倪少濱，劉 迪，趙忠山， 麻 立， 焦治興

(哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院泌尿外科，黑龍江哈爾濱 150001)

·基礎(chǔ)研究·

不同來源前列腺基質(zhì)細(xì)胞對前列腺癌細(xì)胞IGF-1和p-AKT表達(dá)的影響

倪少濱，劉 迪，趙忠山， 麻 立， 焦治興

(哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院泌尿外科，黑龍江哈爾濱 150001)

目的 探討胰島素樣生長因子在前列腺癌腫瘤-基質(zhì)交互作用中的地位及其作用機(jī)制。方法 將前列腺癌旁基質(zhì)細(xì)胞和良性前列腺基質(zhì)細(xì)胞分別與前列腺癌細(xì)胞系PC-3細(xì)胞分隔共培養(yǎng)(并設(shè)空白對照)，之后檢測前列腺癌細(xì)胞中IGF-1 mRNA (半定量RT-PCR)和p-AKT蛋白表達(dá)(Western blot)。結(jié)果 與空白對照組相比較，癌旁基質(zhì)細(xì)胞共培養(yǎng)組IGF-1 mRNA表達(dá)有所上調(diào)、p-AKT蛋白表達(dá)有所上調(diào)，但無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；良性基質(zhì)細(xì)胞共培養(yǎng)組IGF-1 mRNA和p-AKT蛋白表達(dá)顯著下調(diào)(P<0.05)。相關(guān)性分析顯示各組前列腺癌細(xì)胞IGF-1 mRNA與p-AKT蛋白表達(dá)呈正相關(guān)。結(jié)論 良性前列腺基質(zhì)細(xì)胞通過水溶性因子抑制前列腺癌細(xì)胞中IGF-1及其下游因子表達(dá)，前列腺癌旁基質(zhì)細(xì)胞則喪失了該抑制作用。

前列腺癌；胰島素樣生長因子；基質(zhì)細(xì)胞

前列腺癌為歐美男性發(fā)病率最高的惡性腫瘤，在我國發(fā)病也逐年上升。近年來的研究成果顯示細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)異常在腫瘤發(fā)生中有重要地位，該系統(tǒng)作為腫瘤治療靶點(diǎn)的潛力也日趨明朗。針對細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)的藥物，也成為了當(dāng)前抗腫瘤藥物開發(fā)的重要方向。為了明確胰島素樣生長因子(insulin-like growth factor，IGF)在前列腺癌腫瘤-基質(zhì)交互作用的地位及其作用機(jī)制，我們檢測了前列腺癌腫瘤-基質(zhì)共培養(yǎng)條件下PC-3前列腺癌細(xì)胞中IGF-1及其下游癌相關(guān)基因表達(dá)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞 前列腺癌細(xì)胞：非雄激素依賴性前列腺癌細(xì)胞系PC-3。前列腺基質(zhì)細(xì)胞：前列腺癌基質(zhì)細(xì)胞分離自前列腺癌根治手術(shù)標(biāo)本；良性前列腺基質(zhì)細(xì)胞分離自膀胱癌根治手術(shù)標(biāo)本。

1.1.2 主要試劑和材料 RPMI 1640 培養(yǎng)基(Gibco)、小牛血清(Gibco)、WAJC 培養(yǎng)基(Gibco)、插入杯(Sigma)、RT-PCR試劑盒(Promab)、引物(上海生工)、Western blotting 試劑盒(PIERCE)、兔抗人多克隆抗體p-AKT(CST)、羊抗兔HRP-conjugated(PIRECE)。

1.2 方法

1.2.1 前列腺基質(zhì)細(xì)胞原代培養(yǎng) 取手術(shù)切除正常前列腺/前列腺癌組織標(biāo)本，Ⅰ型膠原酶消化，得基質(zhì)細(xì)胞置入含5%小牛血清(體積分?jǐn)?shù))的RPMI1640培養(yǎng)液，4℃保存，病理證實(shí)后繼續(xù)培養(yǎng)。

