安 濤，陳慶玉，李 蘇，周英勇，趙志蓉，彭 磊

骨腱損傷為臨床常見運動損傷性疾病，前交叉韌帶(ACL)、肩袖、跟腱及髕韌帶等與骨接觸點損傷最為常見。目前對骨腱損傷行重建手術(shù)治療已成為臨床共識，但術(shù)后骨腱結(jié)合點常不牢固、斷裂，致重建手術(shù)失敗，研究示肩袖損傷術(shù)后失敗率為20%～94%［1］，前交叉韌帶為10%～25%［2］。研究表明術(shù)后早期骨腱結(jié)合處為移植物-骨隧道復(fù)合體的薄弱環(huán)節(jié)［3］，因此，肌腱與骨附著部位早期愈合的質(zhì)量為肌腱移植重建術(shù)成敗的關(guān)鍵。

目前，促進(jìn)骨腱愈合研究眾多，含生長因子介質(zhì)填充［4］、重組骨形態(tài)發(fā)生蛋白(BMP-2)填充等，羥基磷灰石、磷酸三鈣［5］等骨移植材料促進(jìn)骨腱愈合短期效果尚可，但吸收困難、降解性差，療效不明確。本研究采用可注射型海藻酸鈉-明膠-檸檬酸鈣復(fù)合材料，同時經(jīng)過反復(fù)實驗得出各成分最佳比例，并在合適動物實驗?zāi)Ｐ椭袑?fù)合材料注入骨腱間隙中，研究此種材料對骨腱愈合的作用，為臨床治療骨腱損傷提供新方法。

材料與方法

1 材料

1.1 實驗動物 健康成年雄性日本大耳白兔48只，體重3．0～3．5kg，平均(3．3±0．2)kg，溫州醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供。

1.2 試劑與儀器 海藻酸鈉干粉(美國Sigma公司)，明膠干粉(河北綠島公司)，檸檬酸鈣(天津市登峰化學(xué)試劑廠)，電鉆(BOSCH電鉆，德國羅伯特博世有限公司)，鉆頭(上海醫(yī)療器械公司)，電子天平(LIBRORAEG-XT220A型，美國)、離心機(京立，LD5-2A，北京)，全自動組織切片機(LEICA RM2145，德國)、深低溫冰箱(MDF-382E型，SANYO公司)、超凈工作臺(CA-920-3，上海上凈凈化設(shè)備有限公司)、光學(xué)顯微鏡(Olympus，日本)，萬能材料力學(xué)實驗機(Zwick/Roell BTC-FR020TN．A50，德國)，顯微鏡及其攝像機(OLYMPUS B×40顯微鏡，JVC TK-C1381攝像機)。

2 實驗方法

2.1 可注射型檸檬酸鈣復(fù)合材料的制備 根據(jù)文獻(xiàn)［6］及前期實驗結(jié)果，稱取明膠1．5g放入20mL生理鹽水中，高壓滅菌消毒。海藻酸鈉1．0g，高壓滅菌消毒后備用。無菌間內(nèi)，在超凈臺內(nèi)用生理鹽水25mL溶解海藻酸鈉1．0g。再將明膠液與海藻酸鈉溶液混勻，得到海藻酸鈉與明膠質(zhì)量比為2∶3的膠狀液體，靜置后，低速離心，使小氣泡消失。超凈臺內(nèi)抽取上述混合液4mL，加入檸檬酸鈣粉末3．0g(最佳質(zhì)量比，海藻酸鈉∶明膠∶檸檬酸鈣=2∶3∶70)，得到凝固性能最佳，又可良好注入的復(fù)合材料。使用時在注射器內(nèi)攪拌均勻混合成糊狀，在5min內(nèi)使用完畢。

