趙曉宇，王佳龍，孟利強，張淑梅，沙長青

解淀粉芽孢桿菌發(fā)酵技術(shù)在生物防治領(lǐng)域的研究進展

趙曉宇1，2，王佳龍1，孟利強1，2，張淑梅1，2，沙長青3

（1.黑龍江省科學(xué)院微生物研究所，哈爾濱150010；2.黑龍江省科學(xué)院高技術(shù)研究院，哈爾濱150020；3.黑龍江省科學(xué)院，哈爾濱150001）

通過介紹國內(nèi)生物防治領(lǐng)域中解淀粉芽孢桿菌的液體發(fā)酵基本情況，總結(jié)了目前發(fā)酵中多添加可溶性淀粉、葡萄糖、蔗糖、胰蛋白胨、花生餅粉、尿素、豆粕、牛肉膏、酵母膏作為碳氮源的使用可獲得良好發(fā)酵結(jié)果。在發(fā)酵液中添加磷酸鹽作為緩沖溶液，并加入適當(dāng)?shù)腗n2+和Ca2+有助于芽孢形成，對發(fā)酵中pH值水平、溶氧水平等工藝進行了綜述，為后續(xù)的科研工作做了必要總結(jié)。根據(jù)目前國內(nèi)研究情況，提出應(yīng)努力應(yīng)用更多先進的統(tǒng)計學(xué)分析手段，指導(dǎo)發(fā)酵技術(shù)。應(yīng)進一步探討通過實時調(diào)控發(fā)酵條件來控制發(fā)酵結(jié)果，應(yīng)用連續(xù)發(fā)酵等技術(shù)，進一步發(fā)展解淀粉芽孢桿菌的液體發(fā)酵技術(shù)。

解淀粉芽孢桿菌；生物防治；液體發(fā)酵

微生物發(fā)酵是利用微生物在適宜的條件下，將特定培養(yǎng)基經(jīng)過一定的代謝途徑轉(zhuǎn)化為人類所需要的產(chǎn)物的過程。微生物發(fā)酵生產(chǎn)水平不僅取決于菌種本身的遺傳特性，還需要供給合適的培養(yǎng)基和發(fā)酵條件。優(yōu)化發(fā)酵工藝可以充分發(fā)揮菌種的潛在生產(chǎn)能力，提高生產(chǎn)效率，降低生產(chǎn)成本［1］。

自1955年我國開始報道生物防治以來，篩選獲得了大量的微生物菌株，對多種作物的病害具有較強抑制作用。解淀粉芽孢桿菌為芽孢桿菌屬，是一種與枯草芽孢桿菌親緣性很高的細菌，其在生長過程中可以產(chǎn)生一系列能夠抑制真菌和細菌活性的代謝物，對植物病原菌具有強烈抑制作用［2］。該菌在自然界分布廣泛，易分離培養(yǎng)，對人畜無毒無害，不污染環(huán)境；其代謝產(chǎn)物較為豐富，具有廣譜抗菌活性和較強的抗逆能力，生長快，穩(wěn)定性較好［3］。以往對于解淀粉芽胞桿菌的應(yīng)用主要作為工業(yè)產(chǎn)酶菌株，近些年關(guān)于解淀粉芽胞桿菌的研究不斷擴大，在生物防治、果蔬保鮮、促生方面都出現(xiàn)了報道，具有廣闊的應(yīng)用前景。

1　培養(yǎng)基對生防菌發(fā)酵的影響

培養(yǎng)基是微生物細胞生長繁殖提供所需環(huán)境，發(fā)酵培養(yǎng)基主要用來滿足微生物生長繁殖、代謝產(chǎn)物合成過程中的的營養(yǎng)物質(zhì)及能量需求，并為細胞提供適宜的生存環(huán)境［4］。在微生物產(chǎn)品發(fā)酵的科研和生產(chǎn)工作中，由于菌種不同、生長階段不同及發(fā)酵工藝條件的差異，所使用的培養(yǎng)基也不盡相同。普遍均含有含碳物質(zhì)、含氮物質(zhì)、無機鹽以及維生素和水等。不同的微生物對營養(yǎng)的需求有所差異。因此，培養(yǎng)基的成分和含量對微生物的生長繁殖、代謝產(chǎn)物的生成及產(chǎn)品的分離純化都具有重要的影響，其中碳源和氮源是最重要的影響因素。

凡能提供微生物營養(yǎng)所需的碳元素和氮元素的營養(yǎng)源，被稱為碳源和氮源［5］。微生物可利用的碳源非常廣泛，主要分為有機碳和無機碳兩類，利用有機碳的微生物多數(shù)為異養(yǎng)微生物，目前所篩選獲得微生物多數(shù)為異養(yǎng)微生物，因此，多選擇有機碳為主的碳源作為培養(yǎng)基重要組成。在有機碳方面糖類是最為廣泛的碳源，包括單糖、多糖和各種淀粉以及糖蜜等，而在工業(yè)生產(chǎn)上也選擇麩皮、米糠、纖維素等作為碳源。應(yīng)用在微生物發(fā)酵粉中的氮源的種類也非常廣泛，實驗室和生產(chǎn)上常用做氮源的材料有（NH4）2SO4、NH4NO3、尿素、牛肉膏、蛋白胨、酵母膏及蛋白質(zhì)含量較高的黃豆粉、魚粉、花生餅粉、豆粕等。

