李媛媛 張小平 劉鐵軍 李建民 張樹波 程光

相關(guān)研究證明饑餓對神經(jīng)系統(tǒng)的影響非常明顯［1，2］，大腦與學(xué)習(xí)記憶功能、呼吸、運動以及攝食、生殖、情緒控制等行為有關(guān)，因此饑餓狀態(tài)對腦細(xì)胞損傷可能最終造成大腦功能的損害。在人類中各種疾病引起的患者昏迷或其他原因患者長期不能進(jìn)食，嚴(yán)重消化道疾病導(dǎo)致營養(yǎng)吸收障礙，或者某些災(zāi)難(如礦井、建筑物坍塌、野外迷路等)、自然災(zāi)害(如地震、海嘯、山體滑坡等)發(fā)生時，常造成遇難人員得不到食物，以及人為的長期過度節(jié)食等均可因嚴(yán)重營養(yǎng)缺乏造成大腦組織結(jié)構(gòu)和功能損害，從而影響患者腦功能的恢復(fù)。因此，對于這類患者應(yīng)重視支持療法，保證維持腦功能所必需的營養(yǎng)供給，從而有利于腦功能保護(hù)和恢復(fù)。本實驗通過制備全饑餓模型，觀察全饑餓狀態(tài)對大腦皮質(zhì)凋亡相關(guān)因子Bcl-2、Bax和Caspase-3的表達(dá)變化，探討?zhàn)囸I時限對腦組織損害機(jī)制及程度的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物:健康成年雄性SD大鼠60只，清潔級，體重(350±30)g，12周齡，由河北聯(lián)合大學(xué)動物實驗中心提供［動物合格證號:SCXK(冀)2009-0003］。

1.1.2 試劑:實驗所需的儀器由河北聯(lián)合大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院臨床實驗中心提供。TUNEL試劑盒(Millipore公司);PCR反應(yīng)試劑盒、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和引物(Invitrogen公司);BCA蛋白濃度測定試劑盒(碧云天公司);Bcl-2一抗(上海Bioworlde公司);兔抗Caspase-3(Active)一抗、兔抗Bax一抗、兔抗GAPDH一抗、山羊抗兔IgG二抗、ECL發(fā)光液(Affinity公司)。

1.2 方法

1.2.1 動物分組:60只SD大鼠隨機(jī)分為6組，分別為正常對照組、饑餓3 d、5 d、7 d、9 d和11 d組。其后又將每組隨機(jī)分為2個亞組Ⅰ、Ⅱ，每個亞組5只。每組Ⅰ組應(yīng)用TUNEL法檢測皮質(zhì)區(qū)的凋亡細(xì)胞，Ⅱ組用RT-PCR和Western blot法檢測皮質(zhì)區(qū) Bcl-2、Bax和Caspase-3的mRNA及蛋白表達(dá)。

1.2.2 全饑餓模型的復(fù)制:大鼠實驗前置(25±2)℃室溫，自由飲食，分籠適應(yīng)性喂養(yǎng)2周后進(jìn)行實驗。正常對照組給予正常飲食，饑餓3 d、5 d、7 d、9 d、11 d 組在相應(yīng)的饑餓天數(shù)內(nèi)禁食，但給予足量的飲水。每組Ⅰ組大鼠在達(dá)到饑餓天數(shù)后，立即以10%水合氯醛以0.30 ml/100 g體重腹腔內(nèi)注射麻醉動物，在深度麻醉下用0.9%氯化鈉溶液、4%多聚甲醛溶液經(jīng)左心室、主動脈灌注，之后斷頭。用特制的咬骨鉗從枕骨大孔處鉗開，仔細(xì)分離整個大腦組織，在視交叉和乳頭體處將腦組織垂直橫斷后，將含頂葉腦組織(厚約4 mm)置于4℃0.1 mol/L的4%多聚甲醛溶液浸泡后固定以備制作石蠟標(biāo)本，用于Tunel檢測。Ⅱ組大鼠在深麻下斷頭取腦，分離皮質(zhì)，用于 RT-PCR和Western blot檢測。

1.2.3 皮質(zhì)神經(jīng)元凋亡檢測:采用TUNEL法檢測大鼠皮質(zhì)神經(jīng)元凋亡情況。切片入水，滴加新鮮稀釋的蛋白酶K(20 g/ml)，室溫消化15 min;3%H2O2孵育5 min，PBS沖洗5 min×2次;加入平衡液，4℃孵育60 min;加入TdT酶反應(yīng)液，37℃孵育60 min;加入終止液，室溫孵育10 min;PBS沖洗1 min×3次，加入Anti-digoxigenin，室溫孵育30 min;PBS沖洗2 min×4次，DAB顯色。高倍鏡下大腦皮質(zhì)頂葉區(qū)截圖(來自不同切片)，采用Image-ProPlus 6.0圖像分析軟件進(jìn)行凋亡細(xì)胞計數(shù)。