2.2 實驗動物模型的建立 腹腔注射10%水合氯醛麻醉(3．5mL/kg)，生效后雙后肢備皮，仰臥位將動物固定手術(shù)臺上，常規(guī)消毒鋪無菌巾單。采用Nakase動物實驗?zāi)Ｐ停?］(圖1a)。在髕韌帶外側(cè)約1cm位置上下各延長約1cm，仔細(xì)鈍性分離軟組織，暴露趾長伸肌腱，向上、下鈍性分離，在其止點-股骨外側(cè)髁將其切斷，游離的肌腱末端采用4-0縫線行編織縫合(圖1b)。然后將脛前肌筋膜切開，將脛前肌向兩側(cè)分離，在脛骨干骺端近端垂直于脛骨長軸用電鉆鉆取直徑約2．5mm的孔洞，已經(jīng)縫合好的肌腱游離末端穿過骨隧道，在脛骨皮質(zhì)骨嵴垂直脛骨長軸鉆取直徑為約0．2mm的孔洞，穿過Prolene縫線末端，纏繞固定(取材時已證明固定效果良好)(圖1c、d)。將上述制備的可注射型海藻酸鈉-明膠-檸檬酸鈣采用5mL注射器及19號針頭注入右側(cè)骨腱隧道中(以實驗動物右側(cè)肢為實驗側(cè)，左側(cè)為對照側(cè))，對照側(cè)注射相同劑量的海藻酸鈉-明膠共混體。再次聚維酮碘溶液消毒，肌注160萬U青霉素預(yù)防感染，并予以寬松無菌敷料包扎。術(shù)后1周內(nèi)每天手術(shù)刀口聚維酮碘涂抹消毒，肌注80萬U青霉素。

圖1 實驗動物模型建立。a．趾長伸肌腱動物模型;b．游離的肌腱末端Prolene編織縫合;c．采用克氏針行骨隧道造模;d．Prolene線末端脛骨嵴懸吊固定

2.3 標(biāo)本的獲取及檢查

分別于術(shù)后2、4、6、8、10、12周空氣栓塞處死各組動物8只后立即進(jìn)行取材，取4只骨腱標(biāo)本，剔除較長的肌腱、周圍肌肉、韌帶筋膜及其他附著物，沿骨腱界面縱軸切開，在10%中性甲醛溶液固定，用10%的甲酸溶液脫鈣、石蠟包埋，沿骨腱界面縱軸面切片，厚度4μm，行HE染色。采用上述方法進(jìn)行HE染色后，每組隨機取2張切片，光鏡下每張切片取3個視野(×200)，用Image-Pro Plus 8．0圖像分析軟件觀察測量各時間點各組標(biāo)本中移植肌腱周圍每1mm2的新生骨絕對面積。

其余4只保留較長肌腱，游離的趾長伸肌腱末端與脛骨干骺端分別固定于萬能材料實驗機上，測試前將固定于末端趾長伸肌腱與脛骨前端骨嵴的縫線線結(jié)切除，保留脛骨干骺端內(nèi)側(cè)端的固定，以使負(fù)荷作用于骨腱界面，使脛骨干骺端骨腱界面組織成為唯一測試的力，期望斷裂點位于脛骨干骺端骨隧道內(nèi)或是骨腱隧道開口處，行最大拉脫負(fù)荷實驗(maximum pull-out test)，按5mm/min速度加載負(fù)荷，最大加載負(fù)荷為500N，測試時保持室溫(20±2)℃，濕度65%，測試骨腱界面的抗拉脫強度，通過Zwick/Roell軟件描記位移-負(fù)荷曲線。觀察趾長伸肌腱的斷裂部位或者是否從骨隧道內(nèi)拉出，記錄斷裂負(fù)荷或拉脫負(fù)荷，此時的力為最大負(fù)荷。

3 統(tǒng)計學(xué)方法

對實驗數(shù)據(jù)采用SPSS 18．0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)處理，配對t檢驗及獨立樣本t檢驗進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。以P＜0．05為統(tǒng)計學(xué)上差異有顯著性意義，P＜0．01表示差異顯著。

