朱苗蕊，楊麗霞，薛建軍，程 濤，田廣芳，張定華，劉銅華

(1.蘭州石化總醫(yī)院，甘肅 蘭州 730060； 2.甘肅省中醫(yī)藥研究院，甘肅 蘭州 730050；3.甘肅省中醫(yī)院，甘肅 蘭州 730050； 4.北京中醫(yī)藥大學(xué)，北京 100029)

·實(shí)驗(yàn)研究·

新加糖腎康對(duì)高糖環(huán)境下HK-2細(xì)胞外基質(zhì)成分沉積的作用研究*

朱苗蕊1，楊麗霞2，薛建軍3，程 濤2，田廣芳3，張定華3，劉銅華4

(1.蘭州石化總醫(yī)院，甘肅 蘭州 730060； 2.甘肅省中醫(yī)藥研究院，甘肅 蘭州 730050；3.甘肅省中醫(yī)院，甘肅 蘭州 730050； 4.北京中醫(yī)藥大學(xué)，北京 100029)

目的：通過觀察新加糖腎康(簡稱TSK)對(duì)高糖誘導(dǎo)人腎小管上皮細(xì)胞(HK-2)的細(xì)胞外基質(zhì)成分Ⅰ型膠原(ColⅠ)、Ⅲ型膠原(Col Ⅲ)和纖連蛋白(FN)的作用，探討其在防治糖尿病腎間質(zhì)纖維化方面的作用。方法：將體外培養(yǎng)的HK-2 細(xì)胞分為 6 組：空白對(duì)照組、高糖誘導(dǎo)組(30 mmol/L D-葡萄糖)、空白血清對(duì)照組(30 mmol/L D-葡萄糖+10%空白血清)、新加TSK低濃度組(30 mmol/L D-葡萄糖+5% 新加TSK藥物血清)、新加TSK中濃度組(30 mmol/L D-葡萄糖+10% 新加TSK藥物血清)、新加TSK高濃度組(30 mmol/L D-葡萄糖+20% 新加TSK藥物血清)。藥物干預(yù)后，ELISA法檢測ColⅠ、Col Ⅲ和FN的含量。結(jié)果：高糖誘導(dǎo)后細(xì)胞外基質(zhì)成分顯著增加，與空白對(duì)照組相比有顯著性差異(P<0.05)。但經(jīng)新加TSK干預(yù)后其含量開始下降，與高糖誘導(dǎo)組相比有顯著性差異(P>0.05)。結(jié)論：中藥復(fù)方新加TSK能夠抑制腎小管上皮細(xì)胞外基質(zhì)成分的分泌，具有防治糖尿病腎間質(zhì)纖維化的作用。

新加糖腎康/藥效學(xué)；高糖/藥物作用；人腎小管上皮細(xì)胞；細(xì)胞外基質(zhì)成分；動(dòng)物模型，大鼠

糖尿病腎病(diabetic nephropathy，DN)是糖尿病常見的慢性微血管并發(fā)癥之一，其發(fā)病機(jī)制尚未明確。既往研究認(rèn)為DN的早期病變在腎小球，近年來研究發(fā)現(xiàn)腎小管病變引起的間質(zhì)纖維化與其關(guān)系更為密切，故腎間質(zhì)纖維化的干預(yù)在DN的治療中越來越受到重視[1]。腎間質(zhì)纖維化的主要特征是細(xì)胞外基質(zhì)成分沉積，因此抑制細(xì)胞外基質(zhì)成分的分泌對(duì)腎間質(zhì)纖維的治療有重要意義。本課題所選中藥復(fù)方糖腎康是甘肅省中醫(yī)院劉國安教授和張定華主任醫(yī)師在多年臨床積累的基礎(chǔ)上，經(jīng)過反復(fù)的藥物篩選，最終確立的臨床經(jīng)驗(yàn)方，具有益氣養(yǎng)陰、清熱祛濕、活血化瘀的功效。既往研究結(jié)果表明：糖腎康膠囊能夠改善2型糖尿病患者血流動(dòng)力學(xué)指標(biāo)，減少尿微量白蛋白和24 h尿蛋白定量，對(duì)DN具有一定的治療作用[2]。本課題在此研究基礎(chǔ)上，結(jié)合北京中醫(yī)藥大學(xué)劉銅華教授治療DN的學(xué)術(shù)思想[3]，對(duì)組方進(jìn)行了優(yōu)化，新增一味活血化瘀藥水蛭組成新加糖腎康(簡稱TSK)，通過觀察其干預(yù)高糖誘導(dǎo)體外培養(yǎng)人腎小管上皮細(xì)胞的細(xì)胞外基質(zhì)成分的分泌，探討其對(duì)DN腎間質(zhì)纖維化的作用，為其臨床應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞株

