鄭海澤，張紅芳

(山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院小麥研究所，山西 臨汾 041000)

植物MicroRNA研究進(jìn)展

鄭海澤，張紅芳

(山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院小麥研究所，山西 臨汾 041000)

MicroRNA，簡(jiǎn)稱(chēng)miRNA，是一類(lèi)長(zhǎng)度約為22個(gè)核苷酸的內(nèi)源單鏈非編碼小分子RNA，在生物發(fā)育過(guò)程中起著重要作用。筆者詳細(xì)介紹了植物miRNA的發(fā)現(xiàn)與形成過(guò)程，包括轉(zhuǎn)錄、加工成熟及功能復(fù)合體裝配3個(gè)主要步驟。分析了miRNA在植物生長(zhǎng)發(fā)育、脅迫適應(yīng)及自身形成途徑三方面的調(diào)控作用。

植物MicroRNA;MicroRNA的形成;調(diào)控機(jī)制

MicroRNA，簡(jiǎn)稱(chēng)miRNA，是一類(lèi)長(zhǎng)度約為22個(gè)核苷酸(nucleotide，nt)的內(nèi)源單鏈非編碼小分子RNA［1］.1993年，Lee等［2］在秀麗隱桿線蟲(chóng)(Caenorhabditis elegans)中發(fā)現(xiàn)了第1個(gè)能階段性調(diào)控胚胎后期發(fā)育的內(nèi)源性小分子 RNA-lin-4，揭開(kāi)了miRNA研究的序幕。7 a后，Reinhart等［3］在線蟲(chóng)中又發(fā)現(xiàn)了第2個(gè)調(diào)控時(shí)序性發(fā)育的小分子RNA-let-7.lin-4和let-7長(zhǎng)度都約為22 nt，作用時(shí)間也是暫時(shí)性的。所以，當(dāng)時(shí)被命名為小分子時(shí)序 RNA (small temporal RNA，stRNA).2001年，來(lái)自美、德等國(guó)的3個(gè)不同研究小組通過(guò)大規(guī)模的克隆和功能研究，發(fā)現(xiàn)生物體內(nèi)存在著大量類(lèi)似的小分子RNA，并將它們統(tǒng)一命名為miRNA［4-6］.在最新的miRBase登記的miRNA數(shù)據(jù)庫(kù)中，人類(lèi)、小鼠、擬南芥和水稻分別含有985，767，215和452種miRNA.

miRNA等調(diào)控小分子RNA的發(fā)現(xiàn)，使人們對(duì)RNA調(diào)控基因表達(dá)的功能有了全新的認(rèn)識(shí)。這類(lèi)調(diào)控小RNA在生物體內(nèi)以嶄新的層面控制著基因表達(dá)過(guò)程，在發(fā)育、細(xì)胞增殖、凋亡、抵御環(huán)境脅迫等諸多方面發(fā)揮重要作用［7］。從目前所積累的實(shí)驗(yàn)證據(jù)可以肯定，miRNA等小分子RNA涉及到了整個(gè)細(xì)胞水平的幾乎所有事件。

1 植物miRNA的形成過(guò)程

miRNA并不是由基因組直接轉(zhuǎn)錄出來(lái)，它在生物體內(nèi)的產(chǎn)生是一個(gè)逐步的過(guò)程，包括轉(zhuǎn)錄、加工成熟及功能復(fù)合體裝配3個(gè)主要步驟。

1.1 miRNA初級(jí)轉(zhuǎn)錄本的形成

通常位于蛋白編碼基因間區(qū)域的植物內(nèi)源miRNA基因在RNA聚合酶Ⅱ的作用下轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生含有莖環(huán)結(jié)構(gòu)的miRNA初級(jí)轉(zhuǎn)錄本(pri-miRNA)。