劉京蘭［6］將篩選獲得的內(nèi)生解淀粉芽孢桿菌CC09可溶性淀粉（碳源）5g/L、比例為3∶1的胰蛋白胨酵母粉混合氮源15g/L，在此條件下，Iturin A的產(chǎn)量可達到690mg/L，較優(yōu)化前的提高了4倍。魏嬌洋［7］篩選獲得的可防治棉花黃萎病菌的內(nèi)生解淀粉芽孢桿菌X-278，進行發(fā)酵優(yōu)化后，在葡萄糖1.5%、花生餅粉2%的條件下活菌數(shù)量達到1.5×1010CFU/mL，對棉花黃萎病菌的抑菌圈直徑為33.4mm。梁昌聰［8］將解淀粉芽孢桿菌C101培養(yǎng)基進行優(yōu)化，結(jié)果表明，在選擇蔗糖20 g/L、尿素4.0 g/L、豆粕4.0 g/L的條件下，芽孢含量提高了188%。張靜［9］等研究的解淀粉芽孢桿菌及其分泌物對山茶灰斑病病原菌具有較好的拮抗作用，其菌株發(fā)酵最佳碳、氮源分別為葡萄糖和蛋白胨。洪鵬［10］探討了解淀粉芽孢桿菌HF-01菌株液體發(fā)酵條件，最佳碳氮源為葡萄糖3.0%、酵母提取粉0.5%。馬桂珍［11］研究的解淀粉芽孢桿菌GM-1菌株，碳氮源選擇為蔗糖10g/L，牛肉膏16g/L，酵母膏3g/L。張淑梅［12］對內(nèi)生解淀粉芽孢桿菌TF28液體發(fā)酵培養(yǎng)基碳氮源進行篩選，確定菌株TF28最佳培養(yǎng)基配方為:葡萄糖1%，牛肉膏0.5%，酵母膏0.3%。章小洪［13］等研究發(fā)現(xiàn)，玉米粉對解淀粉芽孢桿菌BW-13產(chǎn)生抗真菌活性物質(zhì)的促進效果非常明顯，最佳培養(yǎng)基配方需要含有玉米粉32 g/L，蛋白胨9 g/L。

各類重要元素是生命活動必須的營養(yǎng)物質(zhì)，無機鹽可為微生物提供除去氮碳源以外的各種重要元素。例如，P、K、Na、Mg、Mn、Ca、S、Fe、Zn等。不同的微生物菌株對各類鹽累元素需求各不相同。各類元素在發(fā)酵液培養(yǎng)基中所扮演的角色也不盡相同。P、S、Ca、Mg、Fe等協(xié)助細胞內(nèi)一般分子的合成。Na等維持調(diào)節(jié)細胞內(nèi)外的滲透壓。Mg、Cu、Zn則是生物活性酶的激活劑。S、Fe、NH4、NO2等離子為微生物提供能量，NO3和SO4等離子是生命活動氫受體，Co、Mo則是特殊分子的組成部分。

解淀粉芽孢桿菌X-278的發(fā)酵所需元素為硫酸銨0.5%、碳酸鈣0.1%、硫酸鎂0.5%、氯化鈉0.5%［7］。梁昌聰［8］研究結(jié)果顯示，在培養(yǎng)基中添加2.0g/L的KNO3，2.4g/L的Na2HPO4，0.52g/L的KH2PO4，0.55g/L的（NH4）2SO4，1.0g/L的 NaCl，0.50g/L的 MgSO4· 7H2O，0.005g/L的FeSO4，0.0054 g/L的MnSO4，解淀粉芽孢桿菌C101最大理論芽孢含量為14.67×108個/mL。解淀粉芽孢桿菌HF-01菌株最適發(fā)酵培養(yǎng)基中添加氯化鈉0.3%、硫酸鎂0.1%［10］。馬桂珍［11］研究的解淀粉芽孢桿菌GM-1菌株，在培養(yǎng)基中添加了0.4g/L的FeSO4。張淑梅［12］等在發(fā)酵內(nèi)生解淀粉芽孢桿菌TF28培養(yǎng)基中添加硫酸錳0.01%和碳酸鈣0.5%。章小洪［13］的研究是在培養(yǎng)基中添加Mn2+對解淀粉芽孢桿菌BW-13產(chǎn)生抗真菌活性物質(zhì)的促進效果非常明顯，添加量控制在5 mg/L。洪鵬則是在培養(yǎng)基中添加了一定量的Mg2+離子。