結(jié) 果

1 組織學(xué)觀察

檸檬酸鈣組2周在檸檬酸鈣復(fù)合材料周圍出現(xiàn)大量成骨細(xì)胞;4周時有骨島出現(xiàn)，骨腱間出現(xiàn)大量Sharpey纖維，骨腱間連接緊密且出現(xiàn)大量軟骨細(xì)胞;6周時骨腱間出現(xiàn)更為密集且排列有序的Sharpey纖維，并且在骨腱結(jié)合處夾雜大量成骨細(xì)胞和部分軟骨細(xì)胞;8周時骨腱間Sharpey纖維集結(jié)成束，界面間可見更多的新生骨，組織中含有大量成骨細(xì)胞，移植肌腱與新生骨緊密結(jié)合形成纖維軟骨連接;10周時骨腱結(jié)合處大量的新生骨形成，其間絕大部分可見連續(xù)性纖維軟骨連接，成纖維細(xì)胞明顯減少，并有少量鈣化軟骨形成;12周出現(xiàn)大量的鈣化軟骨，結(jié)合處幾乎全部有新骨生成及纖維軟骨形成，形成直接連接，出現(xiàn)潮線，類似正常的骨腱止點。

而對照側(cè)4周時僅出現(xiàn)少量Sharpey纖維，10周時出現(xiàn)的Sharpey纖維排列才較為密集，12周時骨腱間才僅見少量新骨生成，骨腱間才可見少部分肌腱與周圍骨組織呈纖維軟骨連接(圖2)。

圖2 各組各時間點組織學(xué)觀察結(jié)果。a．4周對照組(HE ×100);b．4周實驗組(HE ×100);c．10周對照組(HE ×100);d．10周對照組(HE ×100);e．12周對照組(HE ×100);f．12周對照組(HE ×100);g．4周實驗組骨腱間可見大量軟量細(xì)胞增生

2 成骨面積分析

從表1可以看出，肌腱周圍新生骨面積在檸檬酸鈣實驗組明顯比對照組多，在各個時間節(jié)點具有差異性，并且這種差異性隨著時間的延長逐漸減少，這說明檸檬酸鈣對新生骨形成具有促進(jìn)作用，這種促進(jìn)作用在早期較為明顯。

3 生物力學(xué)實驗測試

在6周內(nèi)無論實驗側(cè)還是對照側(cè)，拉出部位均在脛骨干骺端隧道內(nèi);其余時間點斷裂部位或拉出部位在各組不完全相同(表2)。實驗側(cè)和對照側(cè)在各時間節(jié)點生物力學(xué)檢查其抗拉脫強度不同，實驗側(cè)在2、4、6周時間節(jié)點與對照側(cè)相比具有更大的抗拉脫強度(P＜0．01)，8周以后伴有少部分為韌帶實質(zhì)部斷裂而非拉脫(pull-out)。以上表明，檸檬酸鈣對骨腱愈合具有促進(jìn)作用，能增加骨腱的抗拉脫強度，但檸檬酸鈣對骨腱抗拉脫的貢獻(xiàn)主要在早期(表3)。

表1 移植肌腱新生骨面積(mm2)

表2 檸檬酸鈣組重建韌帶拉脫或斷裂部位

表3 生物力學(xué)實驗強度(N)

討 論

筆者課題組前期已證實檸檬酸鈣為一種優(yōu)良的骨生物材料［8-11］:(1)對成骨細(xì)胞有正性作用:明顯促進(jìn)成骨細(xì)胞、骨髓基質(zhì)干細(xì)胞增殖、分化;(2)良好骨傳導(dǎo)活性:促進(jìn)兔股骨原位骨缺損良好修復(fù);(3)良好降解性:小鼠肌袋實驗中，6周全部降解，明顯促進(jìn)肌肉內(nèi)骨形態(tài)發(fā)生蛋白(BMP)所致異位成骨;(4)促進(jìn)異位成骨性:大量促進(jìn)大鼠跟腱切斷術(shù)所致異位成骨，新生骨長入跟腱中，骨腱結(jié)合緊密，出現(xiàn)大量軟骨細(xì)胞。據(jù)此，筆者推斷檸檬酸鈣極有可能成為良好的天然骨腱修復(fù)材料促進(jìn)劑。檸檬酸鈣粉末較難填充于骨腱隧道中，且易導(dǎo)致分布不均，局部濃度過高導(dǎo)致毒性。海藻酸鈉分子鏈上含有大量的羥基和羧基，在Ca2+等二價離子存在的條件下，可形成交聯(lián)的海藻酸鈉鈣聚合物，表現(xiàn)為凝膠狀態(tài)［12］，具有很好的機械強度，便于成形。明膠具有親水性強、成膜性好、側(cè)鏈基團(tuán)反應(yīng)活性高、典型的兩性電解質(zhì)特征等諸多優(yōu)良的物理與化學(xué)性質(zhì)，能溶于熱水，冷卻后凍成凝膠狀物。因此，本研究擬采用海藻酸鈉與明膠作為可注射復(fù)合材料的固形劑。

