吳媛，周訓(xùn)釗，鐘昌桃，顏魁，韋正波，謝瑩(廣西醫(yī)科大學(xué)研究生學(xué)院，南寧500;廣西醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院; 廣西醫(yī)科大學(xué)醫(yī)學(xué)科學(xué)實驗中心)

裸鼠腋下皮膚切開縫合和穿刺套針注射接種人鼻咽癌細(xì)胞成瘤效果比較

吳媛1，周訓(xùn)釗1，鐘昌桃1，顏魁1，韋正波2，謝瑩3
(1廣西醫(yī)科大學(xué)研究生學(xué)院，南寧530021;2廣西醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院; 3廣西醫(yī)科大學(xué)醫(yī)學(xué)科學(xué)實驗中心)

摘要:目的比較裸鼠腋下皮膚切開縫合和穿刺套針注射接種人鼻咽癌細(xì)胞成瘤效果。方法制備鼻咽癌HONE-1細(xì)胞裸鼠皮下移植瘤塊樣本。將8只BALB/c裸鼠隨機(jī)分為A、B組，各4只。A、B組分別使用皮膚切開縫合接種和穿刺套針接種方法于裸鼠右側(cè)腋下接種細(xì)胞株移植瘤組織塊，比較兩組裸鼠腫瘤出現(xiàn)時間、體積、質(zhì)量。結(jié)果A、B組腫瘤出現(xiàn)時間均為接種后第3天。與B組相比，A組裸鼠較早出現(xiàn)精神萎靡、皮膚粗糙、毛發(fā)光澤不良、食欲不振、活動量減低、脊椎明顯、弓背等狀況。兩組裸鼠體質(zhì)量均有所下降，A組比B組腫瘤生長迅速，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義。A、B組腫瘤質(zhì)量分別為(0.85±0.39)、(0.75±0.30) g，兩組比較，P＞0.05。結(jié)論裸鼠腋下皮膚切開縫合和穿刺套針注射接種人鼻咽癌細(xì)胞均能達(dá)到好的成瘤效果。

關(guān)鍵詞:鼻咽腫瘤;動物試驗?zāi)Ｐ?成瘤;皮膚切開縫合接種;穿刺套針注射接種

鼻咽癌是在中國南方尤其兩廣地區(qū)常見的惡性腫瘤［1］。鼻咽癌臨床樣本裸鼠移植瘤模型的構(gòu)建有利于其發(fā)生發(fā)展機(jī)制的研究，并為鼻咽癌的綜合治療提供良好的動物研究平臺。然而，鼻咽癌本身的臨床特征使獲取的組織樣本量較少，嚴(yán)重影響了移植瘤的存活率，因此選擇適宜的接種方法顯得尤為重要。目前腫瘤組織樣本的皮下接種法包括穿刺套針接種和皮膚切開縫合接種。本研究比較了裸鼠腋下皮膚切開縫合和穿刺套針注射接種人鼻咽癌細(xì)胞成瘤效果，為提高鼻咽癌臨床樣本接種和鼠間傳代成活率奠定基礎(chǔ)。

1　材料與方法

1.1實驗細(xì)胞及動物人鼻咽癌HONE-1細(xì)胞(廣西醫(yī)科大學(xué)耳鼻咽喉頭頸外科學(xué)實驗室提供) ; SPF級雌性BALB/c(nu/nu)裸鼠9只(3～4周齡，體質(zhì)量15 g左右)，由廣西醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供。1.2人鼻咽癌HONE-1細(xì)胞處理人鼻咽癌HONE-1細(xì)胞加入含10%胎牛血清、青霉素和鏈霉素各1×105U/L的IMDM培養(yǎng)基中，放置于37℃、5%CO2、飽和濕度恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每1～2 d換液1次，5～6 d傳代1次。取對數(shù)生長期的HONE-1細(xì)胞，用無血清IMDM培養(yǎng)液制成細(xì)胞懸液，調(diào)整最終細(xì)胞濃度為6×105/mL，使用1 mL注射器，將HONE-1細(xì)胞分別接種于1只原代裸鼠左右兩側(cè)腋窩下，接種量為每只0.1 mL，約含6×106個細(xì)胞。瘤塊約1 cm×1.5 cm左右時，斷頸處死裸鼠，取瘤塊冰上備用。