2　培養(yǎng)條件對解淀粉芽孢桿菌的影響

對于微生物來說，其可生長的pH值范圍非常廣泛，多數(shù)菌株在pH5～9可以正常生長，但在菌株生命活動過程中需要在最適pH值條件下，控制發(fā)酵過程。不同的發(fā)酵pH值菌株所代謝的產(chǎn)物有所不同，需要根據(jù)發(fā)酵目標(biāo)確定最適發(fā)酵pH值。而且在發(fā)酵過程中，pH值會隨著發(fā)酵時間的延長而改變，因此要在發(fā)酵過程中流加酸堿物質(zhì)，調(diào)控pH值走向。

溫度是影響發(fā)酵結(jié)果的最重要的因素，因為生命活動是一系列生物化學(xué)反應(yīng)組成的，這些反應(yīng)受溫度的影響極為嚴(yán)重，因此必須在適合微生物生長的最佳條件下，才可獲得最適的發(fā)酵結(jié)果。最適發(fā)酵溫度意義是菌株分裂代時最短或生長速度最快時的培養(yǎng)溫度。但最適發(fā)酵溫度不完全等同于發(fā)酵速度最高的溫度，也不等同于某一代謝產(chǎn)物累積最高時的培養(yǎng)溫度，因此需要根據(jù)發(fā)酵目標(biāo)去篩選獲得適合本菌株的最佳溫度。

氧氣在微生物生長中扮演重要角色，因為解淀粉芽孢桿菌均為好氧菌，因此氧氣是本菌株的必備發(fā)酵條件之一。在氧氣的存在下，氧分子參與整個呼吸鏈作用，并做氫的最終受體，在超氧化物歧化酶和過氧化氫酶作用下完成生命活動。在發(fā)酵過程中在溶氧電極的檢測下，可以獲得培養(yǎng)體系內(nèi)溶氧數(shù)值，而在一般的發(fā)酵條件下則是通過調(diào)整攪拌頻率來控制溶氧。

以上3種因素是影響發(fā)酵條件的主要因素，但在發(fā)酵過程中，種齡、發(fā)酵時間、接種量也對發(fā)酵的過程和結(jié)果有一定的影響，因此在研究發(fā)酵過程中也不能忽視。

張靜［9］等確定其防治山茶灰斑病的解淀粉芽孢桿菌，最佳優(yōu)化條件為25℃、pH值6.0、每125 mL接種2 mL孢子懸液于300 mL錐形瓶中震蕩培養(yǎng)，作用時間72h后，抑菌值達0.85。解淀粉芽孢桿菌HF 01菌株最佳發(fā)酵培養(yǎng)條件為初始pH值6.0～6.5、培養(yǎng)溫度28℃、培養(yǎng)時間48 h、250 mL三角瓶裝液量90 mL、接種量體積分數(shù)6%、搖床轉(zhuǎn)速130 rpm。在最佳發(fā)酵培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件下，菌株HF-01抑菌能力提高37.3%。洪鵬［10］等對解淀粉芽孢桿菌HF-01的發(fā)酵條件進行了優(yōu)化，在初始pH 6.0～6.5，培養(yǎng)溫度28℃，培養(yǎng)時間48 h，接種量6%，搖床轉(zhuǎn)速130 rpm的條件下，菌株HF-01的抑菌能力可提高37.3%。解淀粉芽孢桿菌GM-1最佳發(fā)酵條件為:28℃，pH7.0，200rpm，搖床培養(yǎng)60h，種子液濃度在108cfu/mL水平，接種量為10%［11］。 張淑梅［12］確定菌株 TF28最佳發(fā)酵條件為:初始pH 7.5，培養(yǎng)溫度30℃，發(fā)酵周期48 h，接種量2%，轉(zhuǎn)數(shù)200 rpm。解淀粉芽孢桿菌BW-13最佳發(fā)酵條件為：初始發(fā)酵pH 5.0，接種量為4%，培養(yǎng)溫度28℃，搖床轉(zhuǎn)速200 rpm，培養(yǎng)時間144 h，比優(yōu)化前提高28.94%［13］。

3　展望

確定適合研究目標(biāo)的培養(yǎng)基組成和發(fā)酵條件是研究的重點，而如何應(yīng)用現(xiàn)代的統(tǒng)計學(xué)、數(shù)學(xué)的方法去完成我們的實驗?zāi)繕?biāo)、安排我們的實驗、處理實驗結(jié)果，會使我們的研究變得更為簡而易行。目前基于現(xiàn)代統(tǒng)計學(xué)相關(guān)技術(shù)方法，得到廣泛應(yīng)用包括正交試驗設(shè)計、均勻設(shè)計和基于計算機模擬技術(shù)的響應(yīng)面法在發(fā)酵技術(shù)領(lǐng)域高速發(fā)展，越來越多的科研工作者應(yīng)用統(tǒng)計軟件對試驗結(jié)果進行數(shù)學(xué)回歸模擬達到優(yōu)化目的。

根據(jù)目前的研究結(jié)果，在實驗中調(diào)整各種參