韌帶或者腱的止點根據(jù)其結(jié)構(gòu)不同可以分為直接止點(纖維軟骨止點)和間接止點(纖維止點)。直接止點多位于干骺端，有纖維組織、纖維軟骨、鈣化軟骨、骨組織典型的四層結(jié)構(gòu)，纖維軟骨和鈣化軟骨之間有嗜堿性染色的潮線［13］。正常骨腱止點為典型末端結(jié)構(gòu)，即為上述的直接止點，這類止點存在平行的膠原纖維和纖維軟骨，其線性垂直的結(jié)構(gòu)可以有效傳遞拉力。因此，在骨腱重建術(shù)后，移植肌腱在骨髓道內(nèi)最理想的愈合方式應(yīng)與正常的骨腱止點類似。在本實驗中，對照側(cè)4周時僅出現(xiàn)少量Sharpey纖維，10周時出現(xiàn)的Sharpey纖維排列才較為密集，12周時骨腱間才僅見少量新骨生成，骨腱間可見少部分肌腱與周圍骨組織呈纖維軟骨連接。實驗組骨腱間4周時有骨島出現(xiàn)，骨出現(xiàn)大量Sharpey纖維和大量軟骨細(xì)胞;8周時移植肌腱與新生骨緊密結(jié)合形成纖維軟骨連接;10周時骨腱絕大部分可見連續(xù)性纖維軟骨連接，并有少量鈣化軟骨形成;12周出現(xiàn)呈鈣化軟骨，結(jié)合處幾乎全部有新骨生成及纖維軟骨形成，形成直接連接，出現(xiàn)潮線，類似正常的骨腱止點。實驗組Sharpey纖維、纖維軟骨、鈣化軟骨出現(xiàn)明顯早于對照側(cè)，且骨腱間間隙實驗組比同期對照組明顯減小，說明可注射型海藻酸鈉-明膠-檸檬酸鈣對骨腱愈合具有明顯的促進(jìn)作用，對骨腱間的愈合更易形成直接連接，使其更接近正常狀態(tài)下骨腱結(jié)合部位的組織學(xué)結(jié)構(gòu)特點。

研究表明:5mmol/L的Ca2+濃度為最佳鈣離子成骨濃度［14］，而檸檬酸鈣釋放的Ca2+濃度為5．1mmol/L，理論上符合最佳成骨濃度要求，可有效促進(jìn)成骨。Ca2+也可刺激分泌類胰島素樣生長因子(IGF-1/2)等促分裂因子，促進(jìn)膠原礦化，促進(jìn)成骨細(xì)胞及肌腱細(xì)胞生長［15-16］。Ca2+促進(jìn)分泌的BMP可促進(jìn)、誘導(dǎo)骨生成及纖維結(jié)締組織增生，使骨組織向肌腱內(nèi)長入形成直接愈合，同時BMP在肌腱內(nèi)可誘導(dǎo)成骨，加速損傷肌腱愈合［17］。骨腱愈合過程比較復(fù)雜，基本過程是骨腱愈合界面纖維組織形成連接，新骨形成，骨向肌腱內(nèi)長入，局部塑型改造。檸檬酸鈣組肌腱周圍新生骨面積明顯比對照組多，在各個時間節(jié)點具有差異性，這說明檸檬酸鈣對新生骨形成具有促進(jìn)作用。生物力學(xué)實驗提示術(shù)后6周內(nèi)，實驗側(cè)骨腱愈合抗?fàn)坷瓘姸让黠@高于對照側(cè)，能增加骨腱的抗拉脫強度，說明檸檬酸鈣對骨腱愈合具有促進(jìn)作用。因此可以推斷，可注射型檸檬酸鈣對骨腱愈合的促進(jìn)作用可能通過促進(jìn)新生骨形成，新生骨進(jìn)而長入移植肌腱組織，從而增強骨腱愈合的強度。

