李大命， 張彤晴， 唐晟凱， 鐘立強(qiáng)

( 江蘇省淡水水產(chǎn)研究所，江蘇省內(nèi)陸水域漁業(yè)資源重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 南京210017)

銀魚(yú)科( Salangidae) 魚(yú)類又稱銀魚(yú)( Icefish or Salangid) ，為一年生小型名貴魚(yú)類，具有很高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值和營(yíng)養(yǎng)價(jià)值［1］。大銀魚(yú)( Protosalanx chinensis)隸屬于銀魚(yú)科，新銀魚(yú)亞科( Neosalanginae) ，大銀魚(yú)屬( Protosalanx) ，是銀魚(yú)科中個(gè)體最大的種，主要分布在朝鮮半島西海岸至甌江以北各水系及近海岸，系近海河口洄游或淡水定居魚(yú)類。大銀魚(yú)在中國(guó)水體中分布廣泛，且具有重要的漁業(yè)價(jià)值，曾為中國(guó)重要的出口創(chuàng)匯水產(chǎn)品。近30 多年來(lái)，由于水體生態(tài)環(huán)境污染、水利工程建設(shè)和過(guò)渡捕撈等因素，中國(guó)野生大銀魚(yú)的資源量嚴(yán)重下降［2］，開(kāi)展大銀魚(yú)資源保護(hù)已經(jīng)迫在眉睫。

遺傳多樣性是評(píng)估資源現(xiàn)狀、制定野生種群保護(hù)和管理策略的重要前提［3-4］。有關(guān)大銀魚(yú)的研究主要集中在形態(tài)學(xué)、個(gè)體生態(tài)學(xué)和繁殖生物學(xué)等方面［2］。近年來(lái)，國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)銀魚(yú)的遺傳學(xué)開(kāi)展了一些研究，主要集中在銀魚(yú)的分子系統(tǒng)發(fā)育、遺傳多樣性和種群結(jié)構(gòu)等方面。比如，羅宏偉等分析了三峽庫(kù)區(qū)大銀魚(yú)、太湖新銀魚(yú)和短吻間銀魚(yú)線粒體DNA 細(xì)胞色素b 基因序列多態(tài)性［5］; 郭立等采用4個(gè)線粒體基因片段研究了銀魚(yú)科魚(yú)類的系統(tǒng)發(fā)育［6］;Zhang 等在長(zhǎng)江流域利用cyt b 基因全序列對(duì)全世界17 種銀魚(yú)中的15 種銀魚(yú)屬間的分子系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系進(jìn)行了比較［7］; Zhao 等利用線粒體cyt b 基因全序列對(duì)淮河、長(zhǎng)江以及珠江流域的太湖新銀魚(yú)13 個(gè)種群共計(jì)354 個(gè)個(gè)體的遺傳多樣性和種群結(jié)構(gòu)進(jìn)行了分析［8］。

太湖是中國(guó)第三大淡水湖泊，湖泊漁業(yè)是其最重要的功能之一［9-10］。在太湖漁業(yè)中，銀魚(yú)占有非常重要的地位，大銀魚(yú)占太湖銀魚(yú)漁業(yè)年總產(chǎn)量的50%以上，產(chǎn)品大都出口，創(chuàng)造了巨大的經(jīng)濟(jì)效益［11］。國(guó)內(nèi)學(xué)者對(duì)太湖大銀魚(yú)的胚胎發(fā)育、生長(zhǎng)和食性等進(jìn)行了研究［11-13］，但對(duì)太湖大銀魚(yú)的遺傳學(xué)研究較少，僅見(jiàn)夏德全等采用RAPD 技術(shù)分析了太湖銀魚(yú)種群遺傳結(jié)構(gòu)特征［14］。近10 多年來(lái)，則鮮有太湖大銀魚(yú)遺傳多樣性的研究報(bào)道。本試驗(yàn)采用cyt b 基因作為分子標(biāo)記，對(duì)太湖大銀魚(yú)的遺傳多樣性進(jìn)行初步研究，為合理開(kāi)發(fā)和利用大銀魚(yú)野生資源，以及保護(hù)太湖銀魚(yú)種質(zhì)資源提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

大銀魚(yú)于2013 年5 月采自太湖漫山水域，隨機(jī)選擇35 尾樣本，其體長(zhǎng)在3.1 cm 至6.5 cm 之間。每個(gè)大銀魚(yú)樣本剪少量尾鰭條放入無(wú)水乙醇中固定，帶回實(shí)驗(yàn)室保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 DNA 提取

