒力的調(diào)節(jié)

CRISPR 可以使細(xì)菌對外源基因產(chǎn)生獲得性免疫，該過程中獲得的新間隔序列可能導(dǎo)致細(xì)菌毒力的改變。噬菌體感染是細(xì)菌獲得毒力和致病性的重要方式，如大腸桿菌、棒狀桿菌、肉毒梭菌、霍亂弧菌、鏈球菌和金黃色葡萄球菌均含有編碼毒力因子的溫和噬菌體基因[14]。而這些細(xì)菌的CRISPR 間隔序列與原噬菌體序列存在相互排斥，說明細(xì)菌中的CRISPR-Cas 系統(tǒng)可以通過抵御毒性噬菌體來干擾毒力因子在致病菌間的傳播。

腸出血性大腸桿菌（EHEC）的志賀毒素和黏附素分別由噬菌體基因stx和eae編碼，在stx和eae基因基礎(chǔ)上對CRISPR 多態(tài)性進(jìn)行分析，表明CRISPR的基因型與EHEC 種群的毒力相關(guān)，并且與O∶H 血清型分析相結(jié)合，可使EHEC的分型更確切[15]。在其他大腸桿菌菌株中，CRISPR 序列相對較短，在進(jìn)化中相對穩(wěn)定，主要起免疫保護(hù)和阻止抗藥性質(zhì)粒傳遞的作用，這一特點(diǎn)也有利于鑒定致病性大腸桿菌。

Nozawa 等[16]發(fā)現(xiàn)化膿性鏈球菌中的CRISPRCas系統(tǒng)使噬菌體毒力基因轉(zhuǎn)入，使這些菌株產(chǎn)生了致病性。對13 株化膿性鏈球菌基因組測序[17]，發(fā)現(xiàn)其中2 株CRISPR 位點(diǎn)的間隔序列與其他被測菌株存在差異，而5 株菌CRISPR-Cas 系統(tǒng)中的cas基因缺失。這些菌株均含有大量前噬菌體基因，且CRISPR結(jié)構(gòu)均為TypeⅡ-A CRISPR-Cas系統(tǒng)，噬菌體基因的高感染效率與其特殊的CRISPR-Cas系統(tǒng)相關(guān)。

CRISPR-Cas 系統(tǒng)可干擾細(xì)菌獲取毒力基因。Bikard等[18]對肺炎鏈球菌莢膜編碼基因的研究表明，CRISPR 干擾作用可使無莢膜的肺炎鏈球菌獲得編碼莢膜的毒力因子，而少數(shù)缺失CRISPR的肺炎鏈球菌則可被毒力菌株感染，接受莢膜基因，這表明CRISPR 干擾作用可以阻礙菌體獲得毒力。Van Schaik 等[19]對腸球菌CRISPR 結(jié)構(gòu)的研究表明，其cas1基因的缺失會導(dǎo)致致病島的增多?？漳c彎曲菌強(qiáng)毒株可造成嚴(yán)重的胃腸炎和感染后嚴(yán)重并發(fā)癥，分析發(fā)現(xiàn)其CRISPR 序列較短或完全缺失[20]，說明CRISPR的缺失導(dǎo)致細(xì)菌毒力增強(qiáng)。

大多數(shù)致病菌如化膿性鏈球菌、腦膜炎奈瑟菌、空腸彎曲菌等均含有TypeⅡCRISPR-Cas 系統(tǒng)[21-22]。通過對多種致病菌CRISPR 序列及毒力編碼基因的研究表明，TypeⅡCRISPR-Cas 系統(tǒng)中的cas9基因在細(xì)菌毒力調(diào)節(jié)過程中起至關(guān)重要的作用[11,23-24]。Louwen 等[1]研究表明，CRISPR-Cas 系統(tǒng)可以通過反義RNA 作用沉默具有免疫原性膜蛋白的表達(dá)，從而使細(xì)菌的毒力下降，且不同細(xì)菌介導(dǎo)該毒力調(diào)節(jié)作用所需的RNA 分子不同。cas9基因廣泛存在于各種宿主病原菌內(nèi)，提示TypeⅡCRISPR-Cas 系統(tǒng)在細(xì)菌的毒力調(diào)節(jié)中起到重要作用[24]。