1.2.4 RT-PCR法檢測大鼠皮質(zhì):Bcl-2、Bax、Caspase-3 mRNA的表達(dá) PCR反應(yīng)體系(參考PCR說明書):Taq Master Mix 17 μl，上下游引物各 1 μl，模板 DNA 1 μl，共 20 μl。PCR 反應(yīng)條件:預(yù)變性 94℃ 4 min，變性 94℃ 30 s、退火58℃ 30 s、延伸72℃ 1 min(39個循環(huán))，終延伸72℃ 5 min。PCR反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳檢測，用LeicaQ5100W型全自動圖像分析儀分析電泳結(jié)果。用全自動數(shù)碼成像分析系統(tǒng)對結(jié)果進(jìn)行分析。見表1。

表1 引物序列

1.2.5 Western blot檢測大鼠皮質(zhì) Bcl-2、Bax、Caspase-3蛋白表達(dá):按照WIP組織細(xì)胞裂解液說明書提取蛋白，用BCA法檢測樣本蛋白濃度。樣品的上樣體積為30 μl(總蛋白量為25 μg)，用15%的分離膠進(jìn)行SDS-PAGE電泳;轉(zhuǎn)膜后以5%的脫脂奶封閉液封閉1 h;一抗(1∶500)孵育4℃過夜;用TBST洗膜3次(5 min/次);二抗(11∶3 000)孵育1 h;洗膜。用ECL發(fā)光試劑盒發(fā)光、顯影、定影。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析 應(yīng)用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件，計量資料以表示，采用單因素方差分析，相關(guān)性采用Pearson法分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 皮質(zhì)神經(jīng)細(xì)胞凋亡情況 與正常對照組比較，饑餓3 d組凋亡細(xì)胞百分比無明顯增加(P＞0.05)，饑餓5 d組稍有增加(P＜0.05)，而饑餓7 d、9 d和11 d組明顯增加(P＜0.01)。見表2，圖1～8。

表2 大鼠皮質(zhì)區(qū)TUNEL陽性細(xì)胞及凋亡細(xì)胞陽性率n=5，±s

表2 大鼠皮質(zhì)區(qū)TUNEL陽性細(xì)胞及凋亡細(xì)胞陽性率n=5，±s

注:與正常對照組比較，*P ＜0.05，#P ＜0.01

組別 Tunel(個/hpl) 凋亡細(xì)胞陽性率(%)正常對照組3.57±0.82 3.23±0.73饑餓3 d組 4.41±0.54 3.80±0.09饑餓5 d組 6.83±0.07* 6.33±0.67*饑餓7 d組 35.74±2.17# 44.21±2.10#饑餓9 d組 43.63±2.72# 51.59±2.36#饑餓11 d組 51.08±3.87# 59.49±2.36#

圖1 陰性對照皮質(zhì)區(qū)(TUNEL×400)

圖2 陽性對照皮質(zhì)區(qū)(TUNEL×400)

圖3 正常對照組皮質(zhì)區(qū)(TUNEL×400)

圖4 饑餓3 d組皮質(zhì)區(qū)(TUNEL×400)

圖5 饑餓5 d組皮質(zhì)區(qū)(TUNEL×400)

圖6 饑餓7 d組皮質(zhì)區(qū)(TUNEL×400)

圖7 饑餓9 d組皮質(zhì)區(qū)(TUNEL×400)

圖8 饑餓11 d組皮質(zhì)區(qū)(TUNEL×400)

2.2 RT-PCR法檢測大鼠皮質(zhì) Bcl-2、Bax、Caspase-3 mRNA的表達(dá) 與正常對照組比較，饑餓3 d組Bax和Caspase-3 mRNA表達(dá)無明顯增加(P＞0.05)，而饑餓5 d、7 d、9 d、11 d 組Bax和Caspase-3 mRNA 表達(dá)均明顯增加(P＜0.01);饑餓3 d、5 d、7 d組 Bcl-2 mRNA的表達(dá)均增高(P＜0.05)，5 d組表達(dá)量最高(P＜0.01)，9 d、11 d 組表達(dá)降低(P＜0.05)，11 d組表達(dá)量最低(P＜0.01)。見表2，圖9。

