白 樺，李 祥，聶 晶，韓衛(wèi)東，孟元光

解放軍總醫(yī)院，北京 1008531婦產(chǎn)科；2基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)所分子生物室

低劑量地西他濱增強(qiáng)T細(xì)胞對宮頸癌細(xì)胞殺傷活性研究

白 樺1，李 祥2，聶 晶2，韓衛(wèi)東2，孟元光1

解放軍總醫(yī)院，北京 1008531婦產(chǎn)科；2基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)所分子生物室

目的研究低劑量地西他濱是否可增強(qiáng)T細(xì)胞對宮頸癌細(xì)胞殺傷活性，并探討其可能的作用機(jī)制。方法CCK-8檢測低劑量地西他濱對宮頸癌細(xì)胞增殖的影響，流式細(xì)胞儀檢測低劑量地西他濱處理后宮頸癌細(xì)胞凋亡及周期的變化；CCK-8檢測T細(xì)胞對低劑量地西他濱處理后宮頸癌細(xì)胞的殺傷作用，實(shí)時(shí)定量PCR法檢測地西他濱處理后宮頸癌細(xì)胞癌/睪丸抗原(cancer testis antigen，CTA)及FasL的mRNA表達(dá)的變化。結(jié)果10 nmol/L地西他濱對宮頸癌細(xì)胞增殖、凋亡沒有顯著影響，100 nmol/L地西他濱一定程度上抑制細(xì)胞增殖。10 nmol/L地西他濱雖不直接抑制細(xì)胞增長，但使宮頸癌細(xì)胞對T細(xì)胞的殺傷效應(yīng)更為敏感，以效靶比為10∶1時(shí)最顯著。10 nmol/L地西他濱處理后宮頸癌細(xì)胞BORIS、NY-ESO-1、MAGE-A1/ A3/A4等CTA及FasL的mRNA水平顯著上調(diào)(P＜0.05)。結(jié)論低劑量地西他濱可抑制Hela及SiHa細(xì)胞的生長及存活，增強(qiáng)T細(xì)胞對Hela及SiHa細(xì)胞的殺傷能力，是一個(gè)潛在的免疫治療輔助藥物。

地西他濱；宮頸癌；癌睪丸抗原；免疫治療

地西他濱(decitabine，DAC)是一種2′-脫氧胞苷類似物，是特異的DNA甲基化轉(zhuǎn)移酶抑制劑[1]，具有去甲基化的作用，能激活某些沉默基因表達(dá)[2]。研究表明，低劑量DAC具有長期的表觀修飾“記憶”效應(yīng)，通過該效應(yīng)可直接抑制腫瘤細(xì)胞的生長[3]。DAC于2006年經(jīng)美國FDA批準(zhǔn)進(jìn)入臨床應(yīng)用，主要用于治療血液系統(tǒng)疾病骨髓增生異常綜合征[4]。研究結(jié)果顯示，DAC在實(shí)體瘤中有廣泛的應(yīng)用前景，如在肝癌、肺癌、結(jié)腸癌、卵巢癌中有化療增敏作用[5-8]。宮頸癌的發(fā)生、發(fā)展與多個(gè)基因啟動(dòng)子區(qū)異常甲基化所導(dǎo)致的基因沉默有關(guān)[9]，包括許多調(diào)控免疫相關(guān)的基因。而DNA甲基化在調(diào)控免疫相關(guān)基因如癌/睪丸抗原(cancer/ testis antigen，CTA)基因的表達(dá)中起著重要作用[10]，而CTA的表達(dá)有助于提高腫瘤細(xì)胞的免疫原性[11]，增強(qiáng)T細(xì)胞對腫瘤細(xì)胞的識(shí)別殺傷能力，為特異性免疫治療提供可能。本實(shí)驗(yàn)通過研究低劑量地西他濱對宮頸癌細(xì)胞Hela及SiHa的凋亡、增殖及周期的影響，T細(xì)胞對地西他濱處理后Hela及SiHa細(xì)胞的殺傷作用以及Hela及SiHa細(xì)胞相關(guān)CTA表達(dá)的變化，探討地西他濱促進(jìn)T細(xì)胞殺傷Hela及SiHa細(xì)胞的作用機(jī)制，為地西他濱用于臨床宮頸癌的免疫治療提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

