陜西省人民醫(yī)院骨科(西安710068)

李　勇　秦　靜　劉宗智

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Survivin-shRNA對骨肉瘤MG-63細(xì)胞增殖、凋亡影響相關(guān)研究*

陜西省人民醫(yī)院骨科(西安710068)

李勇秦靜劉宗智

目的：探討Survivin-shRNA對骨肉瘤MG-63細(xì)胞增殖活性、凋亡指數(shù)、超微結(jié)構(gòu)變化以及Survivin、VEGF、PCNA及CAS-3蛋白表達(dá)水平的影響。方法：骨肉瘤MG-63細(xì)胞培養(yǎng)成功后，重組腺病毒Survivin-shRNA轉(zhuǎn)染。細(xì)胞以1∶5的比例進(jìn)行稀釋傳代培養(yǎng)，挑選穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細(xì)胞并擴(kuò)增培養(yǎng)用于進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)，Survivin-shRNA病毒載體轉(zhuǎn)染的細(xì)胞為Survivin-shRNA組，陰性對照為GFP組和CON組。采用MTT法檢測細(xì)胞增殖活性，流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡指數(shù)，透射電鏡觀察細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)改變，Western blot 法檢測SUV、VEGF 、PCNA及CAS-3蛋白的表達(dá)變化。結(jié)果：腺病毒介導(dǎo)的RNA干擾構(gòu)建Survivin-shRNA載體，Survivin-shRNA組轉(zhuǎn)染細(xì)胞的胞質(zhì)及胞核可見綠色熒光，并伴有少量小顆粒物質(zhì)。MTT結(jié)果顯示：Survivin-shRNA對MG-63細(xì)胞增殖有明顯抑制作用；流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)：Survivin-shRNA組與Control組和GFP組相比，細(xì)胞早期凋亡率增加，可見核碎裂、凋亡小體；透射電鏡可見Survivin-shRNA對MG-63超微結(jié)構(gòu)有明顯作用，核固縮，微絨毛消失，染色質(zhì)濃集靠近于核膜，并可見凋亡小體分離；Westtern blot分析顯示：Survivin-shRNA抑制SUV、VEGF和PCNA蛋白的表達(dá)，增強(qiáng)了CAS-3蛋白在MG-63細(xì)胞中的表達(dá)水平。結(jié)論：Survivin-shRNA可抑制骨肉瘤細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，其機(jī)制可能是通過抑制腫瘤新生血管形成或通過調(diào)控CAS-3的表達(dá)、下調(diào)SUV信號通路來完成。

骨肉瘤是兒童和青少年最常見的骨科惡性腫瘤[1]。研究表明：Survivin與惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展以及腫瘤敏感性均有著密切關(guān)系。本實(shí)驗(yàn)通過構(gòu)建重組腺病毒載體Survivin-shRNA，轉(zhuǎn)染至骨肉瘤MG-63細(xì)胞后，檢測細(xì)胞增殖活性、細(xì)胞凋亡指數(shù)、超微結(jié)構(gòu)變化及SUV、VEGF 、PCNA及CAS-3蛋白的表達(dá)，評估Survivin-shRNA對MG-63細(xì)胞增殖、凋亡的影響及其分子機(jī)制。

材料與方法

1試劑及儀器人骨肉瘤MG-63細(xì)胞株購自中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞資源中心；胎牛血清、青鏈霉素購自美國Gibco公司；MTT、二甲基亞砜及所有抗體(CAS-3、VEGF、PCNA、SUV及二抗)購自美國Sigma公司；細(xì)胞凋亡試劑盒購自南京凱基生物公司。

2MG-63細(xì)胞培養(yǎng)液氮中取出人骨肉瘤MG-63細(xì)胞，放入37oC水浴箱中使之迅速融化。在超凈工作臺內(nèi)吸出細(xì)胞懸液，注入含5ml培養(yǎng)液的離心管中，低速離心3min后棄上清，于含10%～15%胎牛血清、100μg/ml青鏈霉素的DMEM培養(yǎng)液中，置于37oC培養(yǎng)箱培養(yǎng)，當(dāng)細(xì)胞生長貼壁融合度為80%～90%時(shí)傳代培養(yǎng)。