大銀魚(yú)樣本基因組DNA 的提取參照Sambrook等的方法［15］。采用分光光度計(jì)( Unico UV-4802H)和1%瓊脂糖凝膠電泳分別測(cè)定DNA 濃度和檢測(cè)DNA 質(zhì)量。置于－20 ℃儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 PCR 擴(kuò)增及測(cè)序

擴(kuò)增cyt b 基因的引物為L(zhǎng)14321 和H15634［7］。L14321 引物序列: 5'-CCAGTGACTTGAAAAACCACCG-3'; H15634 引物序列: 5'-CTTAGCTTTGGGAGTTAAGGGT-3'，引物由上海生物工程有限公司合成。

PCR 反應(yīng)體系總體積為50 μl，其中2×PCR Mix 25 μl ( 包括Taq 酶1.25 U，dNTPs 10 μmol，MgCl20.1 mmol ) ，上、下游引物(10 μmol/L) 各2 μl，DNA 模板2 μl，其余體積用超純水補(bǔ)足。PCR 反應(yīng)程序?yàn)?94℃預(yù)變性4 min;94 ℃變性40 s，55 ℃退火40 s，72 ℃延伸90 s，30 個(gè)循環(huán);72 ℃延伸10 min。

PCR 產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，對(duì)擴(kuò)增效果好的PCR 產(chǎn)物進(jìn)行割膠純化后，直接送上海生物工程有限公司進(jìn)行測(cè)序，為保證所測(cè)序列的可靠性，所有樣品均采用雙向測(cè)序。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

采用DNAstar［16］軟件對(duì)DNA 序列進(jìn)行比對(duì)拼接，并輔以人工校對(duì)。用DnaSP［17］軟件計(jì)算多態(tài)位點(diǎn)數(shù)目( Np) 、單倍型數(shù)目( Nh) 、單倍型多樣性指數(shù)( h) 、核苷酸多態(tài)性( π) 和平均核苷酸差異數(shù)( k)等。用MEGA 4.1［18］軟件計(jì)算序列的堿基組成、變異位點(diǎn)和簡(jiǎn)約信息位點(diǎn)。以太湖新銀魚(yú)( Neosalanx taihuensis) 為外群，采用鄰接法( Neighbor-Joining，NJ) 構(gòu)建單倍型分子系統(tǒng)樹(shù)，并對(duì)各分支進(jìn)行1 000次重復(fù)檢驗(yàn)。利用Tajima’s D 中性檢驗(yàn)分析大銀魚(yú)種群歷史上是否發(fā)生擴(kuò)張。

2 結(jié)果

2.1 太湖大銀魚(yú)cyt b 基因堿基組成和變異分析

經(jīng)校對(duì)獲得35 條cyt b 基因同源序列，其長(zhǎng)度為1 141 bp，序列中堿基A、T、G 和C 的平均含量分別為21.7%、29.3%、16.7%和32.4%，A +T 的含量( 50.92%) 略高于G + C 的含量( 49.07%) 。在這1 141 bp 序列中，共檢測(cè)到13 個(gè)變異位點(diǎn)，占分析位點(diǎn)總數(shù)的1.14%。其中9 個(gè)為簡(jiǎn)約位點(diǎn)，4 個(gè)單一多態(tài)位點(diǎn)( 表1) 。這些突變位點(diǎn)中有11 個(gè)轉(zhuǎn)換位點(diǎn)和2 個(gè)顛換位點(diǎn)，沒(méi)有插入和丟失位點(diǎn)。

表1 太湖大銀魚(yú)mtDNA cyt b 基因單倍型多態(tài)性位點(diǎn)分布Table 1 Distribution of polymorphic sites in 12 haplotypes of Protosalanx chinensis with mtDNA cyt b in Lake Taihu

2.2 太湖大銀魚(yú)種群的遺傳多樣性

35 個(gè)大銀魚(yú)個(gè)體共定義12 個(gè)單倍型( LTH1 ～LTH12) ，其中單倍型LTH7 個(gè)體數(shù)最多，為12 個(gè)( 表1) 。大銀魚(yú)種群?jiǎn)伪缎投鄻有灾笖?shù)和核苷酸多樣 性 指 數(shù) 分 別 為0.850 ± 0.045 和0.002 96 ±0.000 17，平均核苷酸差異數(shù)為3.378，具有高單倍型多樣性和低核苷酸多樣性的特點(diǎn)( 表2) 。中性檢驗(yàn)Tajima’s D 值為正值(0.224 52) ，且差異不顯著( P ＞0.10) ，表明太湖大銀魚(yú)種群比較穩(wěn)定，沒(méi)有經(jīng)歷過(guò)種群擴(kuò)張。