人腎小管上皮細(xì)胞株(HK-2)購于上海斯信生物科技有限公司。

1.2 動(dòng) 物

雄性SPF級(jí)Wistar大鼠20只，體質(zhì)量(200±20)g，購于甘肅中醫(yī)學(xué)院動(dòng)物中心，許可證號(hào)：SCXK(甘)2004-0006。大鼠飼養(yǎng)于甘肅省中醫(yī)藥研究院中藥研究所動(dòng)物室，普通飼料喂養(yǎng)。

1.3 藥品、試劑與儀器

新加糖腎康由黃芪、生地黃、水蛭等組成，中藥材由甘肅省中醫(yī)院藥劑科提供，用時(shí)水提醇沉。1640細(xì)胞培養(yǎng)基(批號(hào)1237579)、胎牛血清(批號(hào)12657-029),均為Gibco公司產(chǎn)品；人ColⅠ(批號(hào)E1378Hu)、Col Ⅲ(批號(hào)E1375Hu) 和FN ELISA試劑盒(批號(hào)E2002Hu)，均為上海晶天生物科技有限公司產(chǎn)品；D-葡萄糖，汕頭西隴化工廠有限公司產(chǎn)品，批號(hào)0810142，根據(jù)文獻(xiàn)配制為30 mmol/L的溶液[4]。 SANYO MCO-18AIC型CO2培養(yǎng)箱,產(chǎn)地日本；SW-CJ-2FD超凈生物安全柜，產(chǎn)地中國；Olympus IX51型倒置顯微鏡,產(chǎn)地日本；Labsystems Multiskan MS 352型酶標(biāo)儀，產(chǎn)地芬蘭。

1.4 新加糖腎康藥物血清制備

隨機(jī)分為空白組、新加糖腎康組，每組10只。新加糖腎康組按成人臨床用量的6.5倍灌胃，空白組灌服同體積生理鹽水。每次10μL/g體質(zhì)量，上、下午各1次，灌胃3 d。末次灌胃前8 h禁食、不禁水，灌胃30 min后大鼠股動(dòng)脈采血，靜置2 h后3 000 r/min冷凍離心20 min，取上清，-20 ℃保存，用時(shí)與培養(yǎng)基配成所需濃度。

1.5 細(xì)胞培養(yǎng)與分組

HK-2 細(xì)胞用含體積分?jǐn)?shù)100 mL/L胎牛血清的1640培養(yǎng)基培養(yǎng)于 37 ℃、50 mL/L CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中。每隔 1～2 d換新鮮培養(yǎng)基1次，培養(yǎng)融合至 80 % 以上，用含 0.25 % 胰蛋白酶、0.05% EDTA 的消化液消化后，用新鮮培養(yǎng)基將細(xì)胞重懸后進(jìn)行傳代培養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)前先用無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h使細(xì)胞同步化，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

細(xì)胞分為6組。①空白對(duì)照組：1640培養(yǎng)液；②高 糖誘導(dǎo)組：1640培養(yǎng)液+30 mmol/L D-葡萄糖；③空白血清對(duì)照組：1640培養(yǎng)液+30 mmol/L D-葡萄糖+10%空白血清；④新加糖腎康低濃度組：1640培養(yǎng)液+30 mol/L D-葡萄糖+5%TSK藥物血清；⑤新加糖腎康中濃度組：1640培養(yǎng)液+30 mmol/L D-葡萄糖+10%TSK藥物血清；⑥新加糖腎康高濃度組：1640培養(yǎng)液+30mmol/L D-葡萄糖+20%TSK藥物血清。

