李建強(qiáng) 張宏蕊 杜海潮 石曉明

下肢深靜脈血栓(deep venous thrombosis，DVT)是目前常見的靜脈血管疾病，是一種歐美各國(guó)常見且嚴(yán)重的血管疾病［1，2］，近年來在我國(guó)也呈逐年上升的趨勢(shì)，尤其是手術(shù)后的患者，發(fā)病率從20% ～80%［2］。DVT導(dǎo)致的靜脈瓣膜功能不全及并發(fā)的肺栓塞、出血等并發(fā)癥是威脅患者生命安全的重要原因，并嚴(yán)重影響患者生活質(zhì)量。DVT病因很多，發(fā)病機(jī)制很復(fù)雜，是遺傳、環(huán)境等多因素共同作用的結(jié)果。有研究證實(shí)蛋白C、蛋白S缺陷、因子V突變等與下肢DVT形成有關(guān)［3－5］。內(nèi)皮細(xì)胞蛋白 C 受體(endothelial cell protein C receptor，EPCR)是蛋白C抗凝系統(tǒng)的主要成分之一，它可以將蛋白C聚集于內(nèi)皮細(xì)胞表面，促進(jìn)其活化，EPCR基因突變可以導(dǎo)致活化蛋白C(activated protein，APC)形成減少，凝血酶生成增多，靜脈血栓形成的風(fēng)險(xiǎn)增加［6，7］。本研究應(yīng)用PCR技術(shù)結(jié)合 DNA直接測(cè)序檢測(cè)了河北地區(qū)漢族人群EPCR基因A4600G位點(diǎn)多態(tài)性的分布情況，探討了該基因突變與下肢深靜脈血栓形成的內(nèi)在聯(lián)系。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2010年10月至2013年10月于河北省新樂市社會(huì)保險(xiǎn)職工醫(yī)院外科和河北省人民醫(yī)院普外二科就診的DVT患者200例作為病例組，其中男119例，女81例;年齡29～76歲，平均年齡(48±10)歲。對(duì)照組為同一時(shí)期在河北省新樂市社會(huì)保險(xiǎn)職工醫(yī)院和河北省人民醫(yī)院門診進(jìn)行健康體檢者，其中男251例，女149例;年齡29～71歲，平均年齡(46±12)歲。2組性別年齡匹配。所有入選對(duì)象均進(jìn)行血常規(guī)、生化、心電圖、彩超等檢查，除外心腦血管疾病、嚴(yán)重肝腎損傷、應(yīng)用抗血小板聚集等類型藥物者及有靜脈血栓形成、腦梗死、腦卒中、心臟病等病史及家族史。病例組患者除具備明顯臨床癥狀體征外，均經(jīng)彩色多普勒超聲、靜脈血流圖和靜脈造影等確診。所有入組者均為久居河北的漢族人，無血緣關(guān)系，且簽署知情同意書。

1.2 研究方法

1.2.1 生化指標(biāo)檢測(cè):所有體檢人群空腹抽取靜脈血10 ml，4 ml置于促凝管中，離心分離血清，測(cè)定血膽固醇(TC)、三酰甘油(TG)、高密度脂蛋白(HDL-c)、低密度脂蛋白(LDL-c);另取4 ml置于肝素抗凝管中，離心分離血清，測(cè)定纖維蛋白原(Fbg);剩余2 ml置于EDTA抗凝管中，－80℃低溫冰箱中保存，用于提取基因組DNA。TC、TG、HDL-C、LDL-C采用酶法測(cè)定，由日立7600全自動(dòng)生化分析儀測(cè)得。Fbg由Sysmex自動(dòng)血凝分析儀測(cè)得。

1.2.2 基因組DNA的提取:取0.2 ml EDTA抗凝血，應(yīng)用康為世紀(jì)血液基因組提取試劑盒，采用離心柱法提取各樣本基因組DNA。樣本DNA經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳及分光光度計(jì)檢測(cè)純度及濃度后用于PCR擴(kuò)增。

1.2.3 PCR擴(kuò)增目的基因:引物設(shè)計(jì)采用生物學(xué)軟件Primer5.0，并與GenBank進(jìn)行比對(duì)。EPCR基因第4外顯子引物序列:上游引物5’-taaacgggtccctttcctct-3’，下游引物5’ctcccctccctcaaatcttc3’，25 μl PCR 反應(yīng)體系，包括:4種 dNTP 各1.5 μmol/L，上下游引物各4 pmol，10 × buffer 2.5 μl，模板 DNA 0.1 μg，Taq DNA聚合酶0.5 U，加雙蒸水到終體積為25 μl。PCR 循環(huán)參數(shù):首先94℃預(yù)變性5 min，再以94℃變性1 min，58℃退火2 min和72℃延伸1.5 min程序循環(huán)30次。最后72℃延伸5 min。2%瓊脂糖電泳鑒定PCR產(chǎn)物。

