蘇航 何劍波 侯沛紅 康小剛

腦心通膠囊是由黃芪、赤芍、丹參、當(dāng)歸、川芎、桃仁、紅花、牛膝、桂枝等16味中藥制成的復(fù)方制劑，具有益氣活血、化瘀通絡(luò)的功效，用于中風(fēng)所致半身不遂，肢體麻木，口眼歪斜，舌強(qiáng)語(yǔ)謇及胸痹所致胸悶、心悸、氣促等。近年我院常用該藥效果較好，尤其對(duì)改善中風(fēng)后的肢體麻木，口眼歪斜，效果較好。方中含量最多的藥材是黃芪，其次丹參、當(dāng)歸、紅花等［1］。為了表征該方中的主要有效成分，筆者采用高效液相色譜(HPLC)法對(duì)其進(jìn)行分析，參照中藥注射劑指紋圖譜的有關(guān)技術(shù)要求［2］進(jìn)行試驗(yàn);同時(shí)對(duì)該制劑中4個(gè)功效成分即黃芪甲苷、毛蕊異黃酮葡萄糖苷、丹酚酸B、羥基紅花黃色素A進(jìn)行定量分析。

1 儀器與試藥

島津高效液相色譜儀，附 LC-20AD雙泵，SPDM20A二極管陣列檢測(cè)器，SIL-20ACHT自動(dòng)進(jìn)樣器，CTO-20A柱溫箱，LC/Labsoluion色譜工作站，日本島津公司;電子分析天平，1/10萬(wàn)g，型號(hào)ME235S，德國(guó)塞多利斯公司;SK250-LHC超聲波發(fā)生器，上海科導(dǎo)超聲儀器有限公司。乙腈、甲醇，色譜級(jí)，美國(guó)Honeywell公司;水為自制超純水，由Millipore純水儀，美國(guó)millipore公司;其余為分析純。黃芪甲苷、毛蕊異黃酮苷、丹酚酸B、羥基紅花黃色素A對(duì)照品均購(gòu)自中國(guó)藥品生物制品檢定所;腦心通膠囊(批號(hào)20140224、20140225、20140226、201400301、20140302、20140306、20140309、20140033、20140316、2014018)，陜西步長(zhǎng)制藥有限公司。

2 指紋圖譜測(cè)定方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 色譜柱:Kromasil C18色譜柱(250×4.6 mm，5 μm，瑞士 Kromasil公司);流動(dòng)相:乙腈(A)－0.6%磷酸水溶液溶液(B)，梯度洗脫，0 ～30 min，A 10%→25%;30～60 min，A 25%→60%:60～65 min，A 60%→67%;65～75 min，A67%;75～95 min，A 67%→100%。記錄時(shí)間為 95 min。體積流量:0.8 ml/min;柱溫:30℃;檢測(cè)波長(zhǎng):322 nm;進(jìn)樣20 μl。

2.2 參比物與供試品溶液的制備

2.2.1 參比物溶液的配制:精密稱(chēng)取毛蕊異黃酮葡萄糖苷對(duì)照品適量，加流動(dòng)相制成質(zhì)量濃度為100 μg/ml的溶液，搖勻，即得。

2.2.2 供試品的制備:取10粒本品內(nèi)容物，混勻，稱(chēng)取1.0 g，精密稱(chēng)定，置于50 ml量瓶中，加80%甲醇適量，超聲 30 min，放涼，加 80%甲醇至刻度，濾過(guò)(0.45 μm 濾膜)，濾液作為供試品溶液。

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1 精密度試驗(yàn):取供試品溶液(批號(hào)20140224)，連續(xù)進(jìn)樣6次，分別對(duì)共有峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積進(jìn)行考察。結(jié)果表明，各共有峰的相對(duì)保留時(shí)間RSD小于1.0%;相對(duì)峰面積RSD小于2.0%，表明儀器精密度良好。

2.3.2 穩(wěn)定性試驗(yàn):取供試品溶液(批號(hào)20140224)，分別于 0、2、4、8、12、24 h 進(jìn)樣分析，考察共有峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積。結(jié)果表明，各共有峰相對(duì)保留時(shí)間 RSD小于1.0%，相對(duì)峰面積 RSD小于2.0%，表明供試品在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.3.3 重復(fù)性試驗(yàn):取供試品(批號(hào)20140224)6份，分別按供試品溶液的制備與檢測(cè)方法進(jìn)行檢測(cè)，分別對(duì)共有峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積進(jìn)行考察。結(jié)果表明，各共有峰相對(duì)保留時(shí)間RSD小于1.0%，相對(duì)峰面積RSD小于2.0%，表明重復(fù)性良好。

