張堯，何耀華(上海市第六人民醫(yī)院，上海200233)

Sclerostin對骨形態(tài)發(fā)生蛋白2誘導(dǎo)的人骨髓間充質(zhì)干細胞成骨分化的影響

張堯，何耀華
(上海市第六人民醫(yī)院，上海200233)

摘要:目的探討Sclerostin對骨形態(tài)發(fā)生蛋白2( BMP-2)誘導(dǎo)的人骨髓間充質(zhì)干細胞( BMSCs)成骨分化的影響。方法取兩位男性車禍傷致截肢患者的骨髓組織進行體外人BMSCs培養(yǎng)。將培養(yǎng)細胞隨機分為三組，1組未做轉(zhuǎn)染( Mock)，2組轉(zhuǎn)染對照siRNA，3組轉(zhuǎn)染Sclerostin(骨形態(tài)發(fā)生蛋白抑制劑) siRNA，均采用含有0.1 μg/mL BMP-2的成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基培養(yǎng)。分別在誘導(dǎo)培養(yǎng)的第0、3、7天，采用CCK-8法檢測各組細胞活性，采用CyQUANT細胞增殖檢測試劑盒檢測DNA含量。在培養(yǎng)的第14天，采用RT-PCR方法檢測骨相關(guān)基因骨鈣素( OCN)、骨鈣蛋白( OC)及骨橋蛋白( OPN)，采用堿性磷酸酶( ALP)分析試劑盒進行ALP活性分析，采用BCA蛋白檢測試劑盒檢測細胞蛋白含量。結(jié)果在誘導(dǎo)培養(yǎng)的第3、7天，3組細胞增殖活性、DNA含量均高于1、2組( P均＜0.05)。在誘導(dǎo)培養(yǎng)的第14天，3組OCN、OC、OPN mRNA相對表達量及蛋白含量均高于1、2組( P均＜0.05) ; 1、2、3組ALP活性分別為1.00%±0.08%、1.12%±0.09%、2.50%±0.03%，3組高于1、2組( P均＜0.05)。結(jié)論抑制Sclerostin表達可以促進BMP-2誘導(dǎo)的人BMSCs的活性及成骨分化能力。

關(guān)鍵詞:成骨分化;人骨髓間充質(zhì)干細胞;骨形態(tài)發(fā)生蛋白2; Sclerostin;堿性磷酸酶

Effect of Sclerostin on BMP-2-induced osteogenesis of human mesenchymal stem cells

ZHANG Yao，HE Yao-hua
( The Sixth People's Hospital of Shanghai，Shanghai 200233，China)

Abstract:Objective To investigate the influence of Sclerostin on bone morphogenetic protein 2 ( BMP-2) -induced osteogenic differentiation of human bone marrow-derived mesenchymal stem cells ( BMSCs).Methods The bone marrow tissues taken from two males receiving amputation because of traffic accident were used to culture the human BMSCs in vitro.The cultured cells were randomly divided into three groups: groups 1，2 and 3.The cells in the group 1 did not receive transfection ( Mock)，the cells in the group 2 were transfected with control siRNA，and the cells in the group 3 were transfected with Sclerostin siRNA ( BMPs inhibitor).Meanwhile，the osteoblasts were cultured with 0.1 μg/mL BMP-2.CCK-8 assay was used to detect the activities of the cells on the 0，3rd and 7th day of induction，and the content of DNA was detected by CyQUANT cell proliferation assay kit.On the 14th day of culture，the expression levels of osteocalcin ( OCN)，osteocalcin ( OC) and osteopontin ( OPN) were detected by using RT-PCR，the alkaline phosphatase ( ALP) analysis kit was used to analyze the activity of ALP，and the BCA protein assay reagent kit was used to analyze the cell protein content.Results On the 3rd and 7th day of culture，the proliferation activity and total DNA content of group 3 were higher than those of the groups 1 and 2 ( all P＜0.05).On the 14th day of culture，the relative expression levels of OCN，OC and OPN mRNA and total protein content were higher than those of the groups 1 and 2 ( all P＜0.05).The activities of ALP in the groups 1，2 and 3 were respectively 1.00%±0.08%，1.12%±0.09% and 2.50%±0.03%，and group 3 was higher than group 1 and group 2 ( all P＜0.05).Conclusion Inhibiting the Sclerostin expression may increase the cell viability of human BMSCs and osteogenic differentiation.