材料和方法

1材料 人宮頸癌細(xì)胞株Hela及SiHa(本實(shí)驗(yàn)室保存)；胎牛血清(Gibco)、1640培養(yǎng)液(Invitrogen)、MEM培養(yǎng)液(Invitrogen)、GT-T551培養(yǎng)液(Invitrogen)；青鏈霉素(Gibco)；CCK-8試劑盒(Dojindo)；細(xì)胞凋亡檢測試劑盒(BD)；細(xì)胞周期檢測試劑盒(BD)；Trizol(Invitrogen)；反轉(zhuǎn)錄試劑盒(TOYOBO)；SYBR Green Master Mix (TOYOBO)；地西他濱(中國西安楊森)，淋巴細(xì)胞分離液(Ficoll)，rIL-2、CD3(本實(shí)驗(yàn)室免疫室)。

2細(xì)胞培養(yǎng)及藥物處理 宮頸癌Hela及SiHa細(xì)胞分別使用含10%胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS)及1%的100 U/ml青鏈霉素的1640、MEM培養(yǎng)液，于37℃、5% CO2條件下培養(yǎng)。選取對數(shù)生長期的細(xì)胞，接種于6孔板中，待貼壁后，用濃度分別為0 nmol/L、10 nmol/L、100 nmol/L的地西他濱處理72 h。T細(xì)胞的培養(yǎng)：取健康人外周血10 ml，用淋巴細(xì)胞分離液按常規(guī)方法分離外周血中單個(gè)核細(xì)胞，置于CD3抗體包被的培養(yǎng)瓶中，4 d后按0.1%加入rIL-2，隔天補(bǔ)加。

3CCK-8檢測Hela及SiHa細(xì)胞的增殖 按前述方法藥物處理72 h后，將細(xì)胞按照0.5×104/孔鋪于96孔板中，每組3個(gè)平行孔，每天進(jìn)行檢測，將培養(yǎng)液去除，每孔加入100 μl含10% CCK-8的無血清培養(yǎng)基，在37℃、5% CO2條件下培養(yǎng)1.5 h，在酶聯(lián)免疫檢測儀上450 nm下測各孔吸光度(optical density，OD)值。

4流式細(xì)胞儀檢測Hela及SiHa細(xì)胞的凋亡按Annexin V-PI凋亡試劑盒說明書操作。以適量無EDTA胰酶消化、分別收集地西他濱處理72 h后的Hela及SiHa細(xì)胞，磷酸鹽緩沖液(phosphate buffer solution，PBS)洗滌、重懸細(xì)胞，收集(1 ～ 5)× 105個(gè)細(xì)胞，2 000 r/min 5 min離心沉淀，加入500μl Binding buffer重懸細(xì)胞，向重懸液中加入5μl Annexin V-FITC染色，隨后加入5μl碘化乙錠(propidium iodide，PI)染色，室溫下避光孵育15 min，流式細(xì)胞儀檢測凋亡率。

5流式細(xì)胞技術(shù)(PI、FITC雙染法)檢測Hela及SiHa細(xì)胞周期 分別胰酶消化、收集地西他濱處理72 h后的Hela及SiHa細(xì)胞.2 000 r/min離心5 min，并用PBS洗滌細(xì)胞，之后加入預(yù)冷70%乙醇于4℃固定過夜，第2天離心收集細(xì)胞，以1 ml的PBS洗細(xì)胞1次，加入500μl PBS(含50μg/ml碘化乙錠(PI)，100μg/ml RNaseA)，4℃避光孵育30 min后離心棄上清，最后在流式管中以標(biāo)準(zhǔn)程序于BD FACS Calibur流式細(xì)胞儀上檢測。

6T細(xì)胞殺傷活性檢測 按前述方法藥物處理72 h后，將細(xì)胞按照0.5×104/孔鋪于96孔板中，每組取3個(gè)平行孔，貼壁后將T細(xì)胞分別按不同效靶比1∶1、10∶1、50∶1加入，共培養(yǎng)24 h。將培養(yǎng)液去除，用PBS輕輕震蕩洗去懸浮狀態(tài)的T細(xì)胞，每孔加入100μl含10% CCK-8的無血清培養(yǎng)基，在37℃、5% CO2條件下培養(yǎng)2 h，在酶聯(lián)免疫檢測儀上450 nm下測各孔吸光度值。

