李 楊，明海霞，耿廣琴

(甘肅中醫(yī)學(xué)院，甘肅 蘭州 730000)

·實(shí)驗(yàn)研究·

單葉細(xì)辛對(duì)寒飲射肺證模型大鼠TNF-α及IL-8表達(dá)的影響*

李 楊，明海霞，耿廣琴

(甘肅中醫(yī)學(xué)院，甘肅 蘭州 730000)

目的：觀察單葉細(xì)辛對(duì)寒飲射肺證模型大鼠腫瘤壞死因子-α(TNF-α)及白細(xì)胞介素-8(IL-8)表達(dá)的影響，探討單葉細(xì)辛治療寒飲射肺證的作用機(jī)制。方法：將40只SPF級(jí)Wistar大鼠隨機(jī)分為正常對(duì)照組、模型對(duì)照組、遼細(xì)辛組、單葉細(xì)辛組4組，每組10只。，后3組用中醫(yī)理論復(fù)制寒飲射肺動(dòng)物模型，各組分別灌胃給予相應(yīng)中藥水提取液或及生理鹽水，連續(xù)28 d。檢測大鼠血清、肺泡灌洗液TNF-α和IL-8的含量。結(jié)果：與正常對(duì)照組對(duì)比，模型對(duì)照組大鼠血清及肺泡灌洗液TNF-α和IL-8的含量升高，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與模型對(duì)照組比較，單葉細(xì)辛組和遼細(xì)辛組TNF-α和IL-8的含量均明顯降低，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；單葉細(xì)辛組與遼細(xì)辛組對(duì)比，差別無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。結(jié)論：單葉細(xì)辛可改善寒飲射肺模型大鼠的TNF-α、IL-8的表達(dá)，抑制氣道炎癥，對(duì)寒飲射肺證有一定治療作用。

細(xì)辛；寒飲射肺證；腫瘤壞死因子-α；白細(xì)胞介素-8；動(dòng)物模型，大鼠

細(xì)辛味辛，性溫，歸心、肺、腎經(jīng)，具有祛風(fēng)散寒、通竅止痛、溫肺化飲的作用，為治療寒飲射肺的常用中草藥?！渡褶r(nóng)本草經(jīng)》記載“ 細(xì)辛主咳逆，溫肺化飲止咳”；《本草綱目》記載“辛能泄肺，故風(fēng)寒咳嗽上氣者宜用”[1]。已有文獻(xiàn)[2]報(bào)道: 單葉細(xì)辛對(duì)寒飲射肺證模型大鼠呼吸和血?dú)庵笜?biāo)等有顯著的療效，但未見其對(duì)TNF-α、IL-8表達(dá)影響的相關(guān)報(bào)道。本研究根據(jù)中醫(yī)理論復(fù)制了寒飲射肺動(dòng)物模型，觀察單葉細(xì)辛對(duì)寒飲射肺證模型大鼠腫瘤壞死因子-α(TNF-α)及白細(xì)胞介素-8(IL-8)表達(dá)的影響，以期探討單葉細(xì)辛治療寒飲射肺證的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 動(dòng) 物

SPF級(jí)7～8周齡Wistar 大鼠40只，體質(zhì)量(200±20)g，雌雄兼用，由甘肅中醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，合格證號(hào)：SCXK(甘) 2013-0004。

1.2 藥品、試劑與儀器

遼細(xì)辛、單葉細(xì)辛由甘肅中醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院中草藥房提供，經(jīng)甘肅中醫(yī)學(xué)院中藥教研室黃世佐教授鑒定，在中藥化學(xué)教研室用水提法模擬臨床用藥劑型，制備成質(zhì)量分?jǐn)?shù)1 g/mL的溶液備用。血TNF-α和IL-8放免試劑盒(批號(hào)130507)，支氣管肺泡灌洗液 TNF-α和IL-8酶聯(lián)免疫試劑盒(批號(hào)131014)，由北京福瑞生物工程公司提供；烏拉坦，中國醫(yī)藥集團(tuán)上?；瘜W(xué)試劑公司產(chǎn)品，批號(hào) C20130305。37℃ 數(shù)顯恒溫水浴鍋，江蘇正基儀器有限公司產(chǎn)品；Bio Lap 420E生物信號(hào)監(jiān)測系統(tǒng)，成都泰盟生物科技公司產(chǎn)品；放射免疫γ自動(dòng)記數(shù)器，南京桑力電子設(shè)備廠產(chǎn)品；Bio-RAD680 酶標(biāo)儀電腦分析系統(tǒng)，產(chǎn)地美國；超速離心機(jī)，金壇市恒豐儀器廠產(chǎn)品。