1.2.2 上皮/基質(zhì)細(xì)胞共培養(yǎng) 取PC-3細(xì)胞和單獨(dú)培養(yǎng)14d后的原代間質(zhì)細(xì)胞，消化脫壁，用上皮/間質(zhì)細(xì)胞混合培養(yǎng)液(等容積混合)重懸并計數(shù)后，上皮細(xì)胞以20×103個細(xì)胞/孔接種至6孔板；間質(zhì)細(xì)胞以4×103個細(xì)胞/ 孔接種至插入杯。2 h培養(yǎng)使細(xì)胞充分沉降后，將含有間質(zhì)細(xì)胞的插入杯移到培養(yǎng)孔內(nèi)進(jìn)行共培養(yǎng)，設(shè)置插入杯內(nèi)沒有細(xì)胞而其他條件完全相同的培養(yǎng)板為共培養(yǎng)空白對照組，每組8孔，每3 d 換液1次，共培養(yǎng)12 d。

1.2.3 半定量RT-PCR檢測IGF-1 mRNA表達(dá) mRNA引物設(shè)計如表1。操作過程及其他參數(shù)略。

表1 mRNA引物序列設(shè)計

目的基因片段長度(bp)引物序列IGF-1171上游:5-GATCTAAGGAGGCTGGAGAT-3;下游:5-AGGGTCTTCCTACATCCTGT-3 GAPDH450上游:5-ACCACAGTCCATGCCATCAC-3;下游:5-TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3

1.2.4 Western blot檢測p-AKT蛋白表達(dá) 孔板中的貼壁細(xì)胞PBS洗滌后轉(zhuǎn)移到EP管，離心棄上清，加入細(xì)胞裂解液裂解后取上清-20℃儲存。上樣，80 V電泳積聚蛋白，100 V分離蛋白并轉(zhuǎn)膜，TBS-T封閉1 h。加一抗4℃孵育過夜后，洗膜5 min×3次，在加二抗室溫下孵育1 h，洗膜5 min×3次，加入ECL化學(xué)發(fā)光顯示劑在室溫下反應(yīng)1 min后，X光片曝光、定影、顯影。選擇β-actin作內(nèi)參照。

1.2.5 統(tǒng)計學(xué)分析 所有數(shù)據(jù)經(jīng)SPSS 10.0統(tǒng)計軟件處理。組間比較采用方差分析、Dunnet’t檢驗，相關(guān)性檢驗采用直線相關(guān)分析。P<0.05為差異有顯著性意義。

2 結(jié) 果

2.1 前列腺基質(zhì)細(xì)胞原代培養(yǎng)顯微鏡下觀察，約于培養(yǎng)開始72 h后始有細(xì)胞貼壁，20～24 d達(dá)到80%～85%融合，需要傳代。此時平滑肌細(xì)胞呈典型長梭狀，核/漿比例較大，細(xì)胞堆積呈“峰與谷”特征。傳代后生長速度稍加快，約每12 d傳代1次。

2.2 IGF-1 mRNA表達(dá)檢測用凝膠圖像分析儀分析電泳結(jié)果，各組IGF-1 mRNA表達(dá)比值(IGF-1/GAPDH)見表2。統(tǒng)計學(xué)分析顯示，與空白對照組相比較，癌旁基質(zhì)細(xì)胞共培養(yǎng)組IGF-1 mRNA表達(dá)有所上調(diào)，但無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；正?；|(zhì)細(xì)胞共培養(yǎng)組IGF-1 mRNA表達(dá)顯著下調(diào)(P<0.05)。

2.3 p-AKT蛋白表達(dá)實(shí)驗結(jié)果見圖1。利用Quantity One軟件分析，各組p-AKT與內(nèi)參照β-actin的比值見表2。統(tǒng)計學(xué)分析顯示，與空白對照組相比較，癌旁基質(zhì)細(xì)胞共培養(yǎng)組p-AKT蛋白表達(dá)有所上調(diào)，但無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；正?；|(zhì)細(xì)胞共培養(yǎng)組p-AKT蛋白表達(dá)顯著下調(diào)(P<0.05)。