7實(shí)時(shí)定量PCR檢測Hela及SiHa細(xì)胞相關(guān)CTA的表達(dá) Trizol抽提各個(gè)細(xì)胞總RNA。所提取RNA用紫外分光度計(jì)測得A260和A280，取1μg RNA用逆轉(zhuǎn)錄酶M-MLV和oligo-dT引物合成cDNA。采用SYBR qPCR Mix試劑進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR檢測，相關(guān)引物序列見表1。

8統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 所有實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次，結(jié)果采用SPSS18.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，組間比較采用t-test，結(jié)果以±s表示，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表1 實(shí)時(shí)定量PCR相關(guān)引物序列Tab. 1 Primers used to perform qRT-PCR of CTA and FasL

結(jié) 果

1低劑量地西他濱抑制Hela及SiHa的增殖 與對照組相比，10 nmol/L及100 nmol/L DAC處理后的Hela及SiHa細(xì)胞增殖受到不同程度的抑制，選取對細(xì)胞毒性最小的10 nmol/L作為使用劑量。見圖1。

2低劑量地西他濱促進(jìn)Hela及SiHa細(xì)胞凋亡與對照組相比，DAC處理72 h后對宮頸癌Hela及SiHa細(xì)胞凋亡的影響無明顯差異。見圖2。

3低劑量地西他濱導(dǎo)致Hela及SiHa細(xì)胞G1/S期阻滯 與對照組相比，DAC處理72 h后，Hela及SiHa細(xì)胞G0/G1期比例增加，S期和G2/M期比例下降。見圖3。

4低劑量地西他濱增強(qiáng)T細(xì)胞對Hela及SiHa細(xì)胞的殺傷活性 與對照組相比，DAC處理后的Hela及SiHa細(xì)胞被T細(xì)胞殺傷更顯著，并隨著效靶比增加作用逐漸增強(qiáng)。Hela細(xì)胞在效靶比為10∶1時(shí)差異最為顯著，SiHa細(xì)胞隨著效靶比增加差異逐漸明顯。差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。見圖4。

5低劑量地西他濱上調(diào)Hela及SiHa細(xì)胞相關(guān)CTA及FasL的mRNA的表達(dá) DAC處理72 h后，Hela及SiHa細(xì)胞中的BORIS、NY-ESO-1、MAGE-A1/A3/A4及FasL的mRNA的表達(dá)水平明顯升高(P＜0.05)。見圖5。

圖 1 地西他濱抑制宮頸癌Hela，SiHa細(xì)胞增殖Fig. 1 DAC inhibiting the proliferation of Hela and SiHa cells (aP＜0.05, vs blank)

圖 2 地西他濱增加宮頸癌Hela，SiHa細(xì)胞凋亡Fig. 2 DAC increasing Hela and SiHa cells apoptosis (aP＜0.05, vs blank)

討 論

腫瘤的發(fā)生、發(fā)展是免疫系統(tǒng)與癌細(xì)胞相互作用的動(dòng)態(tài)過程，包括清除、平衡和逃逸3個(gè)階段。免疫逃逸狀態(tài)解除、細(xì)胞恢復(fù)免疫原性是腫瘤免疫治療中的一個(gè)重大問題[12]。CTA是已知的幾乎僅受到甲基化調(diào)控的腫瘤抗原[13-14]。恢復(fù)CTA的表達(dá)，可有效達(dá)到這個(gè)目的。目前，用于臨床疫苗試驗(yàn)的癌睪丸抗原主要有針對NY-ESO-1及MAGEA3的免疫疫苗[15-16]。

圖 3 地西他濱造成宮頸癌Hela，SiHa細(xì)胞G1/S期阻滯Fig. 3 DAC promoting Hela and SiHa cells G1/S cycle arrest

圖 4 地西他濱增強(qiáng)T細(xì)胞對宮頸癌Hela， SiHa細(xì)胞殺傷活性Fig. 4 DAC enhancing T cell killing ability to Hela and SiHa cells (aP＜0.05, vs blank)

圖 5 地西他濱增強(qiáng)宮頸癌細(xì)胞中的BORIS、NY-ESO-1、MAGEA1、 MAGEA3、 MAGEA4 及FasL 的mRNA的表達(dá)Fig. 5 DAC increasing the expression levels of BORIS, NY-ESO-1, MAGEA1, MAGEA3, MAGEA4 and FasL mRNAs of Hela and SiHa cells (aP＜0.05, vs blank)

