蔡皓偉，高麗娜，周少旦，郭潔，臧大維( 天津醫(yī)科大學(xué)一中心臨床學(xué)院，天津0092;2中國人民解放軍第四六四醫(yī)院; 天津市第一中心醫(yī)院)

缺血性腦卒中患者CYP2C19基因多態(tài)性與氯吡格雷抗血小板作用的關(guān)系

蔡皓偉1，2，高麗娜1，周少旦1，郭潔3，臧大維3
( 1天津醫(yī)科大學(xué)一中心臨床學(xué)院，天津300192;2中國人民解放軍第四六四醫(yī)院; 3天津市第一中心醫(yī)院)

摘要:目的檢測缺血性腦卒中患者CYP2C19基因多態(tài)性，并觀察氯吡格雷對不同CYP2C19基因型患者的抗血小板聚集作用。方法選擇缺血性腦卒中患者68例，均連續(xù)口服氯吡格雷75 mg/d，共7 d。抽取空腹靜脈血，采用聚合酶鏈反應(yīng)-限制性片段長度多態(tài)性法檢測CYP2C19* 2、CYP2C19* 3基因型;血栓彈力圖法檢測不同基因型患者血小板聚集抑制率，生化分析儀檢測患者血糖及血脂。結(jié)果68例患者中，CYP2C19野生型37例，突變型31例。不同基因型患者性別、年齡、吸煙飲酒情況及血糖、血脂水平比較，P均＞0.05;野生型患者血小板聚集抑制率為40.97%±2.81%，突變型患者為31.36%±2.90%，兩者比較P＜0.05。結(jié)論CYP2C19基因突變的缺血性腦卒中患者使用氯吡格雷抗血小板聚集的作用降低。

關(guān)鍵詞:缺血性卒中; CYP2C19基因;氯吡格雷;氯吡格雷抵抗;血栓彈力圖

氯吡格雷是一種前體藥物，需經(jīng)CYP2C19代謝后成為活性代謝產(chǎn)物，才能發(fā)揮抗血小板聚集作用。然而，一部分患者在使用常規(guī)劑量氯吡格雷時，其抗血小板聚集效果并不明顯，腦卒中復(fù)發(fā)率呈升高趨勢［1～3］。研究指出，有11%～44%的患者存在氯吡格雷抵抗，即服用氯吡格雷后血小板抑制率＜50%，其機(jī)制尚不清楚［4］。本研究采用血栓彈力圖( TEG)法檢測缺血性腦卒中患者血小板聚集抑制率，并探討CYP2C19基因多態(tài)性與氯吡格雷抗血小板作用的關(guān)系。

1　資料與方法

1.1臨床資料選取2014年3～7月天津第一中心醫(yī)院收治的缺血性腦卒中患者68例，男34例、女34例，年齡45～91歲;合并高血壓31例，糖尿病14例，高脂血癥33例;有吸煙史27例，飲酒史39例。納入標(biāo)準(zhǔn):符合全國第四屆腦血管病學(xué)術(shù)會議確定的缺血性腦卒中診斷標(biāo)準(zhǔn)，并經(jīng)頭顱CT或MRI證實。排除標(biāo)準(zhǔn):①腦出血、腦梗死后合并出血者;②合并凝血功能障礙、短暫性腦缺血發(fā)作、腦靜脈血栓形成、腦腫瘤、神經(jīng)系統(tǒng)感染、神經(jīng)變性疾病、嚴(yán)重肝腎疾病者。

1.2 CYP2C19* 2和CYP2C19* 3基因型檢測采用聚合酶鏈反應(yīng)-限制性片段長度多態(tài)性法。抽取空腹靜脈血2 mL于EDTA抗凝管中，按照血液基因組小量提取試劑盒說明書提取DNA。CYP2C19* 2 和CYP2C19* 3引物序列均由長沙三濟(jì)生物科技有限公司提供。PCR反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)酶切后，進(jìn)行2%瓊脂糖凝膠電泳，根據(jù)電泳條帶區(qū)分基因型。采用全自動凝膠成像系統(tǒng)觀察并攝影，由天津市第一中心醫(yī)院臨床基因擴(kuò)增實驗室采用焦磷酸測序法進(jìn)行CYP2C19基因型測序。