表2 PC-3細(xì)胞中IGF-1 mRNA和p-AKT蛋白表達(dá)

組別nIGF-1表達(dá)比值p-AKT比值空白對照組80.513±0.0340.692±0.081良性基質(zhì)細(xì)胞共培養(yǎng)組80.322±0.0510.557±0.079癌旁基質(zhì)細(xì)胞共培養(yǎng)組80.581±0.0210.707±0.066

圖1 Western blot檢測p-AKT蛋白表達(dá)

A: 空白對照組；B：癌旁基質(zhì)細(xì)胞共培養(yǎng)組；C：正?；|(zhì)細(xì)胞共培養(yǎng)組。

3 討 論

前列腺癌正成為我國發(fā)病率最高的泌尿系統(tǒng)腫瘤之一。現(xiàn)階段，早期發(fā)現(xiàn)的前列腺癌可以進(jìn)行根治性切除，中晚期前列腺癌通常進(jìn)行以雄激素阻斷為主的內(nèi)分泌治療，而進(jìn)展至激素難治性階段后，就很難找到有效的治療方法。所以，醫(yī)學(xué)界迫切地需要進(jìn)一步明確前列腺癌發(fā)生和發(fā)展的機(jī)制，找到新的有效的治療靶點(diǎn)。

腫瘤-基質(zhì)交互作用在前列腺癌的基礎(chǔ)研究中早已受到重視，而對于基質(zhì)細(xì)胞影響腫瘤細(xì)胞的作用途徑則尚無定論。JIANG等[1]發(fā)現(xiàn)分離自外周帶的前列腺基質(zhì)細(xì)胞對PC-3細(xì)胞的誘導(dǎo)增殖作用更強(qiáng)，這一作用是通過被性激素調(diào)節(jié)的生長因子達(dá)成的。還有其他研究證明前列腺基質(zhì)細(xì)胞在前列腺癌的發(fā)生和發(fā)展中的作用，而生長因子在這一作用過程中占有重要位置[2-3]。

在與前列腺癌相關(guān)的諸多生長因子中，IGF是前列腺癌的研究中的熱點(diǎn)[4-6]。NORDSTRAND 等[7]發(fā)現(xiàn)IGF-1阻斷對于前列腺癌骨轉(zhuǎn)移具有強(qiáng)烈的誘導(dǎo)凋亡的作用。本研究在應(yīng)用分隔共培養(yǎng)方式探討前列腺癌腫瘤-基質(zhì)交互作用機(jī)制的過程中發(fā)現(xiàn)，良性的前列腺基質(zhì)細(xì)胞可以明顯抑制PC-3細(xì)胞中IGF-1 mRNA和p-AKT蛋白的表達(dá)，且對以上兩者的抑制作用有明確的相關(guān)性。鑒于在分隔共培養(yǎng)系統(tǒng)中腫瘤、間質(zhì)細(xì)胞間無直接接觸，我們可以認(rèn)為良性前列腺基質(zhì)細(xì)胞對于PC-3細(xì)胞的作用是通過水溶性因子達(dá)成的。這種抑制作用在前列腺癌相關(guān)基質(zhì)細(xì)胞與PC-3細(xì)胞之間則未觀察到。由此結(jié)果我們可以認(rèn)為，正常的前列腺基質(zhì)細(xì)胞通過水溶性因子途徑對于前列腺癌細(xì)胞的部分生長因子及下游介質(zhì)表達(dá)有抑制作用，而前列腺癌相關(guān)基質(zhì)細(xì)胞則失去了這種抑制能力。該作用的具體作用途徑和介質(zhì)有待進(jìn)一步研究確認(rèn)。

