劉 華，王文明，楊 鑒，任光輝

微小核糖核酸(mioro ribanucleic acid，miRNA) 是一類長度為20～24個(gè)核苷酸的小的內(nèi)源性非編碼調(diào)控RNA，通過靶向結(jié)合信使RNA(messenger RNA，mRNA)的3’非翻譯區(qū)(3’-UTR)導(dǎo)致mRNA的降解或翻譯抑制［1-2］，從而調(diào)控靶基因表達(dá)，參與細(xì)胞增殖、分化、凋亡等一系列重要生物學(xué)進(jìn)程。目前已發(fā)現(xiàn)的miRNA約有700多種，miRNA-21是其中一個(gè)重要的miRNA分子。研究［3］表明miRNA-21在創(chuàng)傷后腦組織中表達(dá)明顯變化，提示miRNA-21可能與顱腦創(chuàng)傷關(guān)系密切。但迄今有關(guān)miRNA-21在顱腦創(chuàng)傷預(yù)后方面的研究卻鮮有報(bào)道。本研究回顧性分析江蘇大學(xué)附屬昆山醫(yī)院122例顱腦創(chuàng)傷患者的臨床資料，并對(duì)上述患者腦組織標(biāo)本進(jìn)行miRNA-21表達(dá)檢測，分析生存期與該基因表達(dá)之間的關(guān)系，試圖探討miRNA-21作為顱腦創(chuàng)傷預(yù)后分子標(biāo)志的可能性。

臨床資料

1 標(biāo)本來源

收集江蘇大學(xué)附屬昆山醫(yī)院2011年12月～2013年12月期間手術(shù)切除顳葉挫傷灶邊緣水腫區(qū)皮層腦組織的石蠟標(biāo)本122例，且對(duì)患者的臨床資料進(jìn)行分析。其中男性99例，女性23例;年齡17～84歲，平均(42．19±14．33)歲。入院時(shí)格拉斯哥昏迷評(píng)分(GCS)4～13分，平均(7．85±2．60)分。顱腦創(chuàng)傷類型:單純性腦挫裂傷42例，急性硬膜下血腫伴腦挫裂傷48例，急性腦內(nèi)血腫伴腦挫裂傷32例，不包括單純性硬膜外及硬膜下血腫。全部患者均排除心、肝、腎等重要臟器疾病。手術(shù)前后的治療方法均按照顱腦創(chuàng)傷臨床救治指南要求執(zhí)行［4-5］。本研究經(jīng)江蘇大學(xué)附屬昆山醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，所有患者均簽署知情同意書。

2 主要試劑及儀器

高速冷凍離心機(jī);NanoDropND-1000紫外分光度計(jì)(Nano Drop公司，美國);7300實(shí)時(shí)聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)系統(tǒng)(Applied Biosystems公司，美國)、9700 Thermocycler反應(yīng)儀(Applied Biosystems，美國);Recover All總核酸提取試劑盒(Applied Biosystems公司，美國);hsa-miRNA-21引物、內(nèi)參RNU6B引物(RiboBio公司，中國);Real-time逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(RR037A，TakaRa公司，日本);SYBR?Select Master Mix試劑盒(Applied Biosystems公司，美國)。

3 實(shí)時(shí)定量PCR方法

3.1 總RNA提取 利用Recover All總核酸提取試劑盒提取腦石蠟組織總RNA，嚴(yán)格遵照說明書進(jìn)行各操作步驟。總RNA用50μL二乙基焦磷酰胺(DEPC)水稀釋，儲(chǔ)存于-80℃?zhèn)溆谩２捎肗ano-DropND-1000紫外分光度計(jì)測量總RNA光密度(OD)260/280。

3.2 逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng) 按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒操作程序進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，RNA的量為0．5μg，冰上加入下列試劑:總RNA 1μL，5×PrimeScript緩沖液5mL，PrimeScript RT逆轉(zhuǎn)錄酶混合Ⅰ1μL，莖環(huán)狀逆轉(zhuǎn)錄引物2μL，DEPC水，總體積20μL。所有試劑加入后，42℃反應(yīng)15min、85℃反應(yīng)5s、4℃反應(yīng)15min，后置-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