Key words:osteogenesis; human mesenchymal stem cells; bone morphogenetic protein 2; Sclerostin; alkaline phosphatase

骨形態(tài)發(fā)生蛋白( BMP)參與機體的形態(tài)發(fā)育和器官形成，刺激成骨細胞分化。骨折時骨髓間充質(zhì)干細胞( BMSCs)在多種因子的誘導(dǎo)作用下遷移到骨折處，分化為成骨細胞，合成骨組織以修復(fù)受損的骨骼［1～4］。BMP可以誘導(dǎo)BMSCs向成骨細胞方向分化［5～9］，其誘導(dǎo)作用受到細胞外BMP抑制劑的調(diào)節(jié)［10，11］。Sclerostin為BMP抑制劑，通過競爭性與BMP受體結(jié)合，下調(diào)BMP活性，進而抑制成骨分化過程［12］。但是，Sclerostin對人BMSCs成骨分化的影響尚不明確。本研究探討Sclerostin對骨形態(tài)發(fā)生蛋白2( BMP-2)誘導(dǎo)的人BMSCs成骨分化的影響。

1　資料與方法

1.1臨床資料選擇2014年4～6月上海市第六人民醫(yī)院收治的兩位男性車禍傷致截肢患者，年齡分別為38、46歲，均取其骨髓樣本?；颊邔Ρ狙芯烤橥猓⑼ㄟ^本院倫理委員會批準。

1.2人BMSCs的分離及培養(yǎng)將新鮮的骨髓組織加入到含10%胎牛血清( FBS)的DMEM培養(yǎng)基中，吹打并制成單細胞懸液，分裝至2個25 mL培養(yǎng)瓶中。置于37℃、5% CO2的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。5 d后首次半量換液，以后每2～3 d全量換液1次。待培養(yǎng)第10～14天貼壁細胞長至90%時，采用0.25%胰蛋白酶和1 mL/L EDTA的混合液( 1∶2)消化傳代。取第2代細胞消化、分離，移至離心管低速離心，計數(shù)并調(diào)整細胞密度為3×106個/mL，備用。

1.3 Sclerostin siRNA制備及驗證設(shè)計并合成有效siRNA，用來靶向人Sclerostin( Gene ID: 50964) mRNA(中國Qiagen)。siRNA序列正義鏈為5'-ACGUCUUUGGUCUCAAAGGGG-3'，反義鏈為5'-CCUUUGAGACCAAAGACGUGU-3'。以BLOCK-iT si-RNA(美國Invitrogen)作為對照siRNA(不與體內(nèi)任何基因序列結(jié)合)，正義鏈為5'-UUCUCCGAAGUCACG-3'，反義鏈為5'-ACGUGACACGUUCGGAGAA-3'。采用Lipofectamine(美國life)將對照siRNA和Sclerostin特異性siRNA轉(zhuǎn)染進入人BMSCs，轉(zhuǎn)染24 h后，在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中加入0.1 μg/mL BMP-2;培養(yǎng)72 h后，抽離總RNA，采用Real-time PCR檢測Sclerostin mRNA相對表達量。結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染Sclerostin siRNA的人BMSCs中Sclerostin mRNA表達水平顯著降低，未轉(zhuǎn)染細胞和轉(zhuǎn)染對照siRNA細胞中Sclerostin mRNA表達水平未有明顯變化;說明制備Sclerostin siRNA成功，可用于以下研究。

1.4人BMSCs分組及處理將培養(yǎng)細胞隨機分為三組，1組未做轉(zhuǎn)染( Mock)，2組轉(zhuǎn)染對照siRNA，3組轉(zhuǎn)染Sclerostin siRNA，轉(zhuǎn)染24 h后，三組均給予含有0.1 μg/mL BMP-2的成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基培養(yǎng)，以誘導(dǎo)人BMSCs成骨分化。

1.5觀察方法各組細胞分別在誘導(dǎo)培養(yǎng)的第0、3、7天采用CCK-8法檢測人BMSCs活性;采用CyQUANT細胞增殖檢測試劑盒(美國Invitrogen)測定細胞DNA含量。在誘導(dǎo)培養(yǎng)的第14天，采用RT-PCR方法檢測成骨相關(guān)基因骨鈣素( OCN)、骨鈣蛋白( OC)及骨橋蛋白( OPN)，以GAPDH作為內(nèi)參基因;采用堿性磷酸酶( ALP)分析試劑盒(美國BioAssay Systems)進行ALP活性分析;采用BCA蛋白檢測試劑盒檢測細胞蛋白含量(美國Thermo)。檢測結(jié)果均用與對照組相比后的相對量表示。

1.6統(tǒng)計學(xué)方法采用PASW Statistics19.0統(tǒng)計軟件。計量資料采用珋x±s表示，比較采用t檢驗或one-way ANOVA方差分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2　結(jié)果

在誘導(dǎo)培養(yǎng)的第3、7天，3組細胞活性、DNA含量均高于1、2組( P均＜0.05)，見表1、2。在誘導(dǎo)培養(yǎng)的第14天，1、2、3組ALP活性分別為1.00%± 0.08%、1.12%±0.09%、2.50%±0.03%，3組高于1、2組( P均＜0.05) ;細胞蛋白含量分別為1.00%± 0.03%、0.99%±0.22%、2.05%±0.14%，3組高于1、2組( P均＜0.05) ;3組OCN、OC、OPN mRNA相對表達量均高于1、2組( P均＜0.05)，見表3。