1.3 動(dòng)物分組、給藥與模型的建立

將40只大鼠隨機(jī)分為正常對(duì)照組、模型對(duì)照組、遼細(xì)辛組、單葉細(xì)辛組4組，每組10只。除正常對(duì)照組外，其余各組造模。動(dòng)物以質(zhì)量分?jǐn)?shù)250 g/L 烏拉坦(4 μL/g)腹腔注射麻醉；取仰臥位固定，常規(guī)消毒；頸部正中切開皮膚，鈍性分離暴露正中氣管、左側(cè)頸總動(dòng)脈；橫向切開環(huán)狀軟骨下方0.5 cm處氣管前壁，再向頭端作縱向切口，使切口呈倒“⊥”字形，插“Y”型氣管插管；固定后，吸凈血液，右側(cè)管經(jīng)張力換能器與Bio Lap 420E生物信號(hào)監(jiān)測系統(tǒng)相連；分離左側(cè)頸總動(dòng)脈備用，用20號(hào)套管針穿刺置管并結(jié)扎固定，以備采血檢測；待呼吸平穩(wěn)后，左側(cè)管插入軟塑料內(nèi)套管，固定后按 2.5 μL/g 灌注7 ℃冷生理鹽水入肺內(nèi)，保留30 s 后抽出，5 min后重復(fù)灌洗1次，連續(xù)5次。按上述方法，寒飲射肺動(dòng)物模型復(fù)制成功[3]。

造模成功后第2天，正常對(duì)照組、模型對(duì)照組灌胃質(zhì)量分?jǐn)?shù)9 g/L NaCl溶液1 μL/g，遼細(xì)辛組與單葉細(xì)辛組分別以中藥水提取液1 μL/g 劑量灌胃，1 d 1次，連續(xù)28 d。

1.4 檢測指標(biāo)

第28 d灌胃后，觀察各組大鼠一般情況，并按要求取標(biāo)本進(jìn)行檢測。左側(cè)頸總動(dòng)脈取動(dòng)脈血3 mL，采用放射免疫分析法檢測血清TNF-α、IL-8。經(jīng)氣管插管向支氣管內(nèi)注入質(zhì)量分?jǐn)?shù)9 g/L NaCl注射液行支氣管肺泡灌洗，每次灌入2 mL，保留30 s；反復(fù)抽洗3次至肺泡灌洗液總量達(dá)4 mL左右，總灌注量為6 mL/只；留取肺泡灌洗液，離心取上清，酶聯(lián)免疫法檢測肺泡灌洗液TNF-α、IL-8的含量。操作均嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠一般情況對(duì)比

正常對(duì)照組大鼠毛發(fā)光澤，呼吸平穩(wěn)，飲食正常，活動(dòng)能力強(qiáng)。模型對(duì)照組大鼠拱背蜷臥、毛發(fā)稀疏，咳嗽氣促，口鼻分泌物增多，口唇黏膜、爪趾皮膚青紫，飲食減少，活動(dòng)力下降。兩細(xì)辛給藥組各癥狀好轉(zhuǎn)，毛發(fā)順滑，咳嗽減輕，飲食較多，活動(dòng)力增強(qiáng)。

2.2 各組大鼠肺泡灌洗液TNF-α、IL-8含量對(duì)比

與正常對(duì)照組對(duì)比，模型對(duì)照組大鼠TNF-α、IL-8含量明顯升高，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，說明造模成功。與模型對(duì)照組對(duì)比，兩細(xì)辛給藥組TNF-α、IL-8含量均下降，說明藥物治療有效。單葉細(xì)辛組與遼細(xì)辛組對(duì)比，此兩指標(biāo)差別無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表1。