3.3 實(shí)時(shí)定量PCR 實(shí)時(shí)定量PCR反應(yīng)體系如下:SYBR?Green Realtime PCR Master Mix 10μL，上游引物(5μM)1μL，下游引物(5μM)1μL，互補(bǔ)脫氧核糖核酸(cDNA)2μL，加DEPC水至20μL。將反應(yīng)管置7300 Real-time PCR反應(yīng)儀中，反應(yīng)條件為95℃預(yù)變性10min后，按下述條件擴(kuò)增40個(gè)循環(huán):95℃15s，60℃1min。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

4 分組

miRNA-21相 對(duì) 表 達(dá) 量 采 用2-△△Ct方 法［6］，△△Ct=△Ct-Avg(Ct表示循環(huán)數(shù)，Avg表示均值)?！鰿t=(CtmiRNA-21-CtU6)-Avg(CtmiRNA-21-CtU6)。把2-△△Ct中位數(shù)作為分界值，將患者分為miRNA-21低表達(dá)組和高表達(dá)組。

5 隨訪

所有患者均傷后隨訪6個(gè)月，以格拉斯哥預(yù)后評(píng)分(GOS)評(píng)價(jià)治療效果，其中1分(死亡)、2分(重度殘疾)和3分(中度殘疾)者為預(yù)后不良，4分(輕度殘疾)和5分(良好)為預(yù)后良好。

6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

miRNA-21表達(dá)與臨床參數(shù)統(tǒng)計(jì)方法采用χ2檢驗(yàn);采用Kaplan-Meier方法進(jìn)行生存分析，并采用Log-rank檢驗(yàn)比較兩組生存率;采用Cox風(fēng)險(xiǎn)比例模型進(jìn)行各個(gè)協(xié)變量的聯(lián)合效應(yīng)分析。應(yīng)用SPSS 19．0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。P＜0．05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 miRNA-21表達(dá)與顱腦創(chuàng)傷患者臨床資料

根據(jù)miRNA-21的表達(dá)，顱腦創(chuàng)傷患者被分為高表達(dá)和低表達(dá)組。122例顱腦創(chuàng)傷組織中，61例miRNA-21相對(duì)高表達(dá)。統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示，miRNA-21的表達(dá)量與患者預(yù)后相關(guān)(χ2=4．006，P=0．045)。miRNA-21的表達(dá)量與年齡、性別、入院時(shí)GCS評(píng)分、致傷原因及顱腦創(chuàng)傷類型均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0．05)(表1)。

2 miRNA-21表達(dá)與顱腦創(chuàng)傷患者生存時(shí)間的關(guān)系

利用Kaplan-Meier對(duì)122例患者進(jìn)行生存分析，結(jié)果顯示:miRNA-21高表達(dá)組患者中位生存時(shí)間159d，較miRNA-21低表達(dá)組患者(平均126d)明顯延長，兩組生存期差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Log-rank檢驗(yàn):χ2=9．723;P=0．002)(圖1)。Cox風(fēng)險(xiǎn)比例模型單因素分析顯示:入院時(shí)GCS評(píng)分［風(fēng)險(xiǎn)比(HR)=1．761;P=0．035］和miRNA-21表達(dá)情況(HR=1．347;P=0．027)與顱腦創(chuàng)傷患者預(yù)后相關(guān)(表2)。根據(jù)Cox回歸模型多因素分析的結(jié)果，入院時(shí)GCS評(píng)分(HR=1．915;P=0．031)和miRNA-21表達(dá)情況(HR=1．535;P=0．025)是顱腦創(chuàng)傷患者預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素(表2)。

