楊濤　李燕　李巖　劉俊江　孫福振　王剛

作者單位: 050051石家莊市，河北省人民醫(yī)院泌尿外科(楊濤、劉俊江、孫福振、王剛)，血液內(nèi)科(李燕)，體檢中心(李巖)

多色熒光原位雜交檢測(cè)尿沉渣診斷膀胱尿路上皮癌的可行性分析

楊濤李燕李巖劉俊江孫福振王剛

作者單位: 050051石家莊市，河北省人民醫(yī)院泌尿外科(楊濤、劉俊江、孫福振、王剛)，血液內(nèi)科(李燕)，體檢中心(李巖)

【摘要】目的研究分析多色熒光原位雜交檢測(cè)尿沉渣診斷膀胱尿路上皮癌的可行性。方法選取膀胱尿路上皮癌患者30例，納入對(duì)照組。選取30例正常人，納入觀察組。2組均進(jìn)行熒光原位雜交(fluorescence in situ hybridiza-tion，F(xiàn)ISH)檢測(cè)尿沉渣，統(tǒng)計(jì)并分析染色體畸變情況。結(jié)果觀察組與對(duì)照組3、7、17、9p21染色體畸變數(shù)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。3探針敏感性為36.67%，7探針敏感性為43.33%，17探針敏感性為40%，9p16探針敏感性為50%，4組合用探針敏感性為70%顯著高于單獨(dú)使用，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)論多色熒光原位雜交檢測(cè)尿沉渣診斷膀胱尿路上皮癌診斷療效顯著，值得臨床廣泛推廣及應(yīng)用。

【關(guān)鍵詞】多色熒光原位雜交檢測(cè);膀胱尿路上皮癌;診斷

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熒光原位雜交(fluorescence in situ hybridization，F(xiàn)ISH)在醫(yī)學(xué)臨床上廣泛應(yīng)用，其中以乳腺癌HER-2基因檢測(cè)最為廣泛指導(dǎo)其臨床治療。目前在實(shí)際的使用熒光原位雜交技術(shù)的過程中，也開始使用一種全新的方式，即使用本文中提到的多色熒光原位雜交技術(shù)，這種技術(shù)能夠更好的顯示出在實(shí)際的檢測(cè)過程中的多種顏色，并能夠減輕在實(shí)際的對(duì)惡性腫瘤在檢測(cè)的過程中出現(xiàn)的諸如顯示不清以及觀察無法達(dá)到相關(guān)要求的情況，對(duì)于患者而言有著極為重要的意義。本研究將FISH運(yùn)用于膀胱尿路上皮癌檢測(cè)尿沉渣來進(jìn)行診斷，體現(xiàn)3、7、17、9p21染色體畸變?cè)谠\斷檢測(cè)膀胱尿路上皮癌的臨床價(jià)值。報(bào)告如下。

1　資料與方法

1.1一般資料選取我院2011年8月至2013年8月收治的膀胱尿路上皮癌患者30例為對(duì)照組。男18例，女12例;年齡37～68歲，平均年齡(52±6)歲;所有患者均確診為膀胱尿路上皮癌。觀察組30例，男16例，女14例;年齡39～70歲，平均年齡(54±6)歲。2組患者年齡、性別比等一般資料比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)具可比性。

