陳俊杰，鄭娜芬，葉梓瑩，林俊汕，區(qū)瑞章，曾宇婷

(1增城市人民醫(yī)院，廣東增城511300；2中山大學(xué)孫逸仙紀(jì)念醫(yī)院)

miR-137基因轉(zhuǎn)染對(duì)人眼葡萄膜黑色素瘤細(xì)胞侵襲能力的影響及機(jī)制

陳俊杰1，鄭娜芬2，葉梓瑩2，林俊汕2，區(qū)瑞章2，曾宇婷2

(1增城市人民醫(yī)院，廣東增城511300；2中山大學(xué)孫逸仙紀(jì)念醫(yī)院)

目的 探討miR-137基因轉(zhuǎn)染對(duì)人眼葡萄膜黑色素瘤細(xì)胞系M23細(xì)胞侵襲能力的影響及其機(jī)制。方法 將正常培養(yǎng)的M23細(xì)胞分為轉(zhuǎn)染組和對(duì)照組，每組3孔，分別采用LipofectamineTM2000 瞬時(shí)轉(zhuǎn)染miR-137 mimic及miR-137 mimics 陰性對(duì)照。轉(zhuǎn)染18 h后用Transwell侵襲試驗(yàn)檢測(cè)兩組細(xì)胞侵襲能力(穿膜細(xì)胞數(shù))；48 h后采用Western blot法檢測(cè)細(xì)胞基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)-2和MMP-9表達(dá)，采用ELISA法檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)上清液中MMP-2和MMP-9水平。結(jié)果 轉(zhuǎn)染組穿膜細(xì)胞數(shù)明顯少于對(duì)照組(P均<0.05)； MMP-2和MMP-9蛋白表達(dá)低于對(duì)照組(P均<0.05)；細(xì)胞培養(yǎng)上清液中MMP-2和MMP-9水平低于對(duì)照組(P均<0.05)。結(jié)論 miR-137基因轉(zhuǎn)染對(duì)M23細(xì)胞的侵襲能力有抑制作用；其機(jī)制可能為抑制細(xì)胞MMP-2和MMP-9表達(dá)。

葡萄膜黑色素瘤；侵襲；miR-137基因；基質(zhì)金屬蛋白酶

葡萄膜黑色素瘤是最常見(jiàn)的成人眼內(nèi)惡性腫瘤，具有非常高的侵襲及轉(zhuǎn)移能力[1,2]。但對(duì)其發(fā)病機(jī)制的研究較少[3]。葡萄膜黑色素瘤具有極高的血行轉(zhuǎn)移概率，其中以肝轉(zhuǎn)移最常見(jiàn)，約占了全部轉(zhuǎn)移的90%以上，病死率很高[4]。微小RNA(miRNA)近年來(lái)成為生命科學(xué)特別腫瘤領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)。研究發(fā)現(xiàn)，miRNA在人眼葡萄膜黑色素瘤發(fā)生和發(fā)展過(guò)程中起重要作用[5,6]。我們前期研究顯示上調(diào)miR-137表達(dá)能抑制人眼葡萄膜黑色素瘤細(xì)胞系M23的增殖和遷移能力[7]。2014年1～7月，我們觀察了miR-137基因轉(zhuǎn)染對(duì)人葡萄膜黑色素瘤M23細(xì)胞侵襲能力的影響，現(xiàn)分析結(jié)果并探討其機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料 人眼葡萄膜黑色素瘤細(xì)胞系M23購(gòu)自ATCC；miR-137 mimics及對(duì)應(yīng)的miR-137 mimics 陰性對(duì)照由上海吉瑪公司設(shè)計(jì)并合成；熒光標(biāo)記的隨機(jī)序列RNA由美國(guó)Ambion公司合成；胎牛血清和RPMI 1640培養(yǎng)基購(gòu)自美國(guó)HyClone公司；Opti-MEM培養(yǎng)基和LipofectamineTM2000購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司；8.0 μm孔徑PC膜Transwell小室購(gòu)自美國(guó)Corning公司；細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)膠購(gòu)自美國(guó)Sigma公司，RPMI-1640 培養(yǎng)基(無(wú)酚紅)購(gòu)自北京寰宇科創(chuàng)生物科技公司；MMP-2和MMP-9 ELISA檢測(cè)試劑盒、辣根酶標(biāo)記抗兔IgG購(gòu)自武漢博士德生物；兔抗MMP-2及MMP-9單克隆抗體、兔抗GAPDH多克隆抗體購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz Biotechnology； SDS-PAGE凝膠配制試劑盒、ECL反應(yīng)檢測(cè)試劑盒和總蛋白提取試劑盒購(gòu)自碧云天生物技術(shù)研究所；蛋白濃度檢測(cè)試劑盒購(gòu)自南京凱基公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 細(xì)胞分組及轉(zhuǎn)染 取對(duì)數(shù)期M23細(xì)胞胰酶消化制成細(xì)胞懸液，接種于6孔板，每孔3.5×105個(gè)細(xì)胞，接種后20 h細(xì)胞生長(zhǎng)良好時(shí)分為轉(zhuǎn)染組和對(duì)照組，每組3個(gè)復(fù)孔；分別通過(guò)LipofectamineTM2000采用miR-137 mimics、miR-137 mimics 陰性對(duì)照組瞬時(shí)轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染終濃度均為30 nmol/L。同時(shí)轉(zhuǎn)染熒光標(biāo)記的隨機(jī)序列RNA以觀察轉(zhuǎn)染效率。轉(zhuǎn)染方法按照minR-137 mimics說(shuō)明書(shū)操作。