表1 各組大鼠肺泡灌洗液TNF-α、IL-8含量對(duì)比

表1 各組大鼠肺泡灌洗液TNF-α、IL-8含量對(duì)比

組 別動(dòng)物數(shù)TNF?αIL?8正常對(duì)照組1016．154±1．61427．618±1．049模型對(duì)照組1057．645±1．672??62．758±0．979??遼細(xì)辛組1036．565±1．596##35．330±1．315##單葉細(xì)辛組1038．236±0．750##△37．684±1．901##△

注：與正常對(duì)照組對(duì)比，**P<0.05；與模型對(duì)照組對(duì)比，##P<0.05；與遼細(xì)辛組對(duì)比，△P>0.05。

2.3 各組大鼠血清TNF-α、IL-8含量對(duì)比

與正常對(duì)照組對(duì)比，模型對(duì)照組大鼠TNF-α、IL-8含量明顯升高，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，說明造模成功。與模型對(duì)照組對(duì)比，兩細(xì)辛給藥組TNF-α、IL-8含量均下降，說明藥物治療有效。單葉細(xì)辛組與遼細(xì)辛組對(duì)比，此兩指標(biāo)差別無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表2。

表2 各組大鼠血清TNF-α、IL-8含量對(duì)比

表2 各組大鼠血清TNF-α、IL-8含量對(duì)比

組 別動(dòng)物數(shù)TNF?αIL?8正常對(duì)照組101．647±0．0561．624±0．377模型對(duì)照組106．455±0．516??6．427±0．706??遼細(xì)辛組103．636±0．435??##3．619±0．490??##單葉細(xì)辛組104．034±0．415??##△4．114±0．316??##△

注：與正常對(duì)照組對(duì)比，**P<0.05；與模型對(duì)照組對(duì)比，##P<0.05；與遼細(xì)辛組對(duì)比，△P>0.05。

3 討 論

細(xì)胞因子在氣道炎癥中起重要作用，許多細(xì)胞因子互相促進(jìn)，加速局部炎癥的發(fā)生、發(fā)展。炎癥因子在呼吸系統(tǒng)內(nèi)促進(jìn)淋巴細(xì)胞和中性粒細(xì)胞等細(xì)胞引起的免疫應(yīng)答和炎癥反應(yīng)，使氣道黏膜中大量炎癥細(xì)胞聚集、浸潤、活化，釋放IL-8、TNF-α等炎癥因子，進(jìn)一步導(dǎo)致氣道重構(gòu)，使氣道壁的損傷與修復(fù)循環(huán)發(fā)生，加重上皮損傷。

IL-8作為一種內(nèi)源、多源性細(xì)胞因子貫穿呼吸系統(tǒng)病程始終，由單核巨噬細(xì)胞產(chǎn)生，為中性粒細(xì)胞的趨化因子和激活劑，吸引、激活、誘導(dǎo)中性粒細(xì)胞脫顆粒，釋放各種酶引起組織嚴(yán)重?fù)p傷，定向游走到反應(yīng)部位，并釋放一系列活性產(chǎn)物，誘導(dǎo)大量組胺、自由基、花生四烯酸等炎癥介質(zhì)釋放，使局部炎性細(xì)胞數(shù)量增多，加重氣道炎癥發(fā)生；并且在一定程度上可以反映氣道炎癥嚴(yán)重程度，參與炎性反應(yīng)和調(diào)節(jié)免疫，是一個(gè)評(píng)估呼吸道炎癥和受損程度的指標(biāo)[4-5]。

TNF-α作為炎癥性細(xì)胞因子可使氣道上皮細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和肺組織的核因子活性增強(qiáng)，是單核、巨噬細(xì)胞在細(xì)菌、病毒感染等作用下釋放的一種生物活性物質(zhì)。當(dāng)細(xì)菌或病毒侵入呼吸道時(shí)，TNF-α釋放入血，促使血液循環(huán)中核轉(zhuǎn)錄因子和其他的轉(zhuǎn)錄因子激活，進(jìn)一步放大炎癥[6]。TNF-α有多種前炎癥介質(zhì)的功能，還可以直接作用于血管內(nèi)皮細(xì)胞，影響血管內(nèi)皮細(xì)胞通透性，致使毛細(xì)血管滲漏，這些共同作用最終導(dǎo)致嚴(yán)重的肺損傷[7]。