綜上所述，本研究的結(jié)果提示，良性前列腺基質(zhì)細(xì)胞可以通過水溶性因子對PC-3前列腺癌細(xì)胞中IGF-1 mRNA和p-AKT蛋白的表達(dá)發(fā)揮明確的抑制作用，而前列腺癌相關(guān)基質(zhì)細(xì)胞則不具備這種抑制能力。這驗證了前列腺癌的發(fā)生和發(fā)展與基質(zhì)細(xì)胞關(guān)系密切的觀點(diǎn)。

[1] JIANG Q, HAN BM, ZHAO FJ, et al. The differential effects of prostate stromal cells derived from different zones on prostate cancer epithelial cells under the action of sex hormones [J]. Asian J Androl, 2011, 13(6): 798-805.

[2] KAWADA M, INOUE H, ARAKAWA M, et al. Transforming growth factor-beta1 modulates tumor-stromal cell interactions of prostate cancer through insulin-like growth factor-I [J]. Anticancer Res, 2008, 28(2A):721-730.

[3] KAWADA M, INOUE H, OHBA S, et al. Leucinostatin A inhibits prostate cancer growth through reduction of insulin-like growth factor-I expression in prostate stromal cells [J]. Int J Cancer, 2010,15; 126(4):810-818.

[4] KAWADA M, INOUE H, MASUDA T, et al. Insulin-like growth factor I secreted from prostate stromal cells mediates tumor-stromal cell interactions of prostate cancer [J]. Cancer Res, 2006, 15; 66(8):4419-4425.

[5] KAPLAN-LEFKO PJ, SUTHERLAND BW, EVANGELOU AI, et al. Enforced epithelial expression of IGF-1 causes hyperplastic prostate growth while negative selection is requisite for spontaneous metastogenesis [J]. Oncogene, 2008, 1; 27(20): 2868-2876.

[6] BANUDEVI S, SENTHILKUMAR K, SHARMILA G, et al. Effect of zinc on regulation of insulin-like growth factor signaling in human androgen-independent prostate cancer cells [J]. Clin Chim Acta, 2010, 411(3-4): 172-178.

[7] NORDSTRAND A, LUNDHOLM M, LARSSON A, et al. Inhibition of the insulin-like growth factor-1 receptor enhances effects of simvastatin on prostate cancer cells in co-culture with bone [J]. Cancer Microenviron, 2013, 6(3):231-240.

(編輯 何宏靈)

Stromal cells from different sources influence the expression of IGF-1 and p-AKT in prostate cancer cells

NI Shao-bin, LIU Di, ZHAO Zhong-shan, MA Li, JIAO Zhi-xing

(Department of Urology, the First Affiliated Hospital of Harbin Medical University, Harbin 150001, China)

Objective To explore the role of insulin-like growth factor (IGF) in tumor-stromal cell interactions of prostate cancer. Methods PC-3 cells were seeded in TRANSWELL plate and interacted with different effector cells including benign and cancer-associated prostate stromal cells. Semi-quantitative RT-PCR was used to detect the expression of IGF-1 mRNA; Western blot was used to detect the expression of p-AKT. Results Compared with the control group, the expression of IGF-1 mRNA and p-AKT in PC-3 cells cocultured with benign prostate stromal cells were decreased (P<0.05), while there were no significant changes in the expression of IGF-1 mRNA and p-AKT in PC-3 cells cocultured with cancer-associated prostate stromal cells. The expression of IGF-1 mRNA was positively correlated with the expression of p-AKT (r=0.723,P<0.05). Conclusion Benign prostate stromal cells can suppress the expression of IGF-1 mRNA and its downstream protein factor in PC-3 cells, while cancer-associated prostate stromal cells do not have this effect.

prostate cancer; insulin-like growth factor; stromal cells

2014-09-29

2014-10-29

黑龍江省自然科學(xué)基金(No. D201080)

倪少濱(1960-)，男(漢族)，主任醫(yī)師，教授.E-mail：nsb1960@aliyun.com

R697.3

A

10.3969/j.issn.1009-8291.2015-01-014