2.2 CRISPR在細(xì)菌耐藥性傳遞中的作用

HGT 是決定細(xì)菌耐藥性傳遞的重要機(jī)制，如耐甲氧西林的金黃色葡萄球菌（MRSA）和耐萬古霉素的金黃色葡萄球菌（VRSA）的抗藥性基因均可通過質(zhì)粒的接合傳遞[5]。對強(qiáng)毒的MRSA USA300 菌株進(jìn)行序列分析表明，細(xì)菌CRISPR位點(diǎn)中的間隔序列是通過HGT獲得的，噬菌體或質(zhì)粒DNA 的基因序列整合到CRISPR位點(diǎn)，使細(xì)菌獲得新間隔序列而產(chǎn)生耐藥性[25]。此外，Kelli 等[26]研究發(fā)現(xiàn)多耐藥腸球菌均缺乏CRISPR-Cas 系統(tǒng)元件，表明細(xì)菌中的CRISPR-Cas系統(tǒng)在阻礙耐藥性傳遞中具有重要作用。

致病性的金黃色葡萄球菌和條件致病性的表皮葡萄球菌是最常見的院內(nèi)交叉感染菌株，其基因成分可以通過接合作用在不同種群間傳遞[27]。非致病的表皮葡萄球菌12228 株缺乏CRISPR 序列，而臨床分離的RP62a 株則含有CRISPR 序列。RP62a 的間隔序列（spc1）與所有已知葡萄球菌屬接合質(zhì)粒編碼核酸內(nèi)切酶的基因具有同源性序列[28-29]，為檢測spc1是否能阻止質(zhì)粒向RP62a 表皮葡萄球菌傳遞，Marraffini 等[27]將金黃色葡萄球菌耐β-內(nèi)酰胺質(zhì)粒pG0400 的9 個(gè)核苷酸內(nèi)切酶位點(diǎn)基因沉默，產(chǎn)生突變型pG0，然后將野生型及突變型pG0400（即pG0）轉(zhuǎn)入2 種表皮葡萄球菌，結(jié)果表明轉(zhuǎn)入無CRISPR 結(jié)構(gòu)的12228菌株中的2種質(zhì)粒的接合效率相近，但轉(zhuǎn)入含有CRISPR 序列的RP62a 菌株時(shí)只有突變型pG0轉(zhuǎn)入成功，且與對照組中12228菌株轉(zhuǎn)入野生型pG0400 的轉(zhuǎn)化效率相近。該結(jié)果表明，CRISPR 干擾可以限制耐藥性pG0400 質(zhì)粒通過接合作用從金黃色葡萄球菌轉(zhuǎn)移到表皮葡萄球菌，其特異性取決于間隔序列與質(zhì)粒序列的一致性，且該阻礙機(jī)制由靶DNA 直接介導(dǎo)，說明細(xì)菌中CRISPR 序列可通過阻礙HGT阻斷細(xì)菌耐藥性的傳遞。

2.3 CRISPR-Cas對細(xì)菌生物膜的影響

生物膜形成和群聚運(yùn)動是影響細(xì)菌致病性的重要因素。Zegans 等[30]發(fā)現(xiàn)噬菌體DMS3 感染銅綠假單胞菌產(chǎn)生的溶原性細(xì)菌無法形成完整的生物膜，并影響其群聚運(yùn)動能力，還發(fā)現(xiàn)其生物膜形成的抑制和群聚運(yùn)動能力喪失需要宿主體內(nèi)CRISPR 的存在，且cas基因的亞類，如PA14_33350（cas1）可編碼整合酶[30]，該整合酶可能參與新噬菌體DNA 序列整合入細(xì)菌CRISPR的過程，影響了細(xì)菌生物膜的形成及群居運(yùn)動等生理活性。CRISPR 介導(dǎo)的生物膜形成及群聚能力的改變，或許是限制細(xì)菌噬菌體在細(xì)菌間傳播的重要機(jī)制，即被噬菌體感染的細(xì)菌將自己從生物膜及其他群體行為中隔離，以減少大范圍感染細(xì)菌群體的幾率。Palmer 的研究表明[31]，TypeⅠ-F CRISPR特異性插入序列是抑制銅綠假單胞菌生物膜形成所必需的，推斷可能是該特異性插入序列轉(zhuǎn)錄形成反義RNA，沉默銅綠假單胞菌的生物膜形成基因，導(dǎo)致生物膜的形成受到抑制。因此，CRISPR-Cas系統(tǒng)可調(diào)節(jié)細(xì)菌生物膜形成。