表1　各組細胞活性比較( %，±s)

表1　各組細胞活性比較( %，±s)

注:與相同培養(yǎng)時間時1組比較，*P＜0.05;與相同培養(yǎng)時間時2組比較，△P＜0.05。

組別　細胞活性第0天　　第3天　　第7天1組1.00±0.08　1.50±0.11　2.48±0.23 2組　0.99±0.08　1.52±0.12　2.50±0.32 3組　1.01±0.04　2.12±0.18＊△　4.02±0.43＊△

表2　各組細胞DNA含量比較( %，±s)

表2　各組細胞DNA含量比較( %，±s)

注:與相同培養(yǎng)時間時1組比較，*P＜0.05;與相同培養(yǎng)時間時2組比較，△P＜0.05。

組別　　細胞DNA 含量第0天　　第3天　　第7天1組1.00±0.09　2.02±0.10　3.36±0.13 2組　0.94±0.11　2.09±0.16　3.38±0.22 3組　0.96±0.05　2.69±0.13＊△　4.58±0.23＊△

表3　各組細胞OCN、OC、OPN mRNA表達比較( %，±s)

表3　各組細胞OCN、OC、OPN mRNA表達比較( %，±s)

注:與1組比較，*P＜0.05;與2組比較，△P＜0.05。

組別OCN　OC　OPN 1組1.00±0.02　1.00±0.03　1.00±0.11 2組　1.01±0.22　0.98±0.01　1.08±0.08 3組　2.30±0.13＊△　2.60±0.13＊△　2.70±0.16＊△

3　討論

BMP誘導(dǎo)的成骨分化受到細胞外BMP抑制劑

的密切調(diào)節(jié)，此類抑制劑包括noggin、chordin、gremlin、Sclerostin等［10，11］。BMP抑制劑通過與BMP結(jié)合，阻止BMP與細胞膜上的相應(yīng)受體結(jié)合，從而阻礙BMP下游信號通路的激活，同時BMP抑制劑也可以直接作用于細胞膜上的受體。每種BMP抑制劑都與BMP超家族中的成員具有不同程度的親和力。BMP抑制劑均具有“胱氨酸結(jié)”結(jié)構(gòu)，可以作為配體與多種質(zhì)膜受體結(jié)合［13］。Avsian-Kretchmer等［14］根據(jù)所包含“胱氨酸結(jié)”的大小，將BMP抑制劑分成3個次級家族，即CAN、twisted gastrulation、chordin和noggin，其中Sclerostin、DAN、cerberus屬于CAN家族。研究發(fā)現(xiàn)，CAN家族對BMP-2、BMP-4、BMP-7均有抑制作用［11］。Sutherland等［15］通過對人成骨細胞的研究發(fā)現(xiàn)，BMP-2、BMP-4、BMP-6可介導(dǎo)Sclerostin的表達，該作用具有時間和劑量依賴性，并可被視黃酸和1，25( OH)2D3增強，被地塞米松完全抑制。但是，BMP-2、BMP-4、BMP-6 對noggin和gremlin的表達影響較小。上述結(jié)果提示，Sclerostin是不同于其他BMP抑制劑的一種新的BMP抑制物，有其自身獨特的配基特異性。研究發(fā)現(xiàn)，Sclerostin可以抑制成骨細胞的發(fā)育，包括成骨細胞的增殖以及早期和晚期分化［16］。Sclerostin可以增加成骨細胞內(nèi)Caspase活性，誘導(dǎo)成骨細胞凋亡，這可能是Sclerostin抑制骨形成的機制之一。此外，被新礦化的基質(zhì)包埋的骨細胞可以分泌Sclerostin，并運送到骨表面的成骨細胞，進而在各個階段抑制成骨細胞的發(fā)育，最終導(dǎo)致骨形成的抑制。

BMP-2在促進人BMSCs向成骨方向分化方面具有至關(guān)重要的作用，其在一定濃度范圍內(nèi)可以誘導(dǎo)人BMSCs表達一些成骨標志性因子，如OCN、OC、OPN等。本課題組前期研究結(jié)果表明，BMP-2可以誘導(dǎo)BMSCs表達Sclerostin，這種誘導(dǎo)作用具有時間和劑量依賴性。當BMP-2濃度為0.1 μg/mL時，Sclerotin的表達量最高，因此采用此濃度進行本次研究。在Sclerotin表達抑制的初期，BMSCs的活力會受到一定的影響。本研究結(jié)果顯示，在Sclerotin表達抑制的第3、7天BMSCs活力明顯增強，同時DNA含量升高;在成骨誘導(dǎo)的第14天，成骨分化的早期標準物ALP活性增強，成骨分化的標志性基因OCN、OC、OPN表達水平明顯提高，總蛋白含量升高;以上結(jié)果說明，Sclerotin表達抑制可以促進BMP-2誘導(dǎo)的BMSCs成骨分化。

參考文獻:

［1］Zigdon-Giladi H，Bick T，Lewinson D，et al.Mesenchymal stem cells and endothelial progenitor cells stimulate bone regeneration and mineral density［J］.J Periodontol，2014，85( 7) : 984-990.