2.3.4 指紋圖譜建立與相似度分析:取10批樣品，分別按供試品溶液的制備與檢測(cè)方法進(jìn)行檢測(cè)，進(jìn)樣20 μl，記錄指紋圖譜，峰10為毛蕊異黃酮葡萄糖苷，建立指紋圖譜。10批樣品共有色譜峰的相對(duì)保留時(shí)間的RSD均小于1.0%，相對(duì)峰面積的RSD均小于5.0%，符合指紋圖譜研究技術(shù)的要求。運(yùn)用中國(guó)藥典委員會(huì)“中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)2004A版”對(duì)10批腦心通膠囊的指紋圖譜進(jìn)行相似度分析，首先將色譜工作站數(shù)據(jù)導(dǎo)入中藥指紋圖譜相似度計(jì)算軟件，選定33個(gè)共有峰進(jìn)行譜峰匹配，通過(guò)中位數(shù)矢量計(jì)算得出樣品指紋圖譜的共有模式，并以此共有模式為標(biāo)準(zhǔn)，進(jìn)行整體相似度評(píng)價(jià)，結(jié)果相似度為0.954～0.992，表明這10批腦心通膠囊的化學(xué)成分一致性較好。見(jiàn)圖 1、2。

圖1 腦心通膠囊HPLC指紋圖譜

圖2 10批腦心通膠囊的HPLC指紋圖譜

3 含量測(cè)定方法與結(jié)果

3.1 色譜條件 除黃芪甲苷的檢查波長(zhǎng)為203 nm外，其余均同色譜條件“2.1”項(xiàng)。

3.2 對(duì)照品溶液的制備 分別精密稱(chēng)取羥基紅花黃色素對(duì)照品6.0 mg、毛蕊異黃酮葡萄糖苷6.0 mg、丹酚酸 B 7.5 mg、黃芪甲苷 7.5 mg，分別置于各 5 ml量瓶中，分別加80%甲醇至刻度，搖勻，即得各對(duì)照品溶液。再分別精密量取羥基紅花黃色素對(duì)照品溶液1.00 ml、毛蕊異黃酮葡萄糖苷對(duì)照品溶液 0.01 ml、丹酚酸對(duì)照品溶液 1.00 ml、黃芪甲苷對(duì)照品溶液0.05 ml置10 ml量瓶中，加80%甲醇至刻度，搖勻，即得混合對(duì)照品溶液的母液。

3.3 供試品溶液的制備 同“2.2.2”項(xiàng)。

3.4 線性關(guān)系的考察 分別精密量取混合對(duì)照品母液0.13、0.26、0.52、0.67、1.0 ml對(duì)照品溶液分別置于1 ml量瓶中并加80%甲醇稀釋至刻度，用0.45 μm微孔濾膜濾過(guò)，即得5個(gè)濃度組，進(jìn)樣。分別以各對(duì)照品的濃度(x)為橫坐標(biāo)，峰面積積分值(y)為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算，得回歸方程。見(jiàn)表1。

表1 各對(duì)照品的線性方程及其濃度范圍

3.5 精密度試驗(yàn) 精密吸取上述線性對(duì)照品溶液(線性樣品:0.52 ml母液)，重復(fù)進(jìn)樣5次，測(cè)得羥基紅花黃色素A、毛蕊異黃酮葡萄糖苷、丹酚酸B、黃芪甲苷的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)差(RSD)分別為 1.21%，1.12%，1.08%，1.02%，1.52%，表明儀器精密度良好。

3.6 重復(fù)性試驗(yàn) 精密稱(chēng)取樣品(批號(hào)20140224)5份，分別按“2.2.3”項(xiàng)下方法制備供試品，按“2.2.1”項(xiàng)下條件測(cè)定。結(jié)果:羥基紅花黃色素A、毛蕊異黃酮葡萄糖苷、丹酚酸B、黃芪甲苷平均含量與RSD值分別為 0.422mg/g、1.22%，0.036 mg/g、1.31%，2.396 mg/g、1.21%，0.078 mg/g、1.14%，表明該方法重復(fù)性良好。

3.7 穩(wěn)定性試驗(yàn) 精密吸取上述線性對(duì)照品溶液(線性樣品:0.52 ml母液)，在第 0、2、4、8、12、24 h 進(jìn)樣。結(jié)果:羥基紅花黃色素A、毛蕊異黃酮葡萄糖苷、丹酚酸 B、黃芪甲苷的峰面積的 RSD值分別為1.01%、1.34%、1.08%、1.27%、1.42%，表明該溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

3.8 加樣回收率試驗(yàn) 取腦心通膠囊(批號(hào)20140224，其中羥基紅花黃色素A、毛蕊異黃酮葡萄糖苷、丹酚酸 B、黃芪甲苷分別為 0.422、0.036、2.396、0.078 mg/g)10 粒內(nèi)容物，混勻，稱(chēng)取粉末 1.0 g，精密稱(chēng)定，分別添加混合對(duì)照品溶液(精密稱(chēng)取丹酚酸B對(duì)照品溶液22.5 mg置于5 ml量瓶中，再分別精密量取“3.2”項(xiàng)下線性對(duì)照品溶液濃度為1.2 mg/ml羥基紅花黃色素 A 1.5 ml、1.2 mg/ml毛蕊異黃酮葡萄糖苷0.15 ml、1.5 mg/ml黃芪甲苷 0.15 ml于量瓶，加80%甲醇至刻度)0.25、0.50、1.00 ml，照“2.2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，重復(fù)制樣6份，按照“3.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定。見(jiàn)表2。