1.2 miRNA加工

DCL1(一種RNaseⅢ家族的Dicer同源物)在細(xì)胞核內(nèi)切割pri-miRNA莖環(huán)結(jié)構(gòu)中遠(yuǎn)離或靠近環(huán)端的雙鏈位點(diǎn)，釋放出大小約為70 bp～300 bp的miRNA前體(pre-miRNA)。此過(guò)程還需要雙鏈RNA結(jié)合蛋白HYPONASTIC LEAVES 1(HYL1)和C2H2鋅指蛋白SERRATE(SE)的協(xié)助，它們?cè)诩?xì)胞核的加工中心D-body中與DCL1相互作用，共同行使功能［8］。隨后DCL1在細(xì)胞核內(nèi)對(duì)pre-miRNA進(jìn)行第2步切割，形成1個(gè)具有不完全配對(duì)的小分子雙鏈RNA復(fù)合體。此復(fù)合體既包含了成熟的miRNA鏈，也包含了源于pre-miRNA且與成熟miRNA配對(duì)的反義鏈，稱(chēng)為miRNA*鏈［7］。

1.3 miRNA功能復(fù)合體裝配

miRNA:miRNA*互補(bǔ)雙鏈在甲基轉(zhuǎn)移酶Hua Enhancer 1(HEN1)的作用下3'末端的核苷酸甲基化［9］，同時(shí)在Exportin-5的同源物HASTY(HST)的作用下運(yùn)出細(xì)胞核，轉(zhuǎn)移到RNA誘導(dǎo)的沉默復(fù)合體(RNA-induced silencing complex，RISC)中。RISC復(fù)合體蛋白中含有Argonaute(AGO)和RNA解旋酶，miRNA:miRNA*互補(bǔ)雙鏈中的一條單鏈可以選擇性結(jié)合到RISC上成為成熟miRNA，而另一條單鏈則被立即降解。

2 植物miRNA的作用機(jī)制

miRNA通過(guò)對(duì)靶mRNA直接切割或者翻譯抑制這兩種作用機(jī)制來(lái)負(fù)調(diào)控靶基因的表達(dá)。理想的植物miRNA靶標(biāo)與miRNA之間互補(bǔ)錯(cuò)配數(shù)一般不超過(guò)3個(gè)，且第10，11位堿基不允許有錯(cuò)配，因?yàn)榍悬c(diǎn)的位置恰好位于該位置之間。靶mRNA被miRNA介導(dǎo)切割之后，其較為穩(wěn)定的3'切割產(chǎn)物可以通過(guò)5'-RACE的方法得到，從而精確定位mRNA的切割位點(diǎn)。

最近的研究表明，植物miRNA不僅能切割靶mRNA，也能抑制翻譯。最早發(fā)現(xiàn)的典型個(gè)例是擬南芥的miR172，它與靶標(biāo)基因APETALA2(AP2)的作用位點(diǎn)位于該基因編碼區(qū)，除有1個(gè)堿基的差異外，其它堿基完全互補(bǔ)。但在擬南芥花的發(fā)育過(guò)程中，miR172介導(dǎo)對(duì)靶基因的翻譯抑制，而不是直接切割調(diào)控［6］。miR172并不是植物miRNA中的一個(gè)特例，近來(lái)Voinnet研究小組通過(guò)遺傳學(xué)手段篩選出擬南芥中一系列miRNA活性缺陷(miRNA-action deficient，mad)突變體，發(fā)現(xiàn)大多數(shù)miRNA都具有切割靶標(biāo)和翻譯抑制兩種作用機(jī)制，并且切割與抑制機(jī)制是協(xié)同進(jìn)行的。對(duì)靶mRNA進(jìn)行Northern雜交分析，大多數(shù)情況下既能檢測(cè)到未被切割的靶mRNA，也能檢測(cè)到較小的切割產(chǎn)物，表明植物miRNA一方面可以切割靶標(biāo)，另一方面可以對(duì)于未被切割的靶mRNA進(jìn)行翻譯抑制，最終的蛋白水平抑制效果是兩種作用的綜合，解釋了為什么以前發(fā)現(xiàn)miRNA對(duì)靶標(biāo)蛋白水平抑制效果要高于轉(zhuǎn)錄水平［9］。miRNA和靶標(biāo)的作用位點(diǎn)無(wú)論是在編碼區(qū)，還是在3'或5'UTR區(qū)，似乎并不影響靶標(biāo)切割和翻譯抑制這兩種相互作用的強(qiáng)弱。