1.2.2 細(xì)胞侵襲能力檢測(cè) 采用Transwell侵襲試驗(yàn)。Transwell小室上室面鋪上ECM膠制備Transwell侵襲模型小室。兩組轉(zhuǎn)染18 h時(shí)胰酶消化制備成細(xì)胞懸液，細(xì)胞濃度調(diào)整為2×105/mL，上室加入細(xì)胞懸液200 μL，下室加入含10%胎牛血清的完全培養(yǎng)基500 μL，置37 ℃、50 mL/L CO2培養(yǎng)箱。30 h后取出小室，甲醇固定后蘇木素將膜浸泡染色，顯微鏡下觀察膜的下室面，隨機(jī)選取10個(gè)200倍視野計(jì)數(shù)每個(gè)孔穿過(guò)膜的細(xì)胞數(shù)量(穿膜細(xì)胞數(shù))。

1.2.3 MMP-2、MMP-9蛋白表達(dá)檢測(cè) ①細(xì)胞MMP-2、MMP-9蛋白表達(dá)：采用Western blot法。轉(zhuǎn)染48 h收集兩組細(xì)胞，按照全蛋白提取試劑盒說(shuō)明書(shū)操作提取蛋白，采用蛋白濃度檢測(cè)試劑盒測(cè)定蛋白濃度，每條泳道加40 μg蛋白進(jìn)行等質(zhì)量上樣，SDS-PAGE電泳，濕轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)膜，一抗MMP-2和MMP-9以1∶1 000稀釋使用，4 ℃孵育過(guò)夜，二抗IgG(稀釋度1∶5 000)室溫孵育1 h，洗膜后ECL化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)，GAPDH為內(nèi)對(duì)照。顯像圖用Image J 軟件進(jìn)行分析。用軟件讀取各條帶灰度值，然后將各組待檢測(cè)蛋白條帶灰度值與相應(yīng)內(nèi)對(duì)照條帶灰度值進(jìn)行相比，即為相對(duì)蛋白表達(dá)量。②細(xì)胞培養(yǎng)上清液MMP-2、MMP-9蛋白水平：采用ELISA法。細(xì)胞轉(zhuǎn)染后18 h換液，改用不含血清的無(wú)酚紅RPMI 1640培養(yǎng)基，培養(yǎng)30 h后離心收集上清，按ELISA檢測(cè)說(shuō)明書(shū)檢測(cè)分泌型MMP-2和MMP-9含量, 重復(fù)3次。相對(duì)表達(dá)量按照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行計(jì)算。

2 結(jié)果

將熒光標(biāo)記的隨機(jī)序列RNA 轉(zhuǎn)染M23細(xì)胞，24 h在熒光顯微鏡下觀察，基本上所有細(xì)胞均有熒光顯示，說(shuō)明轉(zhuǎn)染效率接近100%。

2.1 細(xì)胞侵襲能力 轉(zhuǎn)染組、對(duì)照組穿膜細(xì)胞數(shù)分別為(30.25±8.71)、(103.38±11.69)個(gè)，轉(zhuǎn)染組明顯少于對(duì)照組(P<0.05)。

2.2 細(xì)胞MMP-2、MMP-9蛋白表達(dá) 轉(zhuǎn)染組MMP2和MMP-9蛋白相對(duì)表達(dá)量分別為0.157±0.033和0.208±0.051，對(duì)照組分別為0.892±0.040和0.969±0.032，轉(zhuǎn)染組均低于對(duì)照組(P均<0.05)。

2.3 細(xì)胞上清液中MMP-2、MMP-9水平 轉(zhuǎn)染組細(xì)胞上清液中MMP-2和MMP-9表達(dá)量分別為0.663±0.033和0.854±0.059，對(duì)照組分別為1.618±0.021和1.730±0.084，轉(zhuǎn)染組均低于對(duì)照組(P均<0.05)。