表2 太湖大銀魚(yú)種群的遺傳多樣性參數(shù)Table 2 Parameter of genetic diversity of P. chinensis population in Lake Taihu

2.3 cyt b 單倍型聚類分析

以太湖新銀魚(yú)為外群，采用臨接法( NJ) 構(gòu)建太湖大銀魚(yú)12 個(gè)單倍型的分子系統(tǒng)樹(shù)( 圖1) 。由圖1 可以看出，12 個(gè)大銀魚(yú)cyt b 單倍型聚為一支，太湖新銀魚(yú)單獨(dú)一支。單倍型間的遺傳距離較小，最大值為0. 006，平均遺傳距離為0. 003( 表3) ，表明單倍型之間沒(méi)有出現(xiàn)遺傳分化。

圖1 大銀魚(yú)cyt b 單倍型的NJ 系統(tǒng)樹(shù)Fig.1 The phylogenetic tree of mtDNA cyt b haplotypes of Protosalanx chinensis

表3 太湖大銀魚(yú)cyt b 基因序列12 個(gè)單倍型遺傳距離(Kimura-2-parameter 法)Table 3 Genetic distance between 12 haplotypes of P. chinensis with cyt b sequences (Kimura-2-parameter method)

3 討論

線粒體DNA( mtDNA) 具有嚴(yán)格的母系遺傳，進(jìn)化速率快，幾乎無(wú)重組等特點(diǎn)，被廣泛用于魚(yú)類系統(tǒng)發(fā)育和群體遺傳研究，其中細(xì)胞色素b 基因( cyt b)為重要的蛋白質(zhì)編碼基因，其進(jìn)化速率適中，能夠有效反映亞種、種群、屬等不同水平的遺傳信息［19］。本研究獲得了35 條太湖大銀魚(yú)cyt b 基因同源序列(1 141 bp) ，堿基G( 16.71%) 的含量最低，具有明顯的反G 偏倚，顯示出cyt b 基因的共同特征［20］。共檢測(cè)到13 個(gè)變異位點(diǎn)，沒(méi)有插入或丟失位點(diǎn)，其中11 個(gè)轉(zhuǎn)換位點(diǎn)，2 個(gè)顛換位點(diǎn)，結(jié)果符合同種魚(yú)類中轉(zhuǎn)換在數(shù)量上遠(yuǎn)超過(guò)顛換的特征［21］。

遺傳多樣性是指生物種內(nèi)和種間的遺傳變異度，是生物進(jìn)化與適應(yīng)環(huán)境的基礎(chǔ)［22］。單倍型多樣性指數(shù)和核苷酸多樣性指數(shù)是衡量一個(gè)物種或群體遺傳多樣性的2 個(gè)重要指標(biāo)。本研究中，太湖大銀魚(yú)的單倍型多樣性指數(shù)和核苷酸多樣性指數(shù)分別為0.850 ±0.045 和0.002 96 ±0.000 17，呈現(xiàn)出高單倍型多樣性和低核苷酸多樣性的特征。有研究者通過(guò)對(duì)線粒體DNA 序列的遺傳變異分析，將不同單倍型多樣性和核苷酸多樣性間的組合分成4 種類型:第1 種類型是較低的單倍型多樣性( h ＜0.5) 與較低的核苷酸多樣性( π ＜0.005) ; 第2 種類型是高單倍型多樣性與低核苷酸多樣性; 第3 種類型是低單倍型多樣性與高核苷酸多樣性; 第4 種類型是高單倍型多樣性與高核苷酸多樣性［23］。本研究中大銀魚(yú)種群的結(jié)果屬于第2 種類型，該類型是由于經(jīng)過(guò)瓶頸效應(yīng)后伴隨著迅速的種群增長(zhǎng)與突變的積累造成，快速的種群增長(zhǎng)有利于提高對(duì)新突變的保持力而導(dǎo)致核苷酸多樣度降低。一方面由于過(guò)度捕撈、環(huán)境污染等因素，在上世紀(jì)80 年代太湖大銀魚(yú)種群數(shù)量急劇下降，遺傳多樣性降低，即受到遺傳瓶頸效應(yīng)的影響;另一方面，大銀魚(yú)生長(zhǎng)快、繁殖周期短，能迅速擴(kuò)大種群數(shù)量，有利于積累更多突變。因此太湖大銀魚(yú)種群遺傳多樣性具有較高的單倍性多樣性和較低的核苷酸多樣性特點(diǎn)。另外，通過(guò)比較本研究太湖大銀魚(yú)遺傳多樣性參數(shù)與文獻(xiàn)報(bào)道［7，11，24］的研究結(jié)果，可以得出太湖大銀魚(yú)種群的遺傳多樣性最高。因此，保護(hù)太湖大銀魚(yú)種質(zhì)資源對(duì)于保護(hù)中國(guó)銀魚(yú)種質(zhì)資源的基因遺傳多樣性具有重要意義。