IL-8 、TNF-α兩種細(xì)胞因子共同參與呼吸系統(tǒng)氣道結(jié)構(gòu)的重塑及氣道炎癥的反應(yīng)，并可以形成復(fù)雜的細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)，是構(gòu)成氣道炎癥網(wǎng)絡(luò)的重要組成部分，可以反映氣道炎癥改變的程度[8]；IL-8 、TNF-α等炎性因子還可以促進(jìn)中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、單核細(xì)胞和淋巴細(xì)胞等炎性細(xì)胞趨化、黏附、聚集、激活、脫顆粒，釋放蛋白水解酶、溶酶體酶、脂類介質(zhì)等炎性介質(zhì)，對(duì)氣道、肺泡壁、肺血管和肺實(shí)質(zhì)產(chǎn)生慢性損傷[9]。此外，TNF-α能進(jìn)一步誘導(dǎo) IL-8 的合成與釋放，促進(jìn)炎癥進(jìn)一步的反應(yīng)、血管進(jìn)一步的生成和組織纖維進(jìn)一步的增生，造成呼吸氣道結(jié)構(gòu)的狹窄、重塑，并加重肺的損傷，導(dǎo)致肺功能嚴(yán)重降低。

本研究發(fā)現(xiàn)，模型對(duì)照組大鼠肺泡灌洗液、血清IL-8、TNF-α較正常對(duì)照組明顯升高，給予單葉細(xì)辛和遼細(xì)辛灌服后，IL-8、TNF-α不同程度下降，證實(shí)寒飲射肺模型大鼠呼吸系統(tǒng)的確存在一些炎性因子普遍增多的微炎性狀態(tài)。單葉細(xì)辛可能是通過下調(diào)炎性因子的表達(dá)，打破炎性網(wǎng)絡(luò)，進(jìn)一步阻斷促炎因子之間的相互作用，減輕和控制呼吸氣道的慢性炎癥反應(yīng)，進(jìn)而控制病情的發(fā)生和發(fā)展而起到治療的作用。

[1]周禎祥.細(xì)辛本草研究[J].中醫(yī)藥信息，2007，24(1)：35-37

[2]李楊，黃世佐，明海霞，等.單葉細(xì)辛對(duì)“寒飲射肺”證模型大鼠呼吸和血?dú)庵笜?biāo)的影響[J].甘肅中醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2010，27(1)：17-19.

[3]明海霞，黃世佐，李楊，等.單葉細(xì)辛對(duì)寒飲射肺證模型大鼠肺通氣功能相關(guān)指標(biāo)的影響[J].中國中醫(yī)藥信息雜志，2009，16(5)：23-25.

[4]王艷，程惠娟，王紹錢.呼吸道感染肺氣虛證大鼠血?dú)夥治鯥L-8及肺組織病理學(xué)改變[J].遼寧中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2011，13(4)：98-100.

[5]Crul T, Spruit MA.Markers of inflammation and disuse in vastuslateralis of chronic obstructive pulmonary disease patients[J].Eur J Clin Invest,2007,11(37):897-904.

[6]Gallelli L,Pelaia G, Fratto D, et al.Effects of budesonide on P38MAPK activation, apoptosis and IL-8 secretion, induced by TNF-alpha and Haemophilus influenzae in humanbronchial epithelial cells[J].Int J Immunopathol Pharmacol,2010,23(2):471-479.

[7]Rennard SI.The role of free radical oxidation and endothelialdys function in the onset And progression of chronic obstructive pulmonary disease[J]. Ter Arkh, 2011,83(3):74-77.

[8]Rossi F F,Pedone C,Antonelli Incalzi R. Chronic obstructive pulmonary disease and cardiovascular disease:role of the systemic inflammation[J].Recenti Prog Med,2011,102(3):109-113.

[9]楊永紅，王導(dǎo)新.慢性阻塞性肺病患者血清TNF-α水平與肺功能的關(guān)系探討[J].細(xì)胞與分子免疫學(xué)雜志，2010，26(9)：887-888.

(編輯 陶 珠)

1001-6910(2015)03-0065-03

R285.5

B

10.3969/j.issn.1001-6910.2015.03.31

耿廣琴，講師，gengguangqing@126.com

甘肅省教育廳基金資助項(xiàng)目(02B4-04)

2014-07-15