成遠(yuǎn)強(qiáng)，趙 龍，閆園園，蘇國(guó)棟，王 瑩

(1.牡丹江醫(yī)學(xué)院影像學(xué)院，黑龍江 牡丹江 157011； 2.牡丹江醫(yī)學(xué)院解剖教研室，黑龍江 牡丹江 157011)

·實(shí)驗(yàn)研究·

冬蟲(chóng)夏草聯(lián)合脂肪源性干細(xì)胞移植對(duì)大鼠腦缺血/再灌注損傷的保護(hù)作用*

成遠(yuǎn)強(qiáng)1，趙 龍1，閆園園1，蘇國(guó)棟1，王 瑩2

(1.牡丹江醫(yī)學(xué)院影像學(xué)院，黑龍江 牡丹江 157011； 2.牡丹江醫(yī)學(xué)院解剖教研室，黑龍江 牡丹江 157011)

目的：探討冬蟲(chóng)夏草促進(jìn)脂肪源性干細(xì)胞(adipose-derived stem cell，ADSC)對(duì)大鼠缺血/再灌注損傷神經(jīng)保護(hù)作用。方法：線栓法制備大鼠大腦中動(dòng)脈缺血再灌注模型，將動(dòng)物隨機(jī)分為：模型對(duì)照組、冬蟲(chóng)夏草組、ADSC移植組、冬蟲(chóng)夏草+ADSC組。術(shù)后7d行神經(jīng)功能缺陷評(píng)分(NSS)、懸垂實(shí)驗(yàn)及被動(dòng)活動(dòng)實(shí)驗(yàn)，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR分別檢測(cè)梗死區(qū)炎癥介質(zhì)Iba-1、IL-1Β和TNF-α mRNA的表達(dá)水平。結(jié)果：冬蟲(chóng)夏草+ADSC組NSS評(píng)分顯著低于單獨(dú)治療組和模型對(duì)照組，而懸垂實(shí)驗(yàn)及被動(dòng)活動(dòng)評(píng)分則顯著增高 (P<0.05)。與模型對(duì)照組和單獨(dú)治療組對(duì)比，冬蟲(chóng)夏草+ADSC組梗死區(qū)Iba-1、IL-1Β和TNF-α mRNA表達(dá)水平顯著下降(P<0.05)。結(jié)論：冬蟲(chóng)夏草聯(lián)合ADSC移植對(duì)大鼠腦缺血神經(jīng)保護(hù)作用優(yōu)于單獨(dú)治療組，其機(jī)制可能與冬蟲(chóng)夏草和ADSC能夠協(xié)同發(fā)揮抗炎癥作用有關(guān)。

冬蟲(chóng)夏草/藥效學(xué)；脂肪源性干細(xì)胞；缺血再灌注損傷；運(yùn)動(dòng)功能；動(dòng)物模型，大鼠

腦缺血疾病是世界范圍內(nèi)人類(lèi)第三大致死的主要原因，比心血管疾病更容易留下嚴(yán)重后遺癥，需要長(zhǎng)期的康復(fù)和護(hù)理。近年來(lái)細(xì)胞治療作為腦缺血疾病新的治療方法得到人們的重視[1]。筆者前期研究[2-3]已證實(shí)，脂肪源性干細(xì)胞(adipose-derived stem cell，ADSC)可抑制梗死灶炎癥趨化因子，促進(jìn)腦缺血損傷功能恢復(fù)，但效果并不顯著。有研究[4]證實(shí)，聯(lián)合治療可能累加或協(xié)同單獨(dú)治療的作用和臨床效果。冬蟲(chóng)夏草作為我國(guó)傳統(tǒng)中藥，具有補(bǔ)虛損、益精氣等功效，能夠進(jìn)行免疫調(diào)節(jié)[5]。本研究首次通過(guò)冬蟲(chóng)夏草聯(lián)合ADSC移植治療大鼠腦缺血模型，觀察梗死區(qū)炎癥遞質(zhì)Iba-1、IL-1 β和TNF-α表達(dá)，探討冬蟲(chóng)夏草與干細(xì)胞聯(lián)合對(duì)腦缺血損傷的保護(hù)機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 動(dòng) 物