本研究顯示，10 nmol/L地西他濱對宮頸癌細(xì)胞增殖和凋亡沒有顯著影響，100 nmol/L地西他濱一定程度上抑制細(xì)胞增殖。而10 nmol/L地西他濱雖不直接抑制細(xì)胞增長，但使宮頸癌細(xì)胞對T細(xì)胞的殺傷效應(yīng)更為敏感，以效靶比為10∶1時(shí)最顯著。為探討地西他濱增強(qiáng)T細(xì)胞殺傷作用的可能機(jī)制，我們篩選發(fā)現(xiàn)，DAC不同程度地上調(diào)了癌睪丸抗原中BORIS、NY-ESO-1、MAGE-A1/A3/ A4的mRNA的表達(dá)，并且增強(qiáng)了細(xì)胞凋亡通路中FasL的表達(dá)[16]，表明DAC處理后可能通過激活FasL通路促進(jìn)細(xì)胞的凋亡，但是，DAC處理后上調(diào)的CTA之間有無互相促進(jìn)表達(dá)升高的機(jī)制[17]，DAC是否僅通過增加FasL的表達(dá)來調(diào)控宮頸癌的發(fā)生、發(fā)展[18]，還有哪些通路參與其中都有待于進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。

因此，通過系統(tǒng)合理地應(yīng)用去甲基化藥物DAC，提高CTA表達(dá)率，有助于提高腫瘤細(xì)胞的免疫原性，促進(jìn)以T細(xì)胞對腫瘤細(xì)胞的識(shí)別和殺傷為主的生物免疫治療。本研究為地西他濱用于臨床宮頸癌的免疫治療提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

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Effect of T cell killing ability on low-dose decitabine treated cervical cancer cells

BAI Hua1, LI Xiang2, NIE Jing2, HAN Weidong2, MENG Yuanguang
1Department of Obstetrics and Gynecology;21Department of Molecular Biology, Institute of Basic Medicine Chinese PLA General Hospital, Beijing 100853, China

MENG Yuanguang. Email: meng6512@vip.sina.com

ObjectiveTo study the effect of T cell killing ability on low-dose decitabine (DAC) treated cervical cancer cells and explore its possible mechanism.MethodsCCK-8 was used to test the proliferation of low-dose DAC treated cervical cancer cells. Flow cytometry assay was used to test the apoptosis and cell cycle of low-dose DAC treated cervical cancer cells. CCK-8 was also used to test T cell killing ability of low-dose DAC treated cervical cancer cells. Real-Time PCR was used to test the expression of BORIS, NYESO-1, MAGEA1, MAGEA3, MAGEA4 and FasL on low-dose DAC treated cervical cancer cells.Results10 nmol/L of DAC showed no significant difference in the proliferation and apoptosis of cervical cancer cells, while 100 nmol/L of DAC inhibited the proliferation of cervical cancer cells. Though 10 nmol/L of DAC did not inhibit the proliferation of cervical cancer cells directly, it enhanced T cell killing ability to cervical cancer cells most significantly with the efficient targeting ratio of 10∶1. Also 10 nmol/L of DAC showed significant up-regulation in the mRNA expression of CTAs such as BORIS, NYESO-1, MAGEA1, MAGEA3 and MAGEA4, as well as FasL.ConclusionThese results suggest that low-dose DAC may work as a potential biological immunotherapy drug to inhibit cell viability and enhance T cell killing ability in cervical cancer cells.

decitabine; cervical cancer; cancer testis antigen; immunotherapy

R 737.33

A

2095-5227(2015)05-0497-05

10.3969/j.issn.2095-5227.2015.05.023< class="emphasis_bold">網(wǎng)絡(luò)出版時(shí)間：

時(shí)間：2015-02-16 09:48網(wǎng)絡(luò)出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/11.3275.R.20150216.0948.002.html

2014-11-13

國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(81472838；81272867)

Supported by the National Natural Science Foundation of China(81472838; 81272867)

白樺，女，在讀碩士，醫(yī)師。研究方向：婦科腫瘤。Email: baihua.353@163.com

孟元光，男，主任醫(yī)師，教授，博士生導(dǎo)師。Email: me ng6512@vip.sina.com