1.2方法

1.2.1對(duì)2組均采取膀胱尿路上皮癌進(jìn)行檢測(cè)。取2組患者晨尿200 ml檢測(cè)。

1.2.2多色熒光原位雜交檢測(cè)。首先注意對(duì)特異性探針進(jìn)行相應(yīng)的處理。探針由北京金菩嘉公司贊助的膀胱癌診斷試劑盒，在這種試劑盒中，主要是含有CSP3/CSP7以及GLP17/GSP17兩組一套的雙色探針設(shè)備，在這種探針使用的的過程中，探針往往能夠定位3p11.1～q11.1以及7p11.1～q11.1，同時(shí)在對(duì)應(yīng)的熒光信號(hào)方面，能夠?qū)?yīng)紅色以及綠色的熒光信號(hào)。對(duì)于GPL p16/CSP 17的探針組，能夠定位9p21以及17p11.1～q11.1，同時(shí)對(duì)于于GPL p16/CSP 17的探針組，在對(duì)應(yīng)的熒光信號(hào)方面能夠?qū)?yīng)紅色以及綠色的信號(hào)。在對(duì)特異性的探針在選擇完成以及進(jìn)行相關(guān)的處理完成后，需要注意對(duì)于主要的相關(guān)使用溶液進(jìn)行配置。本研究中的緩沖液的配置，使用88 g氯化鈉44 g檸檬酸鈉以及400 ml的去離子水進(jìn)行配置，在實(shí)際的配置過程中，將所有的物質(zhì)進(jìn)行充分的溶解，要在常溫下進(jìn)行pH值的調(diào)節(jié)，使用鹽酸將pH值調(diào)整在5.3左右，同時(shí)使用離子水進(jìn)行定容，容量為500 ml同時(shí)注意在2～8℃的環(huán)境下進(jìn)行儲(chǔ)存，也需要注意保質(zhì)期，一般在配置完成后6個(gè)月后需要丟棄，在此過程

情況，立即將試劑室溫下將10 mol/L值調(diào)整在7.0左液進(jìn)行定容，定容至的環(huán)境下進(jìn)行相應(yīng)需要注意對(duì)其進(jìn)行了渾濁或是污染等溶液的配置方面，需要注意選擇70%以及85%的乙醇，在實(shí)際的乙醇溶液的配置過程中，注意將700 ml以及850 ml的無水乙醇，通過使用去離子水對(duì)于無水乙醇進(jìn)行稀釋，分別將無水乙醇稀釋到1l，同時(shí)需要注意在無水乙醇的使用過程中，將乙醇放置在2～8℃的環(huán)境下進(jìn)行儲(chǔ)存以及使用，在配置完成后的1個(gè)月后或使用20張的玻片進(jìn)行雜交完成后立即丟棄，試劑在此過程中，出現(xiàn)實(shí)際的污染或渾濁的情況，立即丟棄。玻片處理:用RNase (Sigma，0.1 g/L)和Pepsin(Sigma，0.1 g/L)先后處理，10 g/L多聚甲醛固定15 min，PBS緩沖液洗滌后，玻片在700 ml/L甲酰胺/2×SSC(pH值7.0)，72℃變性3 min，2×SSC 4℃3 min洗滌2次，梯度乙醇脫水，室溫晾干。探針處理:按照探針2 μl、ssDNA 2 μl (或Cot-1 DNA 2 μl)、H2O 46 μl、3 mol/L NaAc 5 μl、100%乙醇(－20℃) 110μl配成沉淀體系，置－80℃30 min，12 000 r/min離心10 min，去上清加75%乙醇洗滌，再離心去上清，避光自然晾干，加著絲粒(或BAC)探針雜交液8μl，室溫避光溶解30min以上，75℃水浴變性7 min，37℃水浴預(yù)復(fù)性30min。雜交:將探針加到玻片的標(biāo)本上，覆蓋玻片，Rubber Cement封片后置濕盒37℃溫箱中避光雜交48 h。洗片:除去蓋玻片，將玻片放入500ml/L甲酰胺/2×SSC溶液，42℃洗滌15 min，2×SSC室溫?fù)u洗3 min×2次，梯度乙醇脫水，室溫暗處晾干，加20 μl二氨基苯基吲哚(DAPI，Vysis公司)復(fù)染，封片。