表2 加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果

3.9 含量測(cè)定 精密稱(chēng)10批樣品，分別按“2.2.3”項(xiàng)下方法制備供試品，按“2.2.1”項(xiàng)下條件測(cè)定。結(jié)果，羥基紅花黃色素A、毛蕊異黃酮葡萄糖苷、丹酚酸B、黃芪甲苷含量(mg/粒，0.4 g/粒)分別為 0.169、0.014、0.965 和 0.032 mg/粒，RSD(%)分別 1.37、1.67、0.95 和 1.57%。

4 討論

4.1 波長(zhǎng)的選擇 采用全波長(zhǎng)對(duì)腦心通膠囊樣品進(jìn)行測(cè)定，并采集其三維色譜圖，通過(guò)綜合考慮該三維色譜圖在所有波長(zhǎng)下出峰的多少，和各成分的分離情況以及各色譜峰的豐度，最后選定322 nm作為指紋圖譜定性與羥基紅花黃色素A、毛蕊異黃酮葡萄糖苷、丹酚酸B定量的波長(zhǎng)，而在此波長(zhǎng)下黃芪甲苷吸光度太小，因此依據(jù)文獻(xiàn)［3］選擇203 nm作為其定量波長(zhǎng)。

4.2 洗脫系統(tǒng)的選擇 由于等度洗脫，各成分分離度小或不能分開(kāi)，所以選擇梯度洗脫。并對(duì)不同流動(dòng)相系統(tǒng)(甲醇-水、乙腈-水、乙腈－1.0%醋酸水溶液以及乙腈－0.6%磷酸水溶液)及其不同流動(dòng)相比例進(jìn)行了比較，結(jié)果以乙腈－0.6%磷酸水溶液系統(tǒng)為最佳，其圖譜上各個(gè)色譜峰的分離度較好，保留時(shí)間適中，因此選此流動(dòng)相系統(tǒng)作為腦心通膠囊HPLC指紋圖譜檢測(cè)的流動(dòng)相。

4.3 制樣方法 依據(jù)文獻(xiàn)［4］，比較了不同溶劑(甲醇、水)、不同提取方(超聲、即熱回流、浸漬)、不同濃度的甲醇(50%、60%、70%、80%、90%)等。結(jié)果表明:80%甲醇超聲30min提取，得峰面積較大、峰個(gè)數(shù)較多、分離度較好。

4.4 檢測(cè)成分的選擇 依據(jù)文獻(xiàn)［1］，黃芪是處方中含量最高的藥材，其主要活性成分為黃芪甲苷［5］、毛蕊異黃酮葡萄糖苷［6］等，同時(shí)該制劑對(duì)兩種成分分析報(bào)導(dǎo)較少。另外還檢測(cè)了含量較高的其他藥材中的兩個(gè)成分以達(dá)到制劑質(zhì)量控制的目的。

通過(guò)上述指紋圖譜及對(duì)照品比對(duì)初步分析，發(fā)現(xiàn)眾多有效成分且部分含量較高，所以臨床效果較好。同時(shí)通過(guò)該制劑HPLC指紋圖譜分析與10批次制劑中的4個(gè)物質(zhì)含量測(cè)定，結(jié)果含量均一。鑒于上述兩方法準(zhǔn)確、穩(wěn)定、操作簡(jiǎn)單易于實(shí)施，因此兩方法均可用于作為腦心通膠囊的質(zhì)量評(píng)價(jià)方法。

1 WS-10001(ZD-0001)-2002.中成藥標(biāo)準(zhǔn)匯編-腦系經(jīng)絡(luò)肢體分冊(cè).2002，225.

2 關(guān)于印發(fā)≤中藥注射劑指紋圖譜研究的技術(shù)要求(暫行)》的通知.中國(guó)藥品標(biāo)準(zhǔn)，2000，1:3-4.

3 閔慶璐，張世軒，陳曉明.HPLC－UV法測(cè)定丹黃祛瘀片中黃芪甲苷的含量.中華中醫(yī)藥學(xué)刊，2011，29:1678-1681.

4 李耿，孟繁蘊(yùn)，楊洪軍，等.UPLC法同時(shí)測(cè)定腦心通膠囊中5個(gè)成分的含量.藥物分析雜志，2013，33:414-418.

5 劉天一，何觀虹，姚麗.黃芪甲苷治療心血管疾病研究進(jìn)展.中醫(yī)藥信息，2013，30:117-121.

6 趙曉莉，潘鵬，周樂(lè)，等.毛蕊異黃酮葡萄糖苷大鼠在體腸吸收動(dòng)力學(xué)的研究.南京中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2012，28:552-554.