本實驗動物模型為關(guān)節(jié)外動物模型，沒有打開關(guān)節(jié)腔，與國內(nèi)外廣泛采用的ACL重建術(shù)動物模型不同，無關(guān)節(jié)液、滑液等的影響，畢竟關(guān)節(jié)內(nèi)與關(guān)節(jié)外的生理環(huán)境具有較大的差異，檸檬酸鈣凝膠在關(guān)節(jié)內(nèi)動物模型中是否具有同樣作用，需進(jìn)一步研究。

［1］Galatz LM，Ball CM，Teefey SA，et al．The outcome and repair integrity of completely arthroscopically repaired large and massive rotator cuff tears［J］．JBone Joint Surg(Am)，2004，86-A(2):219-224．

［2］Vergis A，Gillquist J．Graft failure in intra-articular anterior cruciate ligament reconstructions:a review of the literature［J］．Arthroscopy，1995，11(3):312-321．

［3］Chen CH．Strategies to enhance tendon graft-bone healing in anterior cruciate ligament reconstruction［J］．Chang Gung Med J，2009，32(5):483-493．

［4］Sasaki K，Kuroda R，Ishida K，et al．Enhancement of tendon-bone osteointegration of anterior cruciate ligament graft using granulocyte colony-stimulating factor［J］．Am JSports Med，2008，36(8):1519-1527．

［5］Huangfu X，Zhao J．Tendon-bone healing enhancement using injectable tricalcium phosphate in a dog anterior cruciate ligament reconstruction model［J］．Arthroscopy，2007，23(5):455-462．

［6］夏揚．海藻酸鈉一明膠共混體系為載體的可注射式組織工程骨的研究［D］．中國協(xié)和醫(yī)科大學(xué)博士研究生畢業(yè)論文，2008．

［7］Nakase J，Kitaoka K，Matsumoto K，et al．Facilitated tendon-bone healing by local delivery of recombinant hepatocyte growth factor in rabbits［J］．Arthroscopy，2010，26(1):84-90．

［8］Zhang W，Wang W，Chen QY，et al．Effect of calcium citrate on bone integration in a rabbit femur defect［J］．Asian Pacific J Tropical Med，2012，15(4):310-314．

［9］Ying XZ，Cheng SW，Wang W，et al．Effect of boron on osteogenic differentiation of human bone marrow stromal cells［J］．Biol Trace Elem Res，2011，144(1-3):306-315．

［10］Wang W，Chen QY，Li XC，et al．Enhancement of bone formation with a synthetic matrix containing bone morphogenetic protein-2 by the addition of calcium citrate［J］．Knee Surg Sports Traumatol Arthrosc，2013，21(2):456-465．

［11］Cheng SW，Wang W，Lin ZQ，et al．Effects of extracellular calcium on viability and osteogenic differentiation of bone marrow stromal cells in vitro［J］．Human Cell，2013，26(3):114-120．

［12］鄭洪河，張虎成，夏志清，等．海藻酸鈉溶液的粘度性質(zhì)與流變學(xué)特征［J］．河南師范大學(xué)學(xué)報(自然科學(xué)版)，1997，25(2):55-59．

［13］Francois RJ，Braun J，Khan MA．Entheses and enthesitis:a histopathologic review and velevance to spondycoarthritides［J］．Curr Opin Rheumatol，2001，13(4):255-264．

［14］Maeno S，Niki Y，Matsumoto H，et al．The effect of calcium ion concentration on osteoblast viability，proliferation and differentiation in monolayer and 3D culture［J］．Biomaterials，2005，26(23):4847-4855．

［15］Sugimoto T，Kanatani M，Kano J，et al．IGF-I mediates the stimulatory effect of high calcium concentration on osteoblastic cell proliferation［J］．Am J Physiol，1994，266(5 Pt 1):E709-716．

［16］Honda Y，F(xiàn)itzsimmons R，Baylink DJ，et al．Effects of extracellular calcium on insulin-like growth factor II in human bone cells［J］．J Bone Miner Res，1995，10(11):1660-1665．

［17］Forslund C．BMP treatment for improving tendon repair．Studies on rat and rabbit Achilles tendons［J］．Acta orthop Scand，2003，74(308):1-30．