雄性SD大鼠40只，SPF級(jí)，體質(zhì)量260～300 g，購(gòu)自中國(guó)醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，中心許可證號(hào)號(hào): SYXK(遼)20080013。

1.2 藥品與試劑

冬蟲(chóng)夏草精粉，安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)蟲(chóng)生真菌研究所提供,批號(hào) 031224。PKH-26 體外熒光標(biāo)記試劑盒，美國(guó)Sigma公司產(chǎn)品，批號(hào)MINI26；熒光定量PCR試劑盒，日本Takara公司產(chǎn)品，批號(hào)CK901H；引物設(shè)計(jì)，大連寶生物工程有限公司；胎牛血清，美國(guó)Hyclon公司產(chǎn)品，批號(hào)0407。

1.3 ADSC培養(yǎng)及PKH26 體外熒光標(biāo)記

脂肪組織由中國(guó)醫(yī)科大學(xué)盛京醫(yī)院整形外科提供，來(lái)自于30～45歲要求去除腹部多余脂肪的健康成人(均知情同意)。參照前期的方法[2]進(jìn)行分離培養(yǎng)ADSC，換液傳代，取第4～5代的ADSC制成單細(xì)胞懸液。

1.4 動(dòng)物分組與模型的建立

大鼠按體質(zhì)量進(jìn)行隨機(jī)區(qū)組法分為模型對(duì)照組、冬蟲(chóng)夏草組、ADSC組、冬蟲(chóng)夏草+ADSC組4組，每組10只。線栓改良法[6]制備大鼠大腦中動(dòng)脈缺血模型。模型對(duì)照組：?jiǎn)渭冊(cè)炷＃挥枞魏胃深A(yù)。冬蟲(chóng)夏草組和冬蟲(chóng)夏草+ADSC組于建模成功后每天注射冬蟲(chóng)夏草(100 g冬蟲(chóng)夏草精粉加400 mL蒸餾水溶解過(guò)濾滅菌，0.5 mL/d,7 d)。ADSC組和冬蟲(chóng)夏草+ADSC組于建模成功2 d后經(jīng)尾靜脈注射ADSC懸液(500 μL ，4×104個(gè)/μL)[3]，其余兩組注射等體積的PBS。

1.5 檢測(cè)指標(biāo)

1.5.1 神經(jīng)功能評(píng)估

缺血后7 d，采用神經(jīng)功能損害評(píng)分表(NSS)，從運(yùn)動(dòng)、感覺(jué)、反射、平衡4方面進(jìn)行神經(jīng)功能損害評(píng)估。

1.5.2 被動(dòng)活動(dòng)實(shí)驗(yàn)

缺血后7 d，將大鼠放在被動(dòng)活動(dòng)儀上(轉(zhuǎn)速設(shè)定每分鐘15圈)，記錄3 min每只小鼠的停留時(shí)間[6]。

1.5.3 懸垂實(shí)驗(yàn)

缺血后7 d，輕執(zhí)大鼠尾部，將其放在金屬橫桿上，小心讓小鼠兩前肢接觸橫桿，然后松開(kāi)尾巴，按5級(jí)評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)[6]進(jìn)行評(píng)分，記錄停留橫桿時(shí)間。

1.5.4 梗死區(qū)組織Iba-1、IL-1β和TNF-α mRNA相對(duì)表達(dá)

按熒光定量PCR試劑盒說(shuō)明書(shū)取各組大鼠梗死區(qū)組織進(jìn)行RNA提取、PCR反轉(zhuǎn)錄、檢測(cè)及熒光定量分析。各引物的序列為: Iba-1，上游5′-TTCCTTCTCTATTACCCCTG-3′，下游5′- GGTGTTCCTTTTCTTCTCTTGC-3′，擴(kuò)增長(zhǎng)度為163bp。 IL-1 β，上游5′-GAAGTCAAGACCAAAGTGG -3′，下游5′-GACTCAACCTTCCTCTCCA-3′，擴(kuò)增長(zhǎng)度為202bp。TNF-α，上游5′-3′CAGGGCAATGATCCCAAAGTA-3′，下游5′-GCAGTCAGATCATCTTCTCGA-3′。β-actin，上游5′-TGGTGGGTATGGGTCAGAAGGACTC-3′，下游5′-CATGGCTGGGGTGTTGAAGGTCTCA-3′，常規(guī)利用 2- △△ CT 方法進(jìn)行分析。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié) 果