1.3信號(hào)檢測(cè)在熒光顯微鏡下觀察圖像，單體標(biāo)準(zhǔn):單個(gè)信號(hào)的核比例＞15%。三體及以上標(biāo)準(zhǔn):三個(gè)及以上信號(hào)的核＞10%細(xì)胞總數(shù)。組合探針標(biāo)準(zhǔn):至少4個(gè)細(xì)胞中有兩個(gè)染色體擴(kuò)增同時(shí)存在3、7、17中或至少在12個(gè)細(xì)胞中存在9p21純合性缺失。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)分析應(yīng)用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料以±s表示，采用t檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料采用χ2比較，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.12組患者3、7、17、9p21四種探針診斷結(jié)果比較觀察組與對(duì)照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜ 0.05)。見表1，圖1、2。

表1　2組患者3、7、17、9p21四種探針檢測(cè)結(jié)果比較n=30，±s

表1　2組患者3、7、17、9p21四種探針檢測(cè)結(jié)果比較n=30，±s

組別37917觀察組8.56±1.86　8.13±1.47　4.19±1.89　7.11±1.98對(duì)照組　14.33±4.96　11.23±4.22　10.36±4.61　11.56±5.33 t值5.9660　3.7996　6.7577　4.2867 P值0.0000　0.0003　0.0000　0.0001

圖2　17號(hào)染色體(綠色熒光)顯示異常增多核型

圖1　17號(hào)染色體(綠色熒光)異常增多核型; 9p21(紅色熒光)為單倍體，異常缺失

2.23、7、17、9p21四種探針診斷膀胱尿路上皮癌情況4種組合使用療效較單獨(dú)使用差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表2。

表2　3、7、17、9p21及四種聯(lián)合診斷膀胱尿路上皮癌情況n=30，例(%)

3　討論

膀胱尿路上皮癌在泌尿系統(tǒng)較為多見的腫瘤［1］，也是一種常見的泌尿系統(tǒng)惡性腫瘤。在我國(guó)的一項(xiàng)登記檢查中發(fā)現(xiàn)，膀胱癌的發(fā)病幾率已經(jīng)達(dá)到了6.61/10萬，約為惡性腫瘤發(fā)病的第9位。膀胱癌可發(fā)于任何年齡，甚至有兒童也會(huì)出現(xiàn)膀胱癌的相關(guān)癥狀，其發(fā)病率會(huì)隨著年齡的增長(zhǎng)而增加，高發(fā)年齡在50～70歲，同時(shí)男性膀胱癌的發(fā)病率約為女性膀胱癌發(fā)病率的4倍左右。在1998年，國(guó)際泌尿病理學(xué)會(huì)以及國(guó)際衛(wèi)生組織(WHO)建議使用尿路上皮一詞代替移行細(xì)胞一詞，通過這種方式能夠較好的對(duì)患者辯別鼻腔以及卵巢內(nèi)部的移行上皮，并通過這種方式，能夠使得尿路上皮成為了一種尿路系統(tǒng)的專有名詞。在2004年，國(guó)際衛(wèi)生組織又發(fā)布了《泌尿系統(tǒng)及男性生殖器官腫瘤病理學(xué)和遺傳學(xué)》。通過這種形式，能夠?qū)⒒颊吣蚵废到y(tǒng)腫瘤組織學(xué)分類過程中的膀胱癌的病理類型，其中包括膀胱尿路上皮癌、膀胱腺癌、膀胱鱗狀細(xì)胞癌，同時(shí)還有膀胱透明細(xì)胞癌以及膀胱小細(xì)胞癌和膀胱類癌等，其中最為常見的就是膀胱尿路上皮癌，目前約占所有膀胱癌患者總數(shù)的90%左右，通常所說的膀胱癌大部分就指的是膀胱尿路上皮癌，在以往被稱為膀胱移行細(xì)胞癌。臨床上采取膀胱鏡檢查及尿細(xì)胞學(xué)，膀胱鏡檢查屬有創(chuàng)性檢查對(duì)患者影響較大［2～3］。尿細(xì)胞雖屬無創(chuàng)但靈敏度較差。目前多色熒光原位雜交檢測(cè)在臨床上得到認(rèn)可，能填補(bǔ)上述檢測(cè)缺陷，具備特異性強(qiáng)能直接在染色體上定量標(biāo)記及定性、屬無創(chuàng)檢查、敏感度較高，操作簡(jiǎn)單、穩(wěn)定、重復(fù)性好等優(yōu)點(diǎn)［4］。據(jù)研究顯示，多色熒光原位雜交檢測(cè)診斷膀胱尿路上皮癌特異性為86%～97%，敏感度為59%～86%［5］。尿路上皮癌患者9p21均缺失，是早期診斷的重要標(biāo)志，3號(hào)染色體畸變達(dá)76%，17號(hào)畸變達(dá)51%，7號(hào)畸變達(dá)38%［6］。本研究我院30例患者采取FISH診斷敏感性高達(dá)80%，與研究相符。采用FISH檢測(cè)患者與正常人比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。在FISH檢測(cè)中發(fā)現(xiàn)，4種探針組合使用70%顯著高于3、7、9、17單獨(dú)探針，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