從單倍型間的遺傳距離和NJ 系統(tǒng)樹(shù)可以看出，太湖大銀魚(yú)單倍型間的遺傳距離非常低，所有單倍型聚為一支，表明大銀魚(yú)種群內(nèi)沒(méi)有明顯的遺傳分化，這與夏德全等［14］對(duì)太湖大銀魚(yú)種群的遺傳結(jié)構(gòu)分析結(jié)果是一致的，太湖大銀魚(yú)種群內(nèi)、種群間的遺傳相似性指數(shù)及遺傳距離都十分相近，這可能與歷史上大銀魚(yú)可能受到較為嚴(yán)重的遺傳瓶頸效應(yīng)的影響有關(guān)。但需要注意的是，不同的cyt b 單倍型出現(xiàn)的頻率有較大差異，單倍型LTH7 個(gè)體數(shù)有12 個(gè)，但6 個(gè)單倍型( LTH2、LTH3、LTH4、LTH6、LTH9 和LTH11) 僅有1 個(gè)個(gè)體出現(xiàn)，這一方面可能是大銀魚(yú)種群進(jìn)化過(guò)程中自然選擇的結(jié)果，也可能受到近些年來(lái)太湖較大規(guī)模大銀魚(yú)增殖放流所帶來(lái)的選擇效應(yīng)的影響。假如一旦這些數(shù)量較少的單倍型失去，會(huì)降低大銀魚(yú)的遺傳多樣性。因此，在增值放流之前，有必要對(duì)增殖放流群體與野生群體進(jìn)行遺傳多樣性和種群結(jié)構(gòu)進(jìn)行對(duì)比研究，從而避免增殖放流可能帶來(lái)的不利影響。

物種的遺傳多樣性高低與其適應(yīng)能力、生存能力和進(jìn)化潛力密切相關(guān)。豐富的遺傳多樣性意味著較高的適應(yīng)生存潛力，蘊(yùn)藏著較大的進(jìn)化潛能、豐富的育種和遺傳改良潛力。物種遺傳變異的減少可能導(dǎo)致嚴(yán)重的后果，如成活率、生長(zhǎng)與繁殖效率變低，降低種群個(gè)體對(duì)環(huán)境變化的適應(yīng)能力。本研究結(jié)果表明目前太湖大銀魚(yú)有較高的單倍型多樣性，但核苷酸多樣性較低。同時(shí)大銀魚(yú)的種群波動(dòng)劇烈，對(duì)棲息水環(huán)境質(zhì)量要求很高。因此，為保護(hù)和合理利用太湖大銀魚(yú)資源，我們建議加大太湖環(huán)境保護(hù)力度，改善水環(huán)境質(zhì)量、建立大銀魚(yú)種質(zhì)資源保護(hù)區(qū)，保護(hù)區(qū)內(nèi)禁止一切人類活動(dòng)、控制銀魚(yú)捕撈強(qiáng)度和縮短捕撈時(shí)間等措施，以實(shí)現(xiàn)太湖大銀魚(yú)漁業(yè)的可持續(xù)發(fā)展。

［1］ 張 潔. 銀魚(yú)科魚(yú)類及其物種多樣性保護(hù)［J］. 生物學(xué)通報(bào)，2008，43(6) :4-6.

［2］ 王忠鎖，傅萃長(zhǎng)，雷光春. 中國(guó)銀魚(yú)的多樣性及其保護(hù)對(duì)策［J］. 生物多樣性，2002，10(4) :416-424.

［3］ AVISE J C. A role for molecular genetics in the recognition and conservation of endangered species［J］. Trends in Ecology and Evolution，1989，4: 279-281.