1.3血小板聚集抑制率檢測患者口服氯吡格雷75 mg/d，連續(xù)服用7 d后。抽取患者空腹靜脈血各2 mL，分裝于肝素化抗凝管和枸櫞酸抗凝管中，采用TEG法檢測血小板聚集抑制率，2 h內(nèi)完成檢測。

1.4血糖及血脂檢測患者入院后采集空腹靜脈血，離心后取血清，生化分析儀檢測血清TC、TG、FBG，均由天津市第一中心醫(yī)院檢驗科完成。

1.5統(tǒng)計學(xué)方法采用Prism5.01( CA)統(tǒng)計軟件。計量資料以珋x±s表示，組間比較采用t檢驗或Welch's校正檢驗;計數(shù)資料以率表示，組間比較采用Fisher's確切檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2　結(jié)果

PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)過酶切后，CYP2C19* 2產(chǎn)物片段為289 bp，CYP2C19* 3產(chǎn)物片段為138 bp。PCR產(chǎn)物電泳檢測分析后，條帶清楚、單一。CYP2C19* 2位點野生型( GG) 42例、突變型( GA + AA) 26例，CYP2C19* 3位點野生型63例、突變型5例。根據(jù)檢測結(jié)果，將患者分為CYP2C19野生型(兩

位點同為野生型) 37例，突變型(其中一位點為突變型) 31例。野生型患者男17例、女20例，年齡45～87 ( 63.72±10.64)歲;吸煙12例，飲酒21例; FPG ( 6.68±0.91) mmol/L，TG( 1.68±0.28) mmol/L，TC ( 3.99±0.30) mmol/L。突變型患者男17例、女14例，年齡51～91 ( 66.25±8.91)歲;吸煙15例，飲酒18例; FPG( 6.78±0.89) mmol/L，TG( 1.40±0.24) mmol/L，TC( 4.92±0.48) mmol/L。兩組性別、年齡、血糖、血脂比較，P均＞0.05。

野生型患者血小板抑制率為40.97%± 2.81%，突變型患者為31.36%±2.90%，兩者比較，P＜0.05。

3　討論

近年來越來越多的研究表明，氯吡格雷抵抗是腦卒中復(fù)發(fā)的危險因素之一［3，4］。氯吡格雷目前被廣泛用于缺血性卒中的二級預(yù)防，但其臨床療效存在個體差異［5］。氯吡格雷抵抗與血糖、血脂代謝及藥物相互作用等因素有關(guān)，有研究認(rèn)為，質(zhì)子泵抑制劑能夠增加氯吡格雷抵抗［6］。CYP2C19基因多態(tài)性改變與氯吡格雷的抗血小板效果減弱有關(guān)［7，8］。CYP2C19存在于肝臟微粒體中，由490個氨基酸殘基組成，相對分子質(zhì)量約為56 kD，其編碼基因定位于染色體10q24，包含9個外顯子和8個內(nèi)含子。CYP2C19* 2和CYP2C19* 3基因型的外顯子突變，使終止密碼提前，導(dǎo)致蛋白質(zhì)合成終止，CYP2C19活性喪失［9］。

關(guān)于血小板聚集抑制率的檢測方法不斷發(fā)展，主要為TEG法、光密度比濁( LAT)法和Verifynow，但尚無統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)。TEG法可以檢測服用不同抗血小板藥物后機(jī)體的反應(yīng)情況，其中二磷酸腺苷誘導(dǎo)的血小板聚集抑制率檢測可反映機(jī)體對氯吡格雷、雙嘧達(dá)莫和血小板糖蛋白受體Ⅱb/Ⅲa抑制劑的反應(yīng)性，而花生四烯酸誘導(dǎo)的血小板聚集抑制率可反映機(jī)體對阿司匹林的反應(yīng)性。TEG檢測法敏感度高，但是干擾因素較多，實驗中通過排除干擾因素及不定期校正以確保數(shù)據(jù)的穩(wěn)定性。