對(duì)于多色熒光原位雜交檢測(cè)技術(shù)而言，是一種目前較為常用的物理圖譜繪制的相關(guān)方法，在實(shí)際的繪制過程中，需要使用熒光素對(duì)探針進(jìn)行相應(yīng)的標(biāo)記，并在標(biāo)記完成后需要檢測(cè)探針以及分裂中期染色體或是在分裂間期的染色體雜交的情況［7］。這種方法主要是上個(gè)世紀(jì)80年代在放射性原位雜交技術(shù)的基礎(chǔ)上開發(fā)出的一種非放射性分子細(xì)胞的相關(guān)遺傳技術(shù)，通過使用熒光標(biāo)記的方式，能夠較好的對(duì)同位素標(biāo)記進(jìn)行相應(yīng)的代替，并在代替后能夠成為一種全新的原位雜交方法。在實(shí)際的使用過程中，首先能夠和某一種介導(dǎo)分子進(jìn)行結(jié)合，在結(jié)合完成后能夠通過雜交等形式再通過免疫細(xì)胞化學(xué)的相關(guān)過程中，和熒光染料進(jìn)行連接。在此過程中，主要是需要使用DNA探針對(duì)于特殊的核苷酸分子進(jìn)行相應(yīng)的標(biāo)記，在標(biāo)記完成后可以使用探針直接的雜交到染色體或是DNA的纖維切片上，并需要使用熒光素分子偶聯(lián)的單克隆抗體和探針分子的特異性結(jié)合，通過這種形式能夠較好的檢測(cè)出DNA相關(guān)的序列在DNA的纖維切片或是在染色體上的定位以及相對(duì)的定量分析［8］。在實(shí)際的使用熒光原位雜交的過沉重，在實(shí)際的檢測(cè)過程中往往具有快速、安全、靈敏以及能夠顯示多種顏色等特點(diǎn)，不僅是在顯示的過程中能夠?qū)τ陲@示中期的分裂相進(jìn)行相應(yīng)的顯示，同時(shí)也能夠顯示出間期核［9］。目前在實(shí)際的使用熒光原位雜交技術(shù)的過程中，也開始使用一種全新的方式，即使用本文中提到的多色熒光原位雜交技術(shù)，這種技術(shù)能夠更好的顯示出在實(shí)際的檢測(cè)過程中的多種顏色，并能夠減輕在實(shí)際的對(duì)惡性腫瘤在檢測(cè)的過程中出現(xiàn)的諸如顯示不清以及觀察無法達(dá)到相關(guān)要求的情況，對(duì)于患者而言有著極為重要的意義［10］。尤其是對(duì)膀胱尿路上皮癌患者而言，在臨床進(jìn)行檢測(cè)的過程中，往往會(huì)由于其特點(diǎn)無法使用CT MRI或X線平片技術(shù)對(duì)患者的病灶進(jìn)行相應(yīng)的觀察因此對(duì)于膀胱尿路上皮癌患者在檢測(cè)的過程中通過使用多色熒光原位雜交技術(shù)技術(shù)，能夠及時(shí)有效的對(duì)膀胱尿路上皮癌患者進(jìn)行檢測(cè)，對(duì)于患者的技術(shù)有效治療以及制定治療方案而言有著極為重要的意義，同時(shí)在實(shí)際的對(duì)膀胱尿路上皮癌在檢測(cè)過程中也會(huì)具有安全、快速、靈敏度高、探針能長(zhǎng)期保存、能同時(shí)顯示多種顏色等優(yōu)點(diǎn)，在臨床上也值得推廣應(yīng)用［11］。