1.3 核苷酸序列分析 將PCR特異性擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)一步純化，在Beckman Coulter GeXP遺傳分析系統(tǒng)直接測(cè)序。采用雙向測(cè)序。測(cè)定結(jié)果用DNAMAN軟件(V6.0.3.99漢化版)與GenBank公布的EPCR 基因第4外顯子序列進(jìn)行比對(duì)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 應(yīng)用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料以表示，不同組間臨床指標(biāo)比較采用單因素方差分析，基因頻率采用基因計(jì)數(shù)法計(jì)算;組間基因型與等位基因頻率比較采用χ2檢驗(yàn)，Logistic回歸分析EPCR基因A4600G多態(tài)位點(diǎn)與下肢深靜脈血栓形成的關(guān)系，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 2組一般情況及血脂水平比較 2組年齡差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);病例組TG、BMI明顯高于對(duì)照組(P＜0.05)，而 HDL-c低于對(duì)照組(P＜0.05)。見表1。

表1 2組一般情況及血脂水平比較±s

表1 2組一般情況及血脂水平比較±s

注:與對(duì)照組比較，*P ＜0.05

指標(biāo) 病例組(n=200) 對(duì)照組(n=400)年齡(歲)47.90 ±10.30 46.50 ±11.70 TC(mmol/L) 5.38 ±0.95 5.33 ±0.94 TG(mmol/L) 2.34 ±0.82* 1.88 ±0.76 HDL-c(mmol/L) 1.06 ±0.51* 1.35 ±0.57 LDL-c(mmol/L) 3.36 ±0.68 3.25 ±0.78 BMI(kg/m2) 27.96 ±3.77* 25.97 ±3.46 FBG(g/L)3.15 ±0.63 2.83 ±0.61

2.2 EPCR基因A4600G位點(diǎn)多態(tài)性基因型和等位基因頻率分布 病例組GG基因型、AG基因型頻率高于正常對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);且G等位基因的頻率顯著高于正常對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。見表2。

表2 EPCR基因A4600G位點(diǎn)多態(tài)性基因型和等位基因頻率分布例(%)

2.3 EPCR基因第4外顯子A4600G突變位點(diǎn)多態(tài)性直接測(cè)序結(jié)果 PCR產(chǎn)物純化后進(jìn)行雙向測(cè)序。測(cè)序結(jié)果發(fā)現(xiàn)EPCR基因第4外顯子A4600G突變位點(diǎn)存在等位基因A和G，基因型分為AA、AG、GG三種類型。見圖1。

圖1 EPCR基因第4外顯子A4600G突變位點(diǎn)多態(tài)性分析的測(cè)序結(jié)果

2.4 EPCR基因A4600G位點(diǎn)與下肢DVT的關(guān)系

以下肢DVT形成作為應(yīng)變量(無=0，有=1)，以BMI、TC、TG、HDL、LDL、EPCR 基因 A4600G 基因型(AA=0，AG=1，GG=2)為自變量，發(fā)現(xiàn) GG基因型與 DVT有關(guān)，能顯著的增加深靜脈血栓形成的風(fēng)險(xiǎn)，是下肢深靜脈血栓形成的獨(dú)立危險(xiǎn)因素(P＜0.05)。OR(95%CI)值為 2.705(1.208 ～ 5.387)(B=0.538，SE=0.384，Wald=6.752，P=0.002)。見表3。

表3 Logistic回歸分析結(jié)果

3 討論

DVT是一種非常嚴(yán)重，潛在風(fēng)險(xiǎn)很高的疾病，常常繼發(fā)于手術(shù)、創(chuàng)傷等原因，其發(fā)病率與年齡、患病時(shí)間成呈相關(guān)，年齡越大，患病時(shí)間越長(zhǎng)，發(fā)病率越高［8］。有關(guān)DVT發(fā)病原因、機(jī)制、影響因素及治療方法的研究已經(jīng)成為血管外科研究者研究的熱點(diǎn)。近年來DVT在國(guó)內(nèi)發(fā)病率也逐年增加，且并發(fā)癥的發(fā)生幾率及嚴(yán)重程度也是居高不下。但具體的原因不甚清楚，主要與遺傳及環(huán)境因素有關(guān)［9，10］。

本研究發(fā)現(xiàn)，病例組與對(duì)照組相比，TG、BMI均明顯升高，HDL-C明顯降低，TC、LDL-C、Fbg均無明顯差異，可見不良生活習(xí)慣并非DVT形成的主要原因，遺傳因素作用可能更為重要。本研究樣本量較大，且均為河北本地常住的漢族人口，可更好地代表本地區(qū)漢族人群基因多態(tài)性與DVT的關(guān)系。