2.1 ADSC的培養(yǎng)

接種1d后細(xì)胞貼壁，呈成纖維細(xì)胞樣外觀。2 d 后細(xì)胞伸展呈長(zhǎng)梭形，7 d后細(xì)胞可形成較密集的細(xì)胞群落。

2.2 各組NSS評(píng)分、被動(dòng)活動(dòng)實(shí)驗(yàn)及懸垂實(shí)驗(yàn)結(jié)果對(duì)比

缺血后7 d，與模型對(duì)照組對(duì)比，冬蟲(chóng)夏草組、ADSC組和冬蟲(chóng)夏草+ADSC組NSS評(píng)分降低，懸垂實(shí)驗(yàn)及被動(dòng)活動(dòng)實(shí)驗(yàn)評(píng)分增高，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，其中冬蟲(chóng)夏草+ADSC組作用顯著優(yōu)于冬蟲(chóng)夏草組和ADSC組，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表1。

表1 各組NSS評(píng)分、被動(dòng)活動(dòng)實(shí)驗(yàn)及懸垂實(shí)驗(yàn)結(jié)果對(duì)比

表1 各組NSS評(píng)分、被動(dòng)活動(dòng)實(shí)驗(yàn)及懸垂實(shí)驗(yàn)結(jié)果對(duì)比

組 別動(dòng)物數(shù)NSS評(píng)分/分被動(dòng)活動(dòng)實(shí)驗(yàn)/s懸垂實(shí)驗(yàn)/s模型對(duì)照組1014．26±1．3842．35±13．893．52±0．65冬蟲(chóng)夏草組109．35±1．24?75．69±14．30?7．85±1．91?ADSC組108．91±1．11?69．22±12．25?9．47±1．66?冬蟲(chóng)夏草+ADSC組106．32±0．61?#△125．22±19．6?#△12．46±1．73?#△

注：與模型對(duì)照組對(duì)比，*P<0.05；與冬蟲(chóng)夏草組對(duì)比，#P<0.05；與ADSC組對(duì)比，△P<0.05。

2.3 各組梗死區(qū)組織Iba-1、IL-1β和TNF-α mRNA相對(duì)表達(dá)對(duì)比

與模型對(duì)照組對(duì)比，各治療組梗死區(qū)Iba-1、IL-1β和TNF-α mRNA相對(duì)表達(dá)均降低，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與冬蟲(chóng)夏草組和ADSC組對(duì)比，冬蟲(chóng)夏草+ADSC組梗死區(qū)Iba-1、IL-1β和TNF-α mRNA相對(duì)表達(dá)降低，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表2。

表2 各組梗死區(qū)組織Iba-1、IL-1β和TNF-α mRNA相對(duì)表達(dá)對(duì)比

組 別動(dòng)物數(shù) Iba?1 IL?1β TNF?αmRNA模型對(duì)照組100．47±0．80．073±0．0170．0096±0．0016冬蟲(chóng)夏草組100．25±0．04?0．052±0．010?0．0063±0．0015?ADSC組100．29±0．06?0．046±0．008?0．0071±0．0009?冬蟲(chóng)夏草+ADSC組100．16±0．03?#△0．035±0．007?#△0．0046±0．0011?#△

注：與模型對(duì)照組對(duì)比，*P<0.05；與冬蟲(chóng)夏草組對(duì)比，#P<0.05；與ADSC組對(duì)比，△P<0.05。

3 討 論

目前干細(xì)胞移植已成為腦缺血疾病新的治療方向。各種來(lái)源的干細(xì)胞治療腦缺血損傷已經(jīng)進(jìn)入了臨床前評(píng)估階段，其中ADSC可較容易地從患者體內(nèi)獲得，避免了倫理道德問(wèn)題，并具有創(chuàng)傷小、無(wú)移植免疫排斥反應(yīng)、易傳代等優(yōu)勢(shì)，已被廣泛運(yùn)用于神經(jīng)再生領(lǐng)域[7]。Jafarzadeh[8]證實(shí)，在腦損傷后24～72 h內(nèi)自體靜脈注射ADSC對(duì)于缺血性疾病是一種安全和可行的治療方法, 并有助于改善功能恢復(fù)。