［4］ WAITS L. Mitochondrial DNA phylogeography of the North American brown bear and implications for conservation［J］. Conservation Biology，1989，13: 408-417.

［5］ 羅宏偉，段辛斌，王 珂，等. 三峽庫(kù)區(qū)3 種銀魚(yú)線粒體DNA細(xì)胞色素b 基因序列多態(tài)性分析［J］. 淡水漁業(yè)，2009，39(6) : 16-21.

［6］ 郭 立，李 雋，王忠鎖，等. 基于四個(gè)線粒體基因片段的銀魚(yú)科魚(yú)類系統(tǒng)發(fā)育［J］. 水生生物學(xué)報(bào)，2011，35(3) : 449-459.

［7］ ZHANG J，LI M，XU M Q，et al. Molecular phylogeny of icefish Salangidae based on complete mtDNA cytochrome b sequences，with comments on estuarine fish evolution［J］. Biological Journal of the Linnean Society，2007，91(2) : 325-340.

［8］ ZHAO L，ZHANG J，LIU Z J，et al. Complex population genetic and demographic history of the Salangid，Neosalanx taihuensis，based on cytochrome b sequences［J］. BMC Evolution Biology，2008，8: 201-219.

［9］ 谷孝鴻，白秀玲，江南，等. 太湖漁業(yè)發(fā)展及趨于設(shè)置與功能定位［J］. 生態(tài)學(xué)報(bào)，2006，26 (7) : 2247-2254.

［10］ 周 毅，石建華，錢(qián) 偉，等. 太湖藻類分布及其對(duì)魚(yú)類的毒性試驗(yàn)［J］. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2013，41(4) :311-313.

［11］ 張開(kāi)翔. 大銀魚(yú)胚胎發(fā)育的觀察［J］. 湖泊科學(xué)，1992，4(2) :25-37.

［12］ 王玉芬，蔣全文. 太湖大銀魚(yú)生長(zhǎng)特性的研究［J］. 湖泊科學(xué)，1992，4(1) : 56-62.

［13］ 朱成德. 太湖大銀魚(yú)生長(zhǎng)與食性的初步研究［J］. 水產(chǎn)學(xué)報(bào)，1985，9(3) : 275-287.

［14］ 夏德全，曹 螢，吳婷婷，等. 太湖中大銀魚(yú)、太湖新銀魚(yú)和寡齒新銀魚(yú)群體的遺傳結(jié)構(gòu)［J］. 水產(chǎn)學(xué)報(bào)，1999，23(3) : 254-260.

［15］ SAMBROOK J，RUSSELL D W. Molecular cloning: A laboratory manual［M］. 3 rd ed. New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press，2002: 463-469.

［16］ BURLAND T G. DNASTAR's Laser gene sequence analysis software［J］. Methods in Molecular biology，2000，132: 71-91.

［17］ ROZAS J，SACHEZ-DELBARRIO J C，Messeguer X，et al.DnaSP，DNA polymorphism analyses by the coalescent and other m ethods ［J］. Bioinformatics，2003，19 ( 18) : 2496-2497.

［18］ TAMURA K，DUDLEY J，Nei M，et al. MEGA 4: molecular evolutionary genetics analys is ( MEGA ) softw are version 4.0［J］.Molecular Biology and Evolution，2007，10: 1092-1093.

［19］ GRAY M W，BURGER G，LANG B F. Mitochondrial evolution［J］. Science，1999，283 (5407) : 1476-1481.

［20］ ROGERS A R，HARPENDING H. Population growth makes waves in the distribution of pairwise genetic differences［J］. Molecular Biology and Evolution，1992，9(3) :552-569.

［21］ KOHER T D，THOMAS W K，MEYER A，et al. Dynamics of mitochondrial DNA evolution in an imals: Amplification and sequencing with conserved primers［J］. Proceedings of the National Academy of Sciences，1989，86 (16) : 6196-6200.

［22］ 施立明. 遺傳多樣性及其保存［J］. 生物科學(xué)信息，1990，2(1) : 158-164.

［23］ GRANT W S，BOWEN B W. Shallow population histories in deep evolutionary lineages of marine fishes: insights from sardines and anchovies and lessons for conservation［J］. Journal of Heredity，1998，89: 415-426.

［24］ 趙 亮，張 潔，劉志謹(jǐn)，等. 喬氏新銀魚(yú)基于細(xì)胞色素b 序列的種群遺傳結(jié)構(gòu)和種群歷史［J］. 生物多樣性，2010，18( 3) :251-261.