3 植物miRNA的生理功能

3.1 調(diào)控植物生長(zhǎng)發(fā)育

對(duì)植物miRNA在生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中的調(diào)控作用已有大量深入的研究報(bào)道，這是因?yàn)橄喈?dāng)一部分miRNA的靶標(biāo)是在植物生長(zhǎng)發(fā)育或細(xì)胞分化過(guò)程中起重要作用的轉(zhuǎn)錄因子。如，miR165/166通過(guò)調(diào)節(jié)3個(gè)同型亮氨酸拉鏈結(jié)構(gòu)域(homeodomain leucine zipper，HD-Zip)轉(zhuǎn)錄因子PHB/PHV/REV的表達(dá)，決定葉子近軸與離軸細(xì)胞的分化方向。如果這3個(gè)基因與miR165/166的作用區(qū)域發(fā)生突變從而逃脫miR165/166的調(diào)控，那么突變體植株葉的極性會(huì)出現(xiàn)缺陷。研究人員通過(guò)正向遺傳學(xué)的方法在擬南芥中找到了編碼miR319的JAW基因，該基因突變的植株在葉片形狀和曲率方面都極不均勻，表明miR319可以通過(guò)降解TCP類(lèi)轉(zhuǎn)錄因子家族的mRNA來(lái)調(diào)控?cái)M南芥葉子的生長(zhǎng)發(fā)育［10］。miR164的靶標(biāo)是NAC類(lèi)轉(zhuǎn)錄因子家族，包括CUC1和CUC2等，在miR164表達(dá)受到抑制的突變體中，花瓣的數(shù)量較野生型明顯增多，提示miR164通過(guò)調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄因子CUC1和CUC2等的表達(dá)水平來(lái)控制花瓣的數(shù)量。最近的研究發(fā)現(xiàn)，miR164還能調(diào)控與植物葉片衰老相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子ORE1，過(guò)表達(dá)miR164的轉(zhuǎn)基因擬南芥植株葉片衰老過(guò)程被明顯延緩［13］?？梢哉f(shuō)，植物miRNA幾乎參與調(diào)控植物所有重要的發(fā)育過(guò)程，包括葉的發(fā)育、器官極性、花的形態(tài)建成、開(kāi)花時(shí)間、auxin信號(hào)傳導(dǎo)等。

3.2 調(diào)控植物適應(yīng)環(huán)境脅迫

1)適應(yīng)營(yíng)養(yǎng)缺乏環(huán)境。在土壤或者含2 mM SO42-培養(yǎng)基中生長(zhǎng)的擬南芥中，miR395的表達(dá)水平很低，用Northern雜交幾乎檢測(cè)不到。而當(dāng)培養(yǎng)基中SO42-濃度從0.2 mM降低到0.02 mM時(shí)，miR395的表達(dá)量迅速升高，導(dǎo)致了靶基因APS量的降低。由于APS編碼ATP硫酸化酶，用來(lái)催化無(wú)機(jī)硫酸鹽消化的第一步反應(yīng)，在低硫酸鹽環(huán)境中它的表達(dá)被miR395所下調(diào)，體現(xiàn)了植物對(duì)低硫酸鹽環(huán)境的適應(yīng)［14］。另外一個(gè)類(lèi)似的例子是擬南芥的miR399，它在正常生長(zhǎng)環(huán)境下幾乎不表達(dá)，而在缺乏無(wú)機(jī)磷酸鹽環(huán)境中受到誘導(dǎo)，引起靶基因UBC表達(dá)量下降。UBC編碼一個(gè)泛素結(jié)合酶，它能夠使磷轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白AtPT1泛素化而降解。因此，UBC表達(dá)量下降會(huì)導(dǎo)致AtPT1的增加，從而有利于植物積累更多的磷酸鹽來(lái)應(yīng)對(duì)磷元素缺乏。