大腦中動(dòng)脈閉塞后發(fā)生缺血/再灌注損傷炎癥反應(yīng)[1]，如小神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞活化、中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)以及IL-1β、Iba-1和TNF-α等促炎癥細(xì)胞因子產(chǎn)生，對(duì)損傷灶發(fā)生和發(fā)展發(fā)揮著重要作用。有研究證實(shí)：在炎癥基因敲除小鼠或藥物抑制這些炎癥介質(zhì)后，可降低腦缺血后細(xì)胞死亡和組織損傷程度[6]。以前的研究[6]顯示：干細(xì)胞有抗炎癥和免疫特性。筆者前期研究[3]也發(fā)現(xiàn)：ADSC移植能夠顯著抑制腦梗死灶PARP、NF-κ、CXCL1、CXCL2等炎癥介質(zhì)，但其單獨(dú)治療的效果并不顯著，而采用干細(xì)胞聯(lián)合其他藥物的方式進(jìn)行治療，在降低梗塞面積大小、促進(jìn)神經(jīng)功能恢復(fù)以及延遲治療時(shí)間窗等方面都有更為積極的作用。

冬蟲(chóng)夏草(又名中華蟲(chóng)草)是一種富含蟲(chóng)草酸、多糖、氨基酸、多種微量元素的名貴中藥?！端幮钥肌穂9]認(rèn)為其能夠秘精益氣，專(zhuān)補(bǔ)命門(mén)?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)也證實(shí)冬蟲(chóng)夏草具有調(diào)控機(jī)體免疫反應(yīng)、抗炎、改善心血管疾病等廣泛的藥理學(xué)作用[5]。先前的研究[5]發(fā)現(xiàn)：在大鼠局灶腦缺血模型中，冬蟲(chóng)夏草通過(guò)對(duì)氧化應(yīng)激和炎癥的抑制能夠減少腦梗死面積和神經(jīng)功能損傷。本研究結(jié)果示冬蟲(chóng)夏草治療后，梗死區(qū)炎癥介質(zhì)IL-1β、Iba-1和TNF-α顯著降低，再次證實(shí)冬蟲(chóng)夏草可能通過(guò)抑制炎癥因子表達(dá)促進(jìn)腦缺血損傷功能恢復(fù)。另外，ADSC結(jié)合冬蟲(chóng)夏草會(huì)顯著降低IL-1β、Iba-1和TNF-α在梗塞灶的表達(dá)；且聯(lián)合組NSS評(píng)分顯著低于單獨(dú)治療組和模型對(duì)照組，而懸垂實(shí)驗(yàn)及被動(dòng)活動(dòng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果則顯著增高。此證實(shí)：聯(lián)合治療不僅有利于神經(jīng)功能再生，而且能夠?qū)θ毖俟嘧p傷造成的部分肌力喪失及共濟(jì)運(yùn)動(dòng)失調(diào)有保護(hù)作用[6]。筆者推測(cè)聯(lián)合治療的神經(jīng)保護(hù)機(jī)制可能有以下兩個(gè)方面：一是ADSC可以降低腦缺血后在缺血邊界區(qū)的炎癥反應(yīng)；二是冬蟲(chóng)夏草可能通過(guò)抗炎、調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)為移植的ADSC和局部細(xì)胞的修復(fù)創(chuàng)造一個(gè)穩(wěn)定的微環(huán)境。

綜上所述，本研究首次探討聯(lián)合應(yīng)用ADSC和冬蟲(chóng)夏草治療大鼠腦缺血損傷，證實(shí)了聯(lián)合治療可抑制梗死區(qū)炎癥介質(zhì)IL-1β、Iba-1和TNF-α表達(dá)，促進(jìn)腦缺血神經(jīng)功能恢復(fù)。

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(編輯 陶 珠)

1001-6910(2015)03-0059-03

R285.5

B

10.3969/j.issn.1001-6910.2015.03.29

王瑩，碩士生導(dǎo)師，副教授，博士，yingwang770224@163.com

黑龍江省大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計(jì)劃項(xiàng)目(201310229003)；牡丹江醫(yī)學(xué)院大學(xué)生科研立項(xiàng)學(xué)術(shù)研究項(xiàng)目(201302)

2014-11-12；

2014-12-18