2.4 CRISPR對細(xì)菌感染宿主的影響

研究表明，細(xì)菌中CRISPR-Cas系統(tǒng)與其感染宿主范圍具有內(nèi)在聯(lián)系。雞敗血支原體是一種可以感染多種禽類的細(xì)菌，其CRIPSR 結(jié)構(gòu)具有高度多樣性，菌株中均具有TypeⅡCRISPR-Cas 結(jié)構(gòu)，且其CRISPR 結(jié)構(gòu)不斷更新[32]。當(dāng)該細(xì)菌的宿主從家禽向飛禽轉(zhuǎn)換時(shí)，CRISPR 間隔序列的多樣性大量減少，并伴有TypeⅡcas基因缺失，且其CRISPR 序列的更新停滯，表明該細(xì)菌的CRISPR結(jié)構(gòu)可隨宿主的轉(zhuǎn)變發(fā)生突變，使細(xì)菌快速進(jìn)化以適應(yīng)新的宿主[32]。另外，F(xiàn)elizza 等[33]發(fā)現(xiàn)嗜肺軍團(tuán)菌具有TypeⅡCas2核酸酶，可以增強(qiáng)其對阿米巴宿主細(xì)胞的胞內(nèi)感染，而嗜肺軍團(tuán)菌對阿米巴的侵入對其在環(huán)境中的生存至關(guān)重要。弗朗西斯菌是一種胞內(nèi)寄生菌，可逃避宿主的免疫系統(tǒng)，在宿主細(xì)胞內(nèi)復(fù)制。該細(xì)菌被巨噬細(xì)胞吞噬后，吞噬體中的多種抗菌物質(zhì)及固有免疫反應(yīng)對其均具有殺傷作用，而該菌株CRISPR-Cas系統(tǒng)中的cas9、tracrRNA 等可作為調(diào)節(jié)因子，使其逃避宿主的抗菌作用，在宿主細(xì)胞中存活。對人上皮細(xì)胞模型的研究發(fā)現(xiàn)cas9是腦膜炎奈瑟菌吸附于宿主細(xì)胞表面并侵入宿主細(xì)胞進(jìn)行復(fù)制的關(guān)鍵[34]。另外，cas9基因的存在對空腸彎曲菌吸附入侵結(jié)腸上皮細(xì)胞也同樣重要[20]。說明TypeⅡCRISPR-Cas 系統(tǒng)在細(xì)菌感染宿主過程中發(fā)揮重要作用。

3 結(jié)語

CRISPR-Cas 系統(tǒng)的發(fā)現(xiàn)，更新了人們對細(xì)菌生理功能調(diào)節(jié)的認(rèn)識。利用CRISPR-Cas 系統(tǒng)控制基因在細(xì)菌間的水平轉(zhuǎn)移，應(yīng)用于細(xì)菌基因組編程，可獲得預(yù)期細(xì)菌的新表型，如生長增加、毒力更低、藥物敏感或耐受等，為科學(xué)研究提供了重要工具。通過分析CRISPR結(jié)構(gòu)中間隔序列的變異，建立了一種新的基因分型方法“間區(qū)序列寡核苷酸分型法”或“sp寡核苷酸分型法”，有利于細(xì)菌分型、流行病學(xué)研究及臨床細(xì)菌性疾病診斷[35]。CRISPR 可干擾耐藥性質(zhì)粒的接合作用，通過對其結(jié)構(gòu)的修飾將使限制耐藥菌株的傳播成為可能，為耐藥菌的控制提供了新的思路。此外，CRISPR-Cas9作為一種高效、簡便的基因組編程技術(shù)，已廣泛應(yīng)用于相關(guān)研究領(lǐng)域。隨著研究的深入，細(xì)菌CRISPR-Cas系統(tǒng)還將應(yīng)用于人類基因修復(fù)及疾病治療。

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