1.6 檢測指標(biāo)

采用ELISA法檢測ColⅠ、Col Ⅲ和FN的含量。細(xì)胞接種于24孔板，每孔1 mL，每組設(shè)2個(gè)復(fù)孔，培養(yǎng)過夜。按分組加入含相應(yīng)濃度藥品的培養(yǎng)液，每孔1 mL。分別于24 h、48 h收集細(xì)胞上清，4 ℃離心20 min(2 000 r/min),取上清，-20 ℃保存待測。指標(biāo)檢測按照ELISA試劑盒說明書進(jìn)行。取出細(xì)胞上清，在試劑盒包被反應(yīng)條每孔加入不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)的標(biāo)準(zhǔn)品或待測標(biāo)本，空白對(duì)照孔加稀釋液100 μL，37 ℃孵育、洗滌、加酶標(biāo)抗體和終止反應(yīng)。在酶標(biāo)儀上450 nm處，以空白對(duì)照孔調(diào)零，直接測定各孔OD值及樣品濃度值。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié) 果

ELISA實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：HK-2細(xì)胞經(jīng)高糖誘導(dǎo)24 h、48 h后，ColⅠ、Col Ⅲ和FN的含量增加，與空白對(duì)照組對(duì)比，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；但經(jīng)糖腎康藥物血清干預(yù)后，其含量開始減少，特別是高濃度效果更為明顯，與高糖誘導(dǎo)組對(duì)比，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，而空白血清沒有類似作用。結(jié)果表明：糖腎康能夠抑制高糖環(huán)境下人腎小管上皮細(xì)胞分泌細(xì)胞外基質(zhì)成分，在一定程度上具有抑制糖尿病腎間質(zhì)纖維化的作用。結(jié)果見表1～3。

表1 各組HK-2細(xì)胞ColⅠ含量對(duì)比

表1 各組HK-2細(xì)胞ColⅠ含量對(duì)比

組 別24h48h空白對(duì)照組0．553±0．085#0．520±0．071#高糖誘導(dǎo)組1．921±0．051?2．187±0．107?空白血清對(duì)照組0．580±0．106#0．459±0．061?#新加糖腎康低濃度組1．617±0．118?1．481±0．088?#新加糖腎康中濃度組1．613±0．117?1．597±0．039?#新加糖腎康高濃度組1．606±0．123?#1．342±0．148?#

注：與空白對(duì)照組對(duì)比，*P<0.05；與高糖誘導(dǎo)組對(duì)比，#P<0.05。

表2 各組HK-2細(xì)胞Col Ⅲ含量對(duì)比

表2 各組HK-2細(xì)胞Col Ⅲ含量對(duì)比

組 別24h48h空白對(duì)照組2．544±0．251#2．131±0．112#高糖誘導(dǎo)組4．533±0．331?6．026±0．216?空白血清對(duì)照組2．611±0．370#2．289±0．386#新加糖腎康低濃度組4．407±0．295?4．159±0．329?△新加糖腎康中濃度組3．943±0．126?#3．429±0．054?#新加糖腎康高濃度組3．397±0．247?#2．796±0．257?#

注：與空白對(duì)照組對(duì)比，*P<0.05；與高糖誘導(dǎo)組對(duì)比，#P<0.05。

表3 各組HK-2細(xì)胞FN 含量對(duì)比

表3 各組HK-2細(xì)胞FN 含量對(duì)比

組 別24h48h空白對(duì)照組467．711±58．318△487．362±66．507△高糖誘導(dǎo)組1193．438±13．330?1461．097±46．103?空白血清對(duì)照組414．180±97．499#457．547±71．237#新加糖腎康低濃度組1231．385±61．166?1050．461±63．972?#新加糖腎康中濃度組1141．940±120．904?1076．889±42．268?#新加糖腎康高濃度組1095．184±78．950?#1030．810±54．585?#