表2 大鼠皮質(zhì)區(qū)Bcl-2、Bax、Caspase-3mRNA相對表達(dá)量n=5，±s

表2 大鼠皮質(zhì)區(qū)Bcl-2、Bax、Caspase-3mRNA相對表達(dá)量n=5，±s

注:與正常對照組比較，*P ＜0.05，#P＜0.01

組別Bcl-2 Bax Bcl-2/Bax Caspase-3正常對照組 0.702±0.109 0.343±0.126 2.247±0.888 0.329±0.004饑餓3 d組 1.020±0.000# 0.434±0.070 2.387±0.359 0.368±0.008饑餓5 d組 1.030±0.005# 0.970±0.055# 1.064±0.065# 0.720±0.031#饑餓7 d組 0.806±0.086* 1.033±0.035# 0.812±0.025# 1.011±0.053#饑餓9 d組 0.564±0.067* 1.070±0.016# 0.527±0.057# 1.174±0.043#饑餓11 d組 0.406±0.001# 1.168±0.074# 0.349±0.023# 1.261±0.039#

圖9 各組大鼠皮質(zhì)區(qū)Bcl-2、Bax、Caspase-3 mRNA的表達(dá)水平

2.3 Western Blot檢測 Bcl-2、Bax、Caspase-3 蛋白表達(dá)

與正常對照組比較，饑餓3 d組Bax和Caspase-3蛋白表達(dá)無明顯增加(P＞0.05)，饑餓5 d組Caspase-3表達(dá)增加(P＜0.05)，Bax蛋白表達(dá)明顯增加(P＜0.01)，而饑餓7 d、9 d、11 d組 Bax和 Caspase-3 蛋白表達(dá)均明顯增加(P＜0.01);饑餓3 d、5 d、7 d組Bcl-2蛋白的表達(dá)均明顯增高(P＜0.01)，5 d組表達(dá)量最高，9 d、11 d組表達(dá)降低，11 d組表達(dá)量最低(P＜0.01)。見圖10，表3。

圖10 各組大鼠皮質(zhì)區(qū)Bcl-2、Bax、Caspase-3蛋白的表達(dá)水平

表3 大鼠皮質(zhì)區(qū)Bcl-2、Bax、Caspase-3蛋白相對表達(dá)量n=5，±s

表3 大鼠皮質(zhì)區(qū)Bcl-2、Bax、Caspase-3蛋白相對表達(dá)量n=5，±s

注:與正常對照組比較，*P ＜0.05，#P ＜0.01

組別Bcl-2 Bax Bcl-2/Bax Caspase-3正常對照組 0.580±0.004 0.499±0.041 1.162±0.008 0.361±0.005饑餓3d組 0.990±0.010# 0.533±0.039 1.858±0.018# 0.362±0.005饑餓5d組 1.168±0.012# 0.958±0.052# 1.219±0.013# 0.374±0.007*饑餓7d組 0.726±0.007# 1.132±0.112# 0.641±0.006# 0.773±0.006#饑餓9d組 0.577±0.006 1.145±0.112# 0.504±0.005# 0.926±0.006#饑餓11d組 0.165±0.010# 1.188±0.154# 0.138±0.008# 1.253±0.006#

2.4 對細(xì)胞凋亡與Bcl-2、Bax、Bcl-2/Bax和Caspase-3蛋白之間的相關(guān)性進(jìn)行分析 見表4。

表4 大鼠皮質(zhì)區(qū)細(xì)胞凋亡與Bcl-2、Bax、Caspase-3及Bcl-2/Bax比值之間的相關(guān)性(r值)

3 討論

相關(guān)研究證明饑餓對神經(jīng)系統(tǒng)的影響非常明顯［1］，可引起腦細(xì)胞內(nèi)鈣增加，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)鈣超載，而鈣超載被認(rèn)為是導(dǎo)致神經(jīng)元遲發(fā)型死亡的關(guān)鍵因素之一。本實驗結(jié)果顯示饑餓可引起腦皮質(zhì)區(qū)神經(jīng)細(xì)胞凋亡數(shù)增加，饑餓后期數(shù)目明顯增多，提示可能已存在凋亡過度。細(xì)胞凋亡是涉及多基因調(diào)控的復(fù)雜的嚴(yán)格控制的主動死亡過程，Bcl-2家族是一個參與細(xì)胞死亡調(diào)控的基因家族，由兩組功能相互拮抗的蛋白組成，在細(xì)胞凋亡的調(diào)控過程中具有重要作用［3］。