3Survivin-shRNA轉(zhuǎn)染MG-63細(xì)胞為有效敲除MG-63細(xì)胞中的Survivin基因，采用腺病毒介導(dǎo)的RNA干擾方法來構(gòu)建Survivin-shRNA載體，shRNA序列由上海吉?jiǎng)P公司設(shè)計(jì)并合成。MG-63細(xì)胞接種于6孔板，待細(xì)胞生長融合至60%～80%，洗滌后進(jìn)行轉(zhuǎn)染。重組Survivin-shRNA和陰性對照rAd5-GFP轉(zhuǎn)染MG-63細(xì)胞，細(xì)胞以1∶5的比例進(jìn)行稀釋傳代培養(yǎng)，挑選穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細(xì)胞并傳代培養(yǎng)用于進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)，重組Survivin-shRNA轉(zhuǎn)染的細(xì)胞為Survivin-shRNA組，陰性對照為rAd5-GFP組和CON組。

4MTT法檢測MG-63細(xì)胞增殖抑制率 取對數(shù)生長期MG-63細(xì)胞，制成單細(xì)胞懸液，計(jì)數(shù)后接種于96孔培養(yǎng)板中，每孔體積200μl，重復(fù)4孔，同時(shí)設(shè)正常生長細(xì)胞對照及空白對照。分別孵育24h后，每孔加入20μlMTT培養(yǎng)4h，去上清，每孔加入150μl DMSO，終止反應(yīng)。將96孔板移入平板震蕩器，水平震蕩10min。酶聯(lián)免疫檢測儀于490nm波長處測定每孔吸光度(OD)值。增殖抑制率=(l—實(shí)驗(yàn)組OD值/對照組OD值)×100%。

5流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡采用 Annexin V/PI雙染色法，取對數(shù)期生長的MG-63細(xì)胞，0.25%胰酶消化后制成細(xì)胞懸液，以105/ml細(xì)胞密度接種，用4oC預(yù)冷的PBS洗細(xì)胞兩次，胰酶消化后，1500rpm離心5min后棄上清，收集細(xì)胞，用PBS重新懸浮細(xì)胞，調(diào)節(jié)細(xì)胞濃度，取l00μl細(xì)胞懸液，1500rpm離心5min后棄上清，加入500μl的1×Binding Buffer，加入5μl Annexin V-FITC，再加入10μl PI，輕輕混勻，在室溫下，避光反應(yīng)5～10min；流式細(xì)胞儀分析，所得數(shù)據(jù)輸入計(jì)算機(jī)并用Modifit l.0軟件分析凋亡率。

6透射電鏡檢測MG-63細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)改變對數(shù)期生長的MG-63細(xì)胞用0.25%胰酶消化后制成細(xì)胞懸液，以105/ml細(xì)胞密度接種于細(xì)胞培養(yǎng)板中，待貼壁后更換培養(yǎng)液，0.25%胰酶消化后，低速離心2min，將細(xì)胞轉(zhuǎn)移至1.5ml EP管中。將上述細(xì)胞樣本用2.5%戊二醛固定，送西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院電鏡室(TEM)。

7Western blot檢測MG-63細(xì)胞SUV、VEGF及CAS-3蛋白表達(dá) 培養(yǎng)的MG-63細(xì)胞同步化后，提取MG-63細(xì)胞蛋白，BCA法測定蛋白濃度。按《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》所述方法進(jìn)行SDS-PAGE電泳，電泳至溴酚藍(lán)抵達(dá)分離膠底部結(jié)束電泳，取下凝膠并作標(biāo)記，入電轉(zhuǎn)緩沖液平衡5min后轉(zhuǎn)膜。纖維素膜一側(cè)靠正極，膠一側(cè)靠負(fù)極。然后抗原抗體反應(yīng)，并用辣根過氧化物酶化學(xué)增強(qiáng)劑顯色反應(yīng)。蛋白的表達(dá)水平根據(jù)GAPDH進(jìn)行標(biāo)化，通過軟件進(jìn)行灰度掃描、定量。