表1 miRNA-21表達(dá)與顱腦創(chuàng)傷患者臨床參數(shù)的關(guān)系

表2 顱腦創(chuàng)傷患者生存期單因素及多因素Cox回歸分析

圖1 不同miRNA-21表達(dá)水平顱腦創(chuàng)傷患者的生存分析

討 論

近年來，隨著顱腦創(chuàng)傷救治指南的實(shí)施和完善，腦創(chuàng)傷患者的預(yù)后有了很大改善，但重度顱腦創(chuàng)傷的病死率及致殘率仍較高［7］。因此，詳細(xì)了解其機(jī)制對(duì)診斷、治療和改善預(yù)后必不可少。有實(shí)驗(yàn)研究［8］表明，腦創(chuàng)傷后大鼠皮層腦組織中存在大量miRNA表達(dá)，其中傷后24h 2倍以上差異表達(dá)的27個(gè);傷后48h 2倍以上差異表達(dá)的27個(gè);傷后72h 2倍以上差異表達(dá)的24個(gè)，提示miRNA可能參與了顱腦創(chuàng)傷的發(fā)病機(jī)制和病理過程。同時(shí)多項(xiàng)研究表明miRNA-21在顱腦創(chuàng)傷后顯著高表達(dá)［3，9］。本研究回顧分析122例顱腦創(chuàng)傷患者的臨床資料，并采用實(shí)時(shí)PCR方法對(duì)上述患者挫傷腦組織標(biāo)本中miRNA-21的表達(dá)水平進(jìn)行檢測，以期為在分子水平對(duì)顱腦創(chuàng)傷預(yù)后進(jìn)行干預(yù)提供理論參考。

miRNA是一類非編碼小分子RNA，可通過特異性降解mRNA或抑制蛋白翻譯從而調(diào)控靶基因表達(dá)，參與細(xì)胞生長發(fā)育、分化凋亡等重要的生命進(jìn)程［10］。近期研究表明，miRNA-21在顱腦創(chuàng)傷后皮層腦組織、海馬組織、齒狀回等多個(gè)區(qū)域中表達(dá)顯著上調(diào)，且該研究還通過miRanda，TargetScan和PicTar三種預(yù)測檢索工具確認(rèn)出程序性細(xì)胞死亡4(PDCD4)、T-lymphom侵襲轉(zhuǎn)移基因(Tiam1)、Peli-1基金、B淋巴細(xì)胞瘤-2(BCL-2)、多梳蛋白4(CBX4)、FASLG基因、白介素12A(IL12A)、同源框同源1基因(MSX1)、NTF3基因和腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子499(TRAF499)等共99種在3’-UTR含有miRNA-21結(jié)合位點(diǎn)的潛在靶基因［9］，提示miRNA-21在顱腦創(chuàng)傷演變過程中或扮演重要角色。此外，Truettner等［11］研究發(fā)現(xiàn)，早期亞低溫治療可通過一類體溫敏感性miRNA(miRNA-874和miRNA-451等)所涉及的細(xì)胞活動(dòng)，改善腦創(chuàng)傷大鼠的預(yù)后。

本研究發(fā)現(xiàn)122例顱腦創(chuàng)傷患者的臨床資料中，miRNA-21表達(dá)與年齡、性別、入院時(shí)GCS評(píng)分、受傷機(jī)制及顱腦創(chuàng)傷類型均無明顯相關(guān)，卡方結(jié)果提示miRNA-21表達(dá)與患者預(yù)后相關(guān)。Cox單變量和多變量分析也進(jìn)一步顯示總生存期與miRNA-21表達(dá)有關(guān)，miRNA-21在創(chuàng)傷后皮層腦組織中的表達(dá)程度與患者預(yù)后關(guān)系密切。而生存分析提示miRNA-21表達(dá)與患者總生存期呈正相關(guān)，即miRNA-21表達(dá)水平高的患者生存時(shí)間較長。以上結(jié)果表明miRNA-21可能是判斷顱腦創(chuàng)傷預(yù)后的一個(gè)重要指標(biāo)。

綜上所述，miRNA-21高表達(dá)提示顱腦創(chuàng)傷預(yù)后良好，miRNA-21可作為顱腦創(chuàng)傷預(yù)后的一個(gè)重要分子標(biāo)志，未來值得進(jìn)一步開展嚴(yán)格的前瞻性臨床研究進(jìn)一步證實(shí)該結(jié)果的可靠性。

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