注：與空白對(duì)照組對(duì)比，﹡P<0.05；與高糖誘導(dǎo)組對(duì)比，#P<0.05。

3 討 論

糖尿病腎病是糖尿病的并發(fā)癥之一?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)認(rèn)為，糖尿病患者腎功能損害與腎小管間質(zhì)病變的嚴(yán)重程度密切相關(guān)，其病理學(xué)特征為腎小管細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrixc，ECM)積聚、間質(zhì)纖維化。研究發(fā)現(xiàn)：腎小管上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化為間充質(zhì)細(xì)胞是腎間質(zhì)纖維化發(fā)生機(jī)制之一，一般情況下炎癥、損傷、細(xì)胞因子、高糖、終末糖基化產(chǎn)物均可誘導(dǎo)腎間質(zhì)纖維化[5]。腎間質(zhì)纖維化時(shí)ECM 主要由3 部分組成: ①膠原蛋白，包括Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型膠原等； ②非膠原糖蛋白，包括纖連蛋白、層粘連蛋白、玻璃粘連蛋白、內(nèi)皮粘連蛋白等; ③糖胺多糖與蛋白多糖，包括透明質(zhì)酸、硫酸軟骨素、硫酸角質(zhì)素、肝素等[6]。本課題主要研究新加糖腎康對(duì)高糖誘導(dǎo)的腎間質(zhì)纖維化ColⅠ、Col Ⅲ和FN的影響。

DN既屬“消渴”，又屬“腎病”范疇[3]。本病以消渴日久、纏綿不愈使臟腑功能失調(diào)，陰陽氣血虛衰而發(fā)病。究其病因病機(jī)，歷代醫(yī)家多重視腎虛血瘀，基本病機(jī)特點(diǎn)為本虛標(biāo)實(shí)。本虛指陰虛、陽虛、氣虛、血虛、肝虛、心虛、脾虛、肺虛、腎虛；標(biāo)實(shí)即痰濁、水濕、瘀血。本虛與標(biāo)實(shí)互為因果，相互為病。如唐代孫思邈《千金要方》也認(rèn)為消渴病的發(fā)病基礎(chǔ)是“盛壯之時(shí)，不自慎惜，快情縱欲，極意房中，稍至年長，腎氣虛竭，百病滋生”?！妒?jì)總錄》云：“消渴病久，腎氣受傷，腎主水，腎氣虛衰，氣化失常，開闔不利，水液凝聚體內(nèi)而出現(xiàn)水腫?！毙录犹悄I康組方符合DN本虛標(biāo)實(shí)的理論基礎(chǔ)，方中黃芪、生地黃益氣養(yǎng)陰，為君藥；槐米、大黃清熱祛濕，為臣藥；益母草、山楂、水蛭活血化瘀，為佐藥。方中新增水蛭為蟲類藥，使組方的活血化瘀作用更強(qiáng)。

本研究結(jié)果顯示：與空白對(duì)照組對(duì)比，人腎小管上皮細(xì)胞在高糖刺激后，細(xì)胞外基質(zhì)成分ColⅠ、Col Ⅲ和FN的含量上升，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，說明高糖可以導(dǎo)致細(xì)胞外基質(zhì)成分增多，是糖尿病腎間質(zhì)纖維化的主要因素。以新加糖腎康干預(yù)后，ColⅠ、Col Ⅲ和FN的含量開始下降，與單純高糖組對(duì)比，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，說明新加糖腎康在一定程度上能夠抑制高糖刺激的細(xì)胞外基質(zhì)成分沉積，具有抑制糖尿病腎間質(zhì)纖維化的作用。

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(編輯 陶 珠)

1001-6910(2015)03-0056-03

R285.5

B

10.3969/j.issn.1001-6910.2015.03.28

薛建軍，副主任醫(yī)師，1144870599@qq.com

甘肅省中醫(yī)藥管理局中醫(yī)藥科學(xué)技術(shù)研究課題(GZK-2011-13)；北京中醫(yī)藥大學(xué)創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)項(xiàng)目(2011-CXTD-19)；國家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目(30973909)

2014-07-02；

2014-11-06