8統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件包，計(jì)量數(shù)據(jù)以表示，多組樣本均數(shù)之間比較采用單因素方差分析檢驗(yàn)進(jìn)行處理，以P<0.05為有顯著性差異。

結(jié)　果

1Survivin-shRNA轉(zhuǎn)染MG-63細(xì)胞倒置熒光顯微鏡下觀察，與CON組相比，shRNA組MG-63細(xì)胞數(shù)量有所減少，且細(xì)胞形態(tài)改變。CON組細(xì)胞未見熒光表達(dá)，Survivin-shRNA組轉(zhuǎn)染細(xì)胞的胞質(zhì)及胞核可見綠色熒光，并伴有少量小顆粒物質(zhì)。

2 Survivin-shRNA對MG-63細(xì)胞增殖的影響用MTT法測定細(xì)胞的增殖抑制情況，在24h時(shí)，CON組的增殖抑制率為14.511.21%，GFP組的增殖抑制率為15.261.39%，而Survivin-shRNA組的增殖抑制率為28.673.07%；另外，在Survivin-shRNA組中，48h、72h所測增值率與24h有顯著性差異(P<0.01)，在72h時(shí)可達(dá)到43.214.12% (P<0.01)。

3Survivin-shRNA對MG-63細(xì)胞凋亡的影響經(jīng)Annexin V-FITC/PI雙染色流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)染24h后，與Control組和GFP組相比，Survivin-shRNA組MG-63細(xì)胞早期凋亡率增加，表明Survivin-shRNA可誘導(dǎo)MG-63細(xì)胞發(fā)生凋亡。

4Survivin-shRNA對MG-63細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的影響透射電鏡下觀察細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)改變，可見Survivin-shRNA對MG-63超微結(jié)構(gòu)有明顯影響。細(xì)胞體積縮小，微絨毛消失，核固縮，染色質(zhì)濃集靠近于核膜，并沿核膜收縮，可見具有完整膜性結(jié)構(gòu)的凋亡小體的分離。

5Survivin-shRNA對MG-63細(xì)胞蛋白表達(dá)的影響用Westtern blot檢測分析SUV 、VEGF、PCNA和CAS-3蛋白的表達(dá)。Survivin-shRNA組與GFP組和CON組相比，SUV、VEGF和PCNA的表達(dá)下降，而CAS-3表達(dá)增加，這表明，Survivin-shRNA抑制PCNA的表達(dá)，增強(qiáng)了CAS-3 在MG-63細(xì)胞中的表達(dá)。

討　論

骨肉瘤源于間葉組織，由紡錘形的惡性腫瘤細(xì)胞形成類骨質(zhì)或不成熟的骨質(zhì)為特征。骨肉瘤患者中，1/5患者初診時(shí)就已出現(xiàn)腫瘤的遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，而骨肉瘤治療失敗和死亡的最主要原因也就是遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移 。骨肉瘤惡性生物學(xué)行為對患者的危害性巨大，轉(zhuǎn)移率和病死率居高不下，常規(guī)治療手段治療效果不理想[2]。

RNA干擾技術(shù)是基因沉默的有力手段，靶向Survivin基因干擾可阻斷Survivin表達(dá)而抑制腫瘤細(xì)胞的生長[3]。與常規(guī)的藥物相比具有明顯的優(yōu)勢：根據(jù)靶基因序列按堿基互補(bǔ)原則設(shè)計(jì)，因此進(jìn)入細(xì)胞后只能作用于靶基因，故特異性強(qiáng)；可阻斷靶基因的表達(dá)，因此效果較好；作用于局部，對全身影響小，不會產(chǎn)生嚴(yán)重的不良反應(yīng)。