1.3皮膚切開縫合和穿刺套針注射接種人鼻咽癌細(xì)胞8只傳代裸鼠隨機(jī)分為A、B組，各4只。各組在SPF級環(huán)境下飼養(yǎng)，保持一定的濕度和溫度。所有裸鼠采用1%戊巴比妥鈉0.007 mL/g腹腔注射。75%乙醇全身消毒后，醫(yī)用膠帶將裸鼠四肢固定于一次性墊布。取出裸鼠細(xì)胞株移植瘤塊，放于含青霉素和鏈霉素各1×105U/L磷酸鹽緩沖液(PBS)中清洗，去除包膜。再置于無血清改良型1640培養(yǎng)液中剪切至1 mm×1 mm×1 mm大小，以每只取18塊細(xì)胞株移植瘤組織塊約0.022 g，A、B組分別使用皮膚切開縫合接種和穿刺套針接種方法接種細(xì)胞株移植瘤組織塊于裸鼠右側(cè)腋下。A組使用眼科剪剪開腋下皮膚約0.7 cm并稍撐開皮膚形成接種間隙，將約18塊1 mm直徑的瘤塊放入皮下間隙，再進(jìn)行皮膚縫合; B組使用16號骨穿針吸取2～3塊已剪碎的腫瘤組織，接種裸鼠腋下，骨穿針刺入裸鼠皮下稍擴(kuò)大皮下間隙形成“接種袋”，后將針管內(nèi)瘤塊推出至皮下，徒手固定瘤塊數(shù)秒后再退針，接種約18塊瘤塊后完成接種。接種過程中記錄兩組接種時間。

1.4觀察方法腫瘤出現(xiàn)時間:接種后每天觀察兩組移植瘤組織接種部位皮膚改變、硬結(jié)出現(xiàn)時間等情況，以肉眼可見腫瘤記錄為腫瘤出現(xiàn)時間［2］。裸鼠體質(zhì)量、腫瘤體積:每天觀察兩組裸鼠的營養(yǎng)情況、精神狀態(tài)、皮毛光澤度和腫瘤生長情況，每天定時稱取小鼠體質(zhì)量。待成瘤之后，隔天觀察、測量腫瘤的體積(V)，V=π/6a2b，其中a、b分別為腫瘤的長短徑［3］。腫瘤質(zhì)量:于接種組織15 d后，處死裸鼠，觀察腫瘤外觀質(zhì)地。取瘤體用分析天平稱重。

1.5統(tǒng)計學(xué)方法采用SPSS16.0統(tǒng)計軟件。計量資料以珋x±s表示，組間比較用t檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2　結(jié)果

A、B組腫瘤出現(xiàn)時間均于接種后第3天。與B組相比，A組裸鼠較早出現(xiàn)精神萎靡、皮膚粗糙、毛發(fā)光澤不良、食欲不振、活動量減低、脊椎明顯、弓背等。兩組荷瘤裸鼠體質(zhì)量均有所下降，A組比B組腫瘤生長迅速，詳見表1。兩組裸鼠腫瘤外觀無明顯差別，均呈多結(jié)節(jié)融合的橢球形、球形、分葉狀，表面光滑、平整，質(zhì)地實性;兩組皮下可見豐富的血管網(wǎng)。A、B組腫瘤質(zhì)量分別為(0.85±0.39)、(0.75 ±0.30) g，兩組比較，P＞0.05。A、B組接種時間分別為(47.0±17.3)、(53.3±20.3) min，兩組比較，P ＞0.05。

表1　不同接種時間兩組荷瘤裸鼠體質(zhì)量、腫瘤體積比較(±s)

組別　體質(zhì)量(g)　腫瘤體積(cm3) A 組1 d　15.80±1.78?。? d　14.75±0.73　0.066 8±0.036 7 9 d　13.15±1.30　0.423 6±0.230 0 15 d　14.03±1.00　1.407 1±0.573 1 B組1 d　16.20±0.92?。? d　14.96±0.64　0.082 8±0.002 4 9 d　14.05±1.19　0.364 2±0.245 7 15 d　13.33±1.47　0.934 9±0.553 6

3　討論

鼻咽癌動物模型主要分為誘發(fā)性動物模型、移植性動物模型、轉(zhuǎn)基因和基因敲除動物模型、轉(zhuǎn)移動物模型等4種［4］，其構(gòu)建方法各有優(yōu)缺點。移植瘤模型具有可操作性強(qiáng)，成瘤周期短，并且在一定程度上符合人類腫瘤形成的病理過程等特點，是應(yīng)用最多的腫瘤動物模型構(gòu)建方法［5］。目前認(rèn)為，利用免疫缺陷動物體內(nèi)傳代的方法篩選出不同器官親和性的轉(zhuǎn)移瘤細(xì)胞亞株，是研究腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移機(jī)制較重要的手段之一［6］。1969年，Rygaard等［7］首次在裸鼠體內(nèi)成功移植了人結(jié)腸癌組織，開辟了人腫瘤動物移植模型研究的新途徑和方法。此后，大量不同類型的人腫瘤組織在免疫缺陷動物體內(nèi)獲得造模成功［8～11］，這為研究腫瘤發(fā)病機(jī)理、侵襲轉(zhuǎn)移機(jī)制、腫瘤藥物篩選、免疫治療等提供了基本工具和模型。有研究［12］用大量的鼻咽癌臨床組織成功構(gòu)建出鼻咽癌裸鼠移植瘤模型。動物體內(nèi)腫瘤移植方法主要有組織移植法和細(xì)胞懸液注射法等［13］。文慶蓮等［14］用CNE-1細(xì)胞株比較細(xì)胞懸液接種法、新鮮組織塊接種法、凍存組織塊和細(xì)胞勻漿接種法，發(fā)現(xiàn)新鮮組織塊成瘤率為100%，明顯優(yōu)于其他方法。我們結(jié)合前期預(yù)實驗也發(fā)現(xiàn)組織接種法比較實用，操作簡單，能很好保持人癌生物學(xué)特性而且成功率較高。本課題組前期在利用鼻咽癌臨床樣本構(gòu)建廣西地區(qū)人鼻咽癌裸鼠移植瘤過程中發(fā)現(xiàn)，皮膚切開縫合接種成瘤率為78.7% (37/47)，穿刺套針接種成瘤率為52.8%(19/36)。但每次實驗中存在臨床鼻咽癌活檢樣本惡性程度不同、腫瘤組織大小不一、裸鼠狀態(tài)不同等因素，難以準(zhǔn)確地比較兩種接種方法對構(gòu)建移植瘤的影響。因此，本研究以BALB/c裸鼠為研究對象，選擇穿刺套針接種和皮膚切開縫合接種來建立皮下移植瘤模型。