［2］Xu FF，Zhu H，Li XM，et al.Intercellular adhesion molecule-1 inhibits osteogenic differentiation of mesenchymal stem cells and impairs bio-scaffold-mediated bone regeneration in vivo［J］.Tissue Eng Part A，2014，20( 19-20) : 2768-2782.

［3］Clough BH，McCarley MR，Krause U，et al.Bone regeneration with osteogenically enhanced mesenchymal stem cells and their extracellular matrix proteins［J］.J Bone Miner Res，2015，30( 1) : 83-94.

［4］Qin Y，Guan J，Zhang C.Mesenchymal stem cells: mechanisms and role in bone regeneration［J］.Postgrad Med J，2014，90 ( 1069) : 643-647.

［5］Koussoulakou DS，Margaritis LH，Koussoulakos SL.Antagonists of retinoic acid and BMP4 affect fetal mouse osteogenesis and odontoblast differentiation［J］.Pathophysiology，2011，18( 2) : 103-109.

［6］Gozo MC，Aspuria PJ，Cheon DJ，et al.Foxc2 induces Wnt4 and Bmp4 expression during muscle regeneration and osteogenesis［J］.Cell Death Differ，2013，20( 8) : 1031-1042.

［7］Luo W，F(xiàn)riedman MS，Hankenson KD，et al.Time series gene expression profiling and temporal regulatory pathway analysis of BMP6 induced osteoblast differentiation and mineralization［J］.BMC Syst Biol，2011，( 5) : 82.

［8］Zhu L，Chen FG，Liu W，et al.Effect of adeno-BMP7 transfection on osteogenesis of BMSCs［J］.Zhonghua Zheng Xing Wai Ke Za Zhi，2006，22( 1) : 59-62.

［9］Lamplot JD，Qin J，Nan G，et al.BMP9 signaling in stem cell differentiation and osteogenesis［J］.Am J Stem Cells，2013，2( 1) :1-21.

［10］Dudaric L，Cvek SZ，Cvijanovic O，et al.Expression of the BMP-2，-4 and -7 and their antagonists gremlin，chordin，noggin and follistatin during ectopic osteogenesis［J］.Coll Antropol，2013，37 ( 4) : 1291-1298.

［11］Wan DC，Pomerantz JH，Brunet LJ，et al.Noggin suppression enhances in vitro osteogenesis and accelerates in vivo bone formation ［J］.J Biol Chem，2007，282( 36) : 26450-26459.

［12］Winkler DG，Sutherland MK，Geoghegan JC，et al.Osteocyte control of bone formation via sclerostin，a novel BMP antagonist［J］.EMBO J，2003，22( 23) : 6267-6276.

［13］Wang X，Oyane A，Tsurushima H，et al.BMP-2 and ALP gene expression induced by a BMP-2 gene-fibronectin-apatite composite layer［J］.Biomed Mater，2011，6( 4) : 045004.

［14］Avsian-Kretchmer O，Hsueh AJ.Comparative genomic analysis of the eight-membered ring cystine knot-containing bone morphogenetic protein antagonists［J］.Mol Endocrinol，2004，18( 1) : 1-12.

［15］Sutherland MK，Geoghegan JC，Yu C，et al.Sclerostin promotes the apoptosis of human osteoblastic cells: a novel regulation of bone formation［J］.Bone，2004，35( 4) : 828-835.

［16］Brunkow ME，Gardner JC，Van Ness J，et al.Bone dysplasia sclerosteosis results from loss of the SOST gene product，a novel cystine knot-containing protein［J］.Am J Hum Genet，2001，68 ( 3) : 577-589.

收稿日期:( 2015-04-01)

通信作者簡介:何耀華( 1972-)，男，主任醫(yī)師，主要研究方向為運動醫(yī)學(xué)與生物材料。E-mail: heyaohua@ vip.126.com

作者簡介:第一張堯( 1989-)，男，碩士，主要研究方向為生物材料與骨軟骨組織工程。E-mail: dsyz138@163.com

基金項目:國家自然科學(xué)基金資助項目( 81271961)。

文章編號:1002-266X( 2015) 28-0005-03

文獻標志碼:A

中圖分類號:R336

doi:10.3969/j.issn.1002-266X.2015.28.002