研究表明：Survivin與惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展以及腫瘤敏感性等有著密切聯(lián)系，已有很多Survivin基因與腫瘤的關(guān)系的相關(guān)研究進(jìn)行了深入地探索[3]。由于Survivin在腫瘤的特異性表達(dá)，因此下調(diào)Survivin是一種提高治療效果的有效策略[4]。本實(shí)驗(yàn)中MTT檢測結(jié)果顯示，Survivin-shRNA對MG-63細(xì)胞增殖具有明顯的抑制作用，這種抑制作用表現(xiàn)出良好的時(shí)間依賴性。利用流式細(xì)胞儀對細(xì)胞凋亡的分析發(fā)現(xiàn)，經(jīng)一定濃度Survivin-shRNA作用一定時(shí)間后，可見細(xì)胞凋亡的比例明顯升高。

腫瘤的發(fā)生是多途徑、多步驟的，細(xì)胞增殖與凋亡之間的平衡失調(diào)與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。Caspase家族是細(xì)胞凋亡的執(zhí)行者，當(dāng)Caspase的活性受到抑制而引起細(xì)胞凋亡障礙，就可能引起多種腫瘤的發(fā)生。Survivin的表達(dá)已被證實(shí)與骨肉瘤中PCNA和CAS-3表達(dá)相關(guān)聯(lián)[5]。我們的研究發(fā)現(xiàn)，敲除MG-63細(xì)胞Survivin可下調(diào)PCNA的表達(dá)和上調(diào)CAS-3的表達(dá)，提示Survivin可能通過調(diào)節(jié)PCNA和CAS-3的表達(dá)參與骨肉瘤增殖和凋亡。

惡性腫瘤的形成和轉(zhuǎn)移依賴新生血管生成，因此VEGF在整個(gè)過程中發(fā)揮重要作用。抑制新生血管生成在治療腫瘤中起重要作用，研究表明通過作用VEGF可影響腫瘤新生血管的生成[6]。我們的研究發(fā)現(xiàn)，敲除MG-63細(xì)胞Survivin可下調(diào)VEGF的表達(dá)，提示Survivin可能通過調(diào)節(jié)抑制腫瘤新生血管形成參與骨肉瘤增殖和凋亡。

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(收稿：2015-06-20)

The effects of Survivin-shRNA ontumor proliferation and apoptosis of MG-63 cell

Department of Orthopaedics, Shaanxi Provincial People’s Hospital(Xi’an 710068)

Li YongQi JingLiu Zongzhi

Objective:To explore the effects and molecular mechanisms of baicalin on tumor proliferation and apoptosis of MG-63 cell. Methods:MG-63 cells were cultured in DMEM medium and recombinant adenovirus vector Survivin-shRNA and negative control rAd5-GFP were transfected into MG-63 cells. Cells were subcultured at a 1∶5 dilution. Positive stable transfectants were selected and expanded for further study. The clone in which the rAd5-Survivin-shRNA virus vectors transfected was named as Survivin-shRNA group, the negative control vectors transfected was named as GFP group and MG-63 cells were named as CON group. MTT assay was used to detect cell proliferation inhibition rate; flow cytometry detected apoptosis index; TEM detected microscopic morphological changes; Western Blot assay determine the protein expression level of SUV, VEGF, PCNA and CAS-3. Results: After Survivin-shRNA was transfected into MG-63 cells, it was found that knockdown of SUV could significantly reduce the proliferative activities of MG-63 cells compared with GFP group and CON group. knockdown of Survivin markedly increased the apoptotic index of MG-63 cells compared with GFP group and CON group indicated by flow cytometry; real-time PCR and Western blot assays were performed that the mRNA and protein expression level of SUV and PCNA was decreased, while CAS-3 expression was increased in rAd5-SUV group compared with the GFP group and CON group. Conclusion: Survivin-shRNA could inhibited proliferation, induced apoptosis of MG-63 cells in a time-dependent manner. The molecular mechanisms may through VEGF-mediated regulation or regulate the expression of SUV and CAS-3.

Osteosarcoma/ultrastructureProteolipids/metabolismCell apoptosis@Survivin

R738.1

Adoi：10.3969/j.issn.1000-7377.2015.09.006

﹡陜西省科技廳社會發(fā)展科技項(xiàng)目(2015SF051)

主題詞骨肉瘤/超微結(jié)構(gòu)蛋白脂質(zhì)類/代謝細(xì)胞凋亡@ Survivin