本研究結(jié)果表明，缺血性腦卒中患者CYP2C19基因存在多態(tài)性。雖然有學(xué)者認(rèn)為，糖尿病、高脂血癥、高膽固醇血癥以及BMI等都可能引起氯吡格雷抗血小板作用的療效差異［10，11］，但本研究野生型和突變型患者在性別、年齡、FPG、血脂方面比較無統(tǒng)計學(xué)差異，排除了上述因素對患者氯吡格雷抗血小板作用的影響。CYP2C19基因野生型患者血小板聚集抑制率明顯高于突變型患者。因此，檢測CYP2C19基因突變使氯吡格雷抗血小板聚集作用下降，從而降低了氯吡格雷在卒中預(yù)防和治療中的作用，與Jeong等［12～14］的研究結(jié)果一致。但本研究樣本量較小，關(guān)于腦卒中復(fù)發(fā)與CYP2C19基因多態(tài)性的關(guān)系仍需擴(kuò)大樣本進(jìn)一步研究。

參考文獻(xiàn):

［1］彭斌，孫佳，倪俊，等.住院患者缺血性卒中復(fù)發(fā)風(fēng)險趨勢分析［J］.中華神經(jīng)科雜志，2010，43( 12) : 820-823.

［2］李沛.缺血性卒中復(fù)發(fā)患者血漿ADMA水平變化的臨床研究［D］.蘇州大學(xué)，2013: 1-40.

［3］Mierzeeki A，Bukowska H，Kloda K，et al.Homocysteine and metabolie risk factors in individuals with family history of premature ischemic stroke［J］.Pol Arch Med Wewn，2013，123 ( 6 ) : 282-288.

［4］蔣萍，臧大維.急性腦梗死患者M(jìn)THFR基因多態(tài)性與血漿同型半胱氨酸水平的關(guān)系［J］.山東醫(yī)藥，2014，54( 8) : 1-4.

［5］張文婷，陳茂剛，張敏，等.缺血性腦卒中復(fù)發(fā)與相關(guān)因素分析［J］.中華老年心腦血管病雜志，2012，14( 2) : 168-171.

［6］Lemesle G，Delhaye C，Sudre A，et al.Impact of highloading and maintenance dose of clopidogrel within the first 15 days after percutaneous coronary intervention on patient outcome［J］.Am Heart J，2009，57( 2) 375-382.

［7］Kim IS，Choi BR，Jeong YH，et al.The CYP2C19 * 2 and CYP2C19* 3 polymorphisms are associated with high post-treatment platelet reactivity in Asian patients with acute coronary syndrome［J］.J Thromb Haemost，2009，7( 5) : 897-899.

［8］Hwang SJ，Jeong YH，Kim IS，et al.The cytochrome 2C19* 2 and * 3 alleles attenuate response to clopidogrel similarly in East Asian patients undergoing elective percutaneous coronary intervention［J］.Thromb Res，2011，127( 1) : 23-28.

［9］De Morais SM，Wilkinson GR，Blaisdell J，et al.Identification of a new genetic defect responsible for the polymorphism of ( S) -mephenytoin metabolism in Japanese［J］.Mol Pharmacol，1994，46 ( 4) : 594-598.

［10］Sibbing D，yon Beckerath O，Schomig A，et a1.Impact of body mass index onplatelet aggregation after administration of a high loading dose of 600 mg of clopidogrel before percutaneous coronary intervention［J］.Am J Cardiol，2007，100( 2) : 203-205.

［11］Singla A，Antonino MJ，Bliden KP，et a1.The relation between platelet reactivity and glycemic control in diabetic patients with cardiovascular disease on maintenance aspirin and clopidogrel therapy ［J］.Am Heart J，2009，158( 5) : 784.

［12］Jeong TD，Kim SM，Kim HJ，et al.CYP2C19 genotype and early ischemic lesion recurrence in stroke patients treated with clopidogrel［J］.J Stroke Cerebrovasc Dis，2015，24( 2) : 440-446.

［13］Spokoyny I，Barazangi N，Jaramillo V，et al.Reduced clopidogrel metabolism in a multiethnic population: prevalence and rates of recurrent cerebrovascular events［J］.J Stroke Cerebrovasc Dis，2014，23( 4) : 694-698.

［14］陳枝挺，趙振華，劉昌云，等.福建漢族腦梗死患者氯吡格雷抵抗的影響因素及與CYP2C19基因多態(tài)性的關(guān)系［J］.中國腦血管病雜志，2014，11( 2) : 74-79，83.

收稿日期:( 2015-01-18)

通信作者:臧大維，E-mail: dawei656@163.com

文章編號:1002-266X( 2015) 28-0049-02

文獻(xiàn)標(biāo)志碼:B

中圖分類號:R743.3

doi:10.3969/j.issn.1002-266X.2015.28.019