本研究顯示，饑餓7 d內(nèi)大鼠Bcl-2基因的表達(dá)增加，而隨著饑餓期延長，Bcl-2的表達(dá)明顯減少。結(jié)果表明短期的饑餓應(yīng)激后皮質(zhì)神經(jīng)元中Bcl-2被誘導(dǎo)表達(dá)，提示Bcl-2可能是成年腦組織中的一種可誘導(dǎo)的內(nèi)源性神經(jīng)保護(hù)劑。相關(guān)研究證明饑餓早期時大鼠學(xué)習(xí)記憶能力稍有增強(qiáng)。Bcl-2蛋白可以降低細(xì)胞膜通透性、減少細(xì)胞色素C釋放、減少內(nèi)質(zhì)網(wǎng)釋放鈣，在內(nèi)源性細(xì)胞凋亡的過程中起著關(guān)鍵性的調(diào)控作用［4，5］。饑餓后期Bcl-2表達(dá)減少可能會是皮質(zhì)區(qū)凋亡增加的影響因素之一。

Bax具有孔形成能力，并能誘導(dǎo)細(xì)胞色素C的釋放，使 Bcl-2與 Apaf-1分離，然后 Apaf-1激活Caspase［6，7］，啟動凋亡級聯(lián)反應(yīng)［6］。饑餓 3 d 時大鼠Bax基因的表達(dá)略有增加，而隨著饑餓期延長大鼠皮質(zhì)區(qū)Bax基因的表達(dá)明顯增加。結(jié)果提示在全饑餓狀態(tài)下Bax的表達(dá)受到影響，結(jié)合Bax基因表達(dá)具有促進(jìn)凋亡的作用，考慮全饑餓狀態(tài)下皮質(zhì)區(qū)細(xì)胞凋亡增加可能與Bax表達(dá)增加相關(guān)，而相關(guān)性分析顯示二者呈正相關(guān)。

Caspase蛋白酶家族在凋亡發(fā)生時瀑布式啟動過程中Caspase-3是凋亡的最終執(zhí)行者，在凋亡信號傳遞中起關(guān)鍵作用［8，9］。本研究檢測各組大鼠皮質(zhì)的Caspase-3基因的表達(dá)，與正常對照組比較發(fā)現(xiàn)，各組皮質(zhì)Caspase-3 mRNA表達(dá)均上調(diào)，Caspase-3活性增高，其在饑餓后期7 d、9 d、11 d組中變化更顯著，故可知饑餓后期更容易誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。

目前有研究認(rèn)為，Bcl-2與Bax的比值是決定細(xì)胞是否發(fā)生凋亡的基本檢驗點［10］。當(dāng)二者的比率＜1，Bax起到的作用占優(yōu)勢，細(xì)胞色素C從線粒體釋放，從而導(dǎo)致細(xì)胞凋亡發(fā)生的一連串瀑布反應(yīng)。當(dāng)二者比率≥1，Bcl-2起到的作用占優(yōu)勢，細(xì)胞色素C不再釋放，線粒體途徑的凋亡不起作用，細(xì)胞凋亡因此大大減少［11，12］。本實驗中饑餓 3 d、5 d 組皮質(zhì)區(qū) Bcl-2/Bax比值較正常對照組明顯增加，而饑餓7 d、9 d、11 d組較正常對照組比較明顯下降。說明在饑餓早期，大鼠Bcl-2/Bax比值明顯增加，抑制神經(jīng)細(xì)胞的凋亡，而隨著饑餓期延長，在饑餓后期大鼠皮質(zhì)區(qū)Bcl-2/Bax比值明顯減少。相關(guān)性分析顯示凋亡細(xì)胞數(shù)與二者比值呈負(fù)相關(guān)。在不同疾病模型研究中，Bcl-2/Bax比值的大小與TUNEL陽性細(xì)胞數(shù)的增減呈現(xiàn)出相互平行的變化關(guān)系，說明 Bcl-2/Bax比值有可能成為判斷細(xì)胞凋亡程度及與相關(guān)疾病發(fā)生的一個預(yù)示指標(biāo)。在不同組織細(xì)胞凋亡的相關(guān)研究中，Bcl-2和Bax雖單獨具有調(diào)控細(xì)胞凋亡的功能，但在二者共表達(dá)的細(xì)胞中，其相互間的比例對細(xì)胞凋亡的影響更為重要。在不同刺激因子作用下，這些都提示Bcl-2家族成員間的動態(tài)平衡可能是決定細(xì)胞命運的核心機(jī)制之一，尤其是這一家族的兩個代表性成員Bcl-2和Bax。

綜上所述，短期饑餓應(yīng)激可能有一定的腦保護(hù)作用;長期饑餓應(yīng)激可能通過上調(diào)大鼠皮質(zhì)細(xì)胞Bax、Caspase-3的表達(dá)，抑制 Bcl-2的表達(dá)，破壞了 Bcl-2/Bax的平衡，進(jìn)而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。

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