EPCR基因位于第20號(hào)染色體長(zhǎng)臂(20q11.2)，全長(zhǎng)約6 kb，包含4個(gè)外顯子、3個(gè)內(nèi)含子以及5'和3'端的側(cè)翼區(qū)結(jié)構(gòu)，它是一種結(jié)合蛋白，可以使蛋白C與活化蛋白C與之特異性結(jié)合，從而提高活化蛋白C的活化效率，參與血液凝固的過程［11－13］。目前，研究發(fā)現(xiàn)EPCR基因的6936A/G、C3998T、C4678G已證實(shí)與血栓性疾病有關(guān)［6，14］。但有關(guān)A4600G位點(diǎn)與DVT的關(guān)系國(guó)內(nèi)尚未見報(bào)道。A4600G突變是EPCR基因第4外顯子上的錯(cuò)義突變，即第4600位堿基由A突變?yōu)镚，導(dǎo)致第219位的絲氨酸(Ser)被甘氨酸(Gly)替代，該位點(diǎn)突變影響了EPCR基因的生物學(xué)活性。本研究選取了性別年齡相匹配的病例組200例和正常對(duì)照組400例，直接檢測(cè)他們的基因組DNA，本結(jié)果顯示EPCR基因A4600G突變?cè)趯?duì)照組AA/AG/GG基因型分別占 81.50%、17.00%、1.50%，病例組 AA/AG/GG 基因型分別占64.00%，30.50%，5.50%，病例組AG、GG基因型均明顯高于正常對(duì)照組。同時(shí)病例組G等位基因的頻率是0.2075，而對(duì)照組的G等位基因的頻率是0.1，病例組明顯高于對(duì)照組。Karabyk等［14］的研究中GG基因型在病例組占2.7%，對(duì)照組中GG基因型占1.4%，對(duì)照組中的比例與我們的研究是一致的，但病例組中GG基因型的比例略低，而2組G等位基因的頻率17.6%，16%，相差不大，這與我們的結(jié)果存在明顯差異，究其原因，可能與種族、地域差異、選取對(duì)象及贗本量大小等有關(guān)。

Logistic回歸分析結(jié)果顯示G/G基因型是下肢深靜脈血栓形成的重要危險(xiǎn)因素，OR(95%CI)值為2.705(1.208 ～ 5.387)，進(jìn)一步驗(yàn)證了 EPCR 基因A4600G突變位點(diǎn)與CAS斑塊穩(wěn)定性的風(fēng)險(xiǎn)有關(guān)。

綜上所述，本研究證實(shí)EPCR基因A4600G突變與DVT的發(fā)生發(fā)展有密切的關(guān)系，更是決定其并發(fā)癥發(fā)生發(fā)展的重要因素，但其中具體的作用機(jī)制還有待于進(jìn)一步研究。

1 Vedantham S.Treating infrainguinal deep venous thrombosis.Tech Vasc Interv Radiol，2014，17:103-108.

2 Runkle M，Parikh PP，F(xiàn)alls G.Management of upper extremity deep venous thrombosis in a hospice patient.J Palliat Med，2014，17:342-345.

3 Marlar RA，Gausman JN.Laboratory testing issues for protein C，protein S，and antithrombin.Int J Lab Hematol，2014，36:289-295.

4 Kamei M，Matsumura N，Suzuki M，et al.Reperfusion of large ischemic areas associated with central retinal vein occlusion:a potential novel treatment with activated protein C.JAMA Ophthalmol，2014，132:361-362.

5 Karmacharya P，Aryal MR，Donato A.Mesenteric vein thrombosis in a patient heterozygous for factor V Leiden and G20210A prothrombin genotypes.World J Gastroenterol，2013，19:7813-7815.

6 Chen XD，Tian L，Li M，et al.Relationship between endothelial cell protein C receptor gene 6936A/G polymorphisms and deep venous thrombosis.Chin Med J(Engl)，2011，124:72-75.

7 Medina P，Navarro S，Bonet E，et al.Functional analysis of two haplotypes of the human endothelial protein C receptor gene.Arterioscler Thromb Vasc Biol，2014，34:684-690.

8 Iverson RE，Gomez JL.Deep venous thrombosis:prevention and management.Clin Plast Surg，2013，40:389-398.

9 仇鵬，朱化剛，謝文濤，等.急性深靜脈血栓形成發(fā)病的季節(jié)規(guī)律性研究.中華普通外科雜志2014，29:261-264.

10 賀穎，封青川，楊冬之，等.河南漢族深靜脈血栓形成患者凝血因子Ⅶ基因多態(tài)性檢測(cè).鄭州大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版)，2011，46:59-63.

11 Lagrange J，Li Z，F(xiàn)assot C，et al.Endothelial mineralocorticoid receptor activation enhances endothelial protein C receptor and decreases vascular thrombosis in mice.FASEB J，2014，28:2062-2072.

12 Medina P，Navarro S，Bonet E，et al.Functional analysis of two haplotypes of the human endothelial protein C receptor gene.Arterioscler Thromb Vasc Biol，2014，34:684-690.

13 Guitton C，Gérard N，Quillard T，et al.Circulating endothelial cell protein C receptor:endothelial regulation and cumulative impact of gender and A3 haplotype.J Vasc Res，2011，48:336-346.

14 Karabyk A，Ylmaz E，Ein Y，et al.The Effects of Endothelial Protein C Receptor Gene Polymorphisms on the Plasma sEPCR Level in Venous Thrombosis Patients.Turk J Haematol，2012，29:55-62.