本研究發(fā)現(xiàn)觀察組與對(duì)照組3、7、17、9p21染色體畸變數(shù)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。3探針敏感性為36.67%，7探針敏感性為43.33%，17探針敏感性為40%，9p16探針敏感性為50%，4組合用探針敏感性為70%顯著高于單獨(dú)使用，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P 0.05)，這種情況說明在臨床對(duì)膀胱尿路上皮癌患者在進(jìn)行檢測(cè)的過程中，使用多色熒光原位雜交檢測(cè)技術(shù)是切實(shí)有效的，能夠在臨床對(duì)膀胱尿路上皮癌患者進(jìn)行及時(shí)有效的診斷［12］。同時(shí)在此過程中，需要注意進(jìn)行閾值的建立。在實(shí)際的閾值建立的過程中，需要對(duì)于正常人的尿液進(jìn)行FISH的檢驗(yàn)，同時(shí)也需要注意每一個(gè)探針組合需要對(duì)于100各信號(hào)較為清晰的細(xì)胞，同時(shí)在此過程中，需要注意對(duì)于2號(hào)、7號(hào)以及1號(hào)的染色體進(jìn)行閾值的建立，在實(shí)際的建立過程中，需要注意建立起3個(gè)或3個(gè)以上的閾值。而對(duì)于PL6而言，需要建立起2個(gè)閾值，并需要愛此過程中將異常信號(hào)細(xì)胞數(shù)字的百分比進(jìn)行相應(yīng)的統(tǒng)計(jì)，使用相關(guān)的閾值計(jì)算公式對(duì)于閾值進(jìn)行相應(yīng)的計(jì)算。同時(shí)對(duì)于形態(tài)異常的脫落細(xì)胞進(jìn)行分析的過程中，需要注意，每一組的探針組合應(yīng)該對(duì)至少25個(gè)細(xì)胞進(jìn)行相應(yīng)的分析，若在此過程中無法較好的對(duì)于結(jié)果進(jìn)行相應(yīng)的確定，可以在實(shí)際的對(duì)于異常脫落細(xì)胞進(jìn)行分析的過程中，可以對(duì)于分析細(xì)胞的數(shù)量進(jìn)行增加，同時(shí)在此過程中，細(xì)胞的增加數(shù)量并沒有上限。在對(duì)FISH進(jìn)行測(cè)定的過程中，需要注意兩個(gè)指標(biāo)陽(yáng)性就能夠確定FISH為陽(yáng)性。同時(shí)對(duì)于一個(gè)指標(biāo)出現(xiàn)了復(fù)雜異常的情況，若出現(xiàn)了一個(gè)指標(biāo)出現(xiàn)了復(fù)雜異常的情況則表示每一種的異常信號(hào)模式細(xì)胞的數(shù)量高于4。

綜上所述，多色熒光原位雜交檢測(cè)尿沉渣診斷膀胱尿路上皮癌診斷療效顯著，具備特異性強(qiáng)能直接在染色體上定量標(biāo)記及定性、屬無創(chuàng)檢查、敏感度較高操作簡(jiǎn)單、穩(wěn)定、重復(fù)性好值得臨床廣泛推廣及應(yīng)用。

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(收稿日期:2014－12－20

通訊作者:劉俊江，050051河北省人民醫(yī)院泌尿外科;

doi:10.3969/j.issn.1002－7386.2015.09.011

【文章編號(hào)】1002－7386(2015) 09－1319－04

【文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼】A

【中圖分類號(hào)】R 694