本實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)，穿刺套針接種和皮膚切開縫合接種均在3 d左右成瘤，成瘤率100%。皮膚切開縫合接種和穿刺套針接種的裸鼠瘤塊均生長迅速，且前者腫瘤組織較后者生長迅速，可能由于皮膚切開縫合接種對腫瘤組織樣本的擠壓較少，更好地保留了原樣本的生物活性，提高了腫瘤組織對移植區(qū)微環(huán)境的適應(yīng)能力。但由于例數(shù)限制，兩組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義。皮膚切開縫合接種比穿刺套針接種時間短、利于操作，但由于皮膚切開及后續(xù)縫合操作對裸鼠機(jī)體損傷略大，體質(zhì)量下降較明顯，不利于體弱裸鼠的存活，但經(jīng)過10 d左右可逐漸恢復(fù)。本研究結(jié)果可見，兩組接種后體質(zhì)量均下降，皮膚切開縫合接種組更明顯，但后期略有上升，可能為接種操作對裸鼠造成了創(chuàng)傷，影響了裸鼠進(jìn)食和活動，因此保證裸鼠的營養(yǎng)和生長亦是成瘤的關(guān)鍵。

綜上所述，裸鼠腋下皮膚切開縫合和穿刺套針注射接種人鼻咽癌細(xì)胞均能達(dá)到好的成瘤效果。

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Comparison of tumorigenic effect between inoculating method of slicing subaxillary skin and suturing and method of adopting paracentesis trocar of human nasopharyngeal carcinoma on nude mice

WU Yuan1，ZHOU Xun-zhao，ZHONG Chang-tao，YAN Kui，WEI Zheng-bo，XIE Ying
(1 Graduate School of Guangxi Medical University，Nanning 530021，China)

Abstract:ObjectiveTo compare the tumorigenic effect between the inoculating method of slicing the subaxillary skin and suturing and the method of adopting the paracentesis trocar of human nasopharyngeal carcinoma on the nude mice.Methods The samples of subcutaneous transplanted tumors in nude mice were established with nasopharyngeal carcinoma HONE-1 cells.Eight BALB/c nude mice were randomly divided into two groups: group A and B，4 mice in each group.The right subaxillary skin of each mouse was subcutaneously inoculated with the tissue masses through slicing the skin，or adopting the paracentesis trocar in the two groups，respectively.The occurrence time，volume and mass of tumor in each group were compared.Results The occurrence time of tumor in each group was 3 days after being inoculated.Compared with group B，the occurrence time of dispirited mind，coarse skin，shineless hair，loss of appetite，low activity，distinct spinal column，hunched backs and other conditions were earlier in the group A.The weight of mice was decreased in both groups，the growth of tumor in the group A was faster than that of the group B，but no significant difference was found between these two groups.The mass of tumor in the group A and group B was (0.85±0.39) g and (0.75±0.30) g，respectively; and no significant difference was found between these two groups (P＞0.05).ConclusionBoth the inoculating method of slicing the subaxillary skin and suturing and the method of adopting the paracentesis trocar of human nasopharyngeal carcinoma on the nude mice could receive finely tumorigenic effect.

Key words:nasopharyngeal neoplasms; animal experimental model; tumorigenicity; inoculating method of slicing and suturing the skin; inoculating method of adopting the paracente sis trocar

(收稿日期:2015-02-04)

通信作者簡介:謝瑩(1978-)，女，博士，副教授，研究方向為鼻咽癌綜合防治研究。E-mail: xieying2002@ hotmail.com

作者簡介:第一吳媛(1989-)，女，碩士研究生在讀，研究方向為鼻咽癌綜合防治研究。E-mail: 540282860@ qq.com

基金項目:國家自然科學(xué)基金資助項目(81160329) ;廣西區(qū)域性高發(fā)腫瘤早期防治研究重點實驗室研究項目(GK2013-B-02) ;廣西自然科學(xué)基金資助項目(2014GXNSFAA118187)。

文章編號:1002-266X(2015) 19-0005-03

文獻(xiàn)標(biāo)志碼:A

中圖分類號:R739.6

doi:10.3969/j.issn.1002-266X.2015.19.002