2)應(yīng)對(duì)氧化脅迫。擬南芥miR398的靶標(biāo)是2個(gè)CSD基因，均編碼銅/鋅超氧化物歧化酶，能將超氧陰離子轉(zhuǎn)化成過(guò)氧化氫(H2O2)，在清除活性氧(ROS)自由基過(guò)程中起關(guān)鍵作用［11-12］。擬南芥植株在高強(qiáng)度光照、重金屬和甲基木精等氧化脅迫處理?xiàng)l件下，miR398的表達(dá)受到抑制，而CSD的表達(dá)明顯上升。過(guò)量表達(dá)miR398抗性形式的CSD基因能使轉(zhuǎn)基因植株提高對(duì)于氧化脅迫的耐受性。

3)其它非生物脅迫方面。低溫、干旱、高鹽［7］、紫外輻射［8］和機(jī)械損傷［15］等脅迫條件都會(huì)引起植物體內(nèi)多種miRNA表達(dá)量的變化，暗示miRNA可能參與多種非生物脅迫的應(yīng)答。

4)生物脅迫方面。擬南芥的miR393能通過(guò)負(fù)調(diào)控靶基因TIR1，AFB(均為auxin受體)表達(dá)，從而抑制auxin信號(hào)通路介導(dǎo)植株抗細(xì)菌抗性，過(guò)表達(dá)miR393能提高植株抵御細(xì)菌生長(zhǎng)的能力。

植物miRNA還參與了自身形成途徑的調(diào)控。在植物體內(nèi)，miRNA的表達(dá)必須受到精確的調(diào)控。因?yàn)榧?xì)微的表達(dá)量差異也可能會(huì)引起一系列連鎖反應(yīng)，從而改變植物的生理狀態(tài)。因此，在植物miRNA的形成過(guò)程中，每一個(gè)過(guò)程都會(huì)受到嚴(yán)格的調(diào)控，比如，miRNA基因的轉(zhuǎn)錄、DCL1的加工、RISC中的裝配等等。研究發(fā)現(xiàn)，植物miRNA形成過(guò)程中2個(gè)關(guān)鍵的基因DCL1和AGO1分別受到miR162和miR168的調(diào)控。DCL1參與了 miR162的產(chǎn)生，miR162則介導(dǎo)了DCL1的反饋調(diào)節(jié);AGO1能穩(wěn)定miR168，miR168與 AGO1結(jié)合后又能切割 AGO1 mRNA.miR162/DCL1和miR168/AGO1這種相互緊密調(diào)節(jié)方式確保了它們?cè)隗w內(nèi)處于動(dòng)態(tài)平衡［9］。

4 展望

miRNA的發(fā)現(xiàn)，是RNA研究領(lǐng)域的重要突破，為人們提供了一種全新的視角來(lái)認(rèn)識(shí)生物基因和基因表達(dá)調(diào)節(jié)的本質(zhì)。在利用傳統(tǒng)方法研究基因時(shí)，注意力不能再僅僅局限在蛋白質(zhì)和基因上面，對(duì)植物miRNA調(diào)控基因的錯(cuò)綜復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)目前有了一定的認(rèn)識(shí)。就闡明miRNA與基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)來(lái)說(shuō)，還需進(jìn)一步詳細(xì)的了解。隨著研究的深入，miRNA將在生命起源和早期進(jìn)化、基因復(fù)雜性等發(fā)育過(guò)程中產(chǎn)生更為重要的影響，將人類(lèi)對(duì)自然的認(rèn)識(shí)提高到新的高度。

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Research Progress on MicroRNA in Plants

Zheng Haize，Zhang Hongfang
(Wheat Research Institute，Shanxi Academy of Agricultural Sciences，Linfen 041000，China)

MicroRNA(miRNA)is small RNA of 22 nucleotides(nt)in length that play important roles in regulating gene expression and biological processes.This review tried to have a brief introduction on the progresses of miRNA discovery and formation，including three steps of transcription，assemble processing and function complex processing.Regulating effect of miRNA in growth and development，stress adaption，its formation ways was analyzed.

MicroRNA in plant;MicroRNA formation;Regulatory mechanism

Q943

A

1007-726X(2015)03-0037-03

2015-07-01

山西省科技攻關(guān)項(xiàng)目(20150311001-5)

鄭海澤(1964— )，男，山西襄汾人，1986年畢業(yè)于山西農(nóng)業(yè)大學(xué)，副研究員。