3 討論

人眼葡萄膜黑色素瘤是成人最常見(jiàn)的眼內(nèi)原發(fā)性惡性腫瘤，其除皮膚外第二常見(jiàn)的原發(fā)性惡性黑素瘤[8]。葡萄膜黑色素瘤具有極高的轉(zhuǎn)移能力，大多數(shù)患者在診斷時(shí)往往已發(fā)生亞臨床轉(zhuǎn)移[9]。迄今為止，葡萄膜黑色素瘤的病因尚未被闡明，臨床上對(duì)其缺乏有效治療方法，且治療標(biāo)準(zhǔn)尚未統(tǒng)一。由于葡萄膜黑色素瘤生長(zhǎng)和播散的機(jī)制不明，對(duì)發(fā)生轉(zhuǎn)移的葡萄膜黑色素瘤更加缺乏有效的治療手段[10]。探討葡萄膜黑色素瘤侵襲、轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制，尋求新的治療靶點(diǎn)，對(duì)葡萄膜黑色素瘤的防治具有重大意義。

miR-137在多種物種間具有高度保守性，已證實(shí)在多種腫瘤組織中其表達(dá)減低，扮演著抑癌基因的角色。文獻(xiàn)報(bào)道，在miR-137表達(dá)減低的腫瘤細(xì)胞中恢復(fù)其表達(dá)后，細(xì)胞增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移的能力均受到明顯抑制[11～13]。在人眼葡萄膜黑色素瘤中，miR-137表達(dá)減低且上調(diào)其表達(dá)可以抑制葡萄膜黑色素瘤細(xì)胞的增殖、多克隆形成和動(dòng)物體內(nèi)的腫瘤形成能力，認(rèn)為是葡萄膜黑色素瘤的抑癌基因[14]。我們前期研究顯示上調(diào)miR-137表達(dá)能抑制人眼葡萄膜黑色素瘤細(xì)胞系M23的增殖和遷移能力[7]。本研究結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染miR-137基因后葡萄膜黑色素瘤細(xì)胞M23細(xì)胞的侵襲能力受到明顯抑制，進(jìn)一步證實(shí)miR-137是葡萄膜黑色素瘤的抑癌基因。

腫瘤細(xì)胞發(fā)生轉(zhuǎn)移的前期條件是細(xì)胞獲得侵襲能力。細(xì)胞發(fā)生侵襲時(shí)失去黏附能力而變得松散利于游走，侵入細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)并分泌MMPs降解ECM，使基底膜產(chǎn)生局部缺損，腫瘤細(xì)胞穿過(guò)這些缺損處進(jìn)入血管，通過(guò)血管在遠(yuǎn)處定植，形成轉(zhuǎn)移灶[15]。腫瘤細(xì)胞分泌的MMPs中，MMP-2和MMP-9是降解ECM的最主要成分，它們?cè)谀[瘤新生血管形成、腫瘤細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移灶的形成過(guò)程中均起重要作用[16,17]。MMP-2和MMP-9在葡萄膜黑色素瘤組織中的分泌水平增加[18]，它們的表達(dá)與葡萄膜黑色素瘤侵襲和轉(zhuǎn)移具有密切的相關(guān)性，兩者分泌表達(dá)增加預(yù)示著患者預(yù)后不良[19～22]。體外實(shí)驗(yàn)顯示葡萄膜黑色素瘤細(xì)胞在惡性特征逆轉(zhuǎn)后，MMP-2等分泌和表達(dá)會(huì)受到抑制[23]。本研究結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染組M23細(xì)胞內(nèi)MMP-2、9蛋白表達(dá)和胞外MMP-2、9分泌水平低于對(duì)照組，提示miR-137可能通過(guò)減低MMP-2和MMP-9表達(dá)而抑制人眼葡萄膜黑色素瘤細(xì)胞的侵襲能力。

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Effect of miRNA-137 transfection on human uveal melanoma cell line invasion

CHENJun-jie1,ZHENGNa-feng,YEZi-ying,LINJun-shan,OURui-zhang,ZENGYu-ting

(1People′sHospitalofZengchengCity,Zengcheng511300,China)

Objective To investigate the effects of miR-137 gene transfection on human uveal malignant melanoma cell lines M23. Methods miR-137 mimics were transfected to M23 by Lipofectamine package LipofectamineTM2000. Cell invasion was detected by transwell invasion assay 18 h after transfection. MMP-2 and MMP-9 proteins expression were investigated by Western blot and ELISA. Results Transwell invasion assay showed that the number of M23 cells in miR-137 mimics group was significantly lower than negative control group. Western blot and ELISA confirmed that miR-137 mimics could significantly inhibit the expressions of MMP-2/-9 protein and secreting. Conclusion miR-137 gene transfection can inhibit the invaion of human uveal malignant melanoma cell by reduce the expression of MMP-2 and MMP-9.

uveal melanoma; invasion; miR-137; matrix metalloproteinase

廣東省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(2014013301)。

陳俊杰(1979-)，男，本科，主治醫(yī)師，研究方向?yàn)檠鄄繍盒阅[瘤浸潤(rùn)及侵襲機(jī)制。E-mail:chenjj163163@163.com

10.3969/j.issn.1002-266X.2015.06.006

R773.3

A

1002-266X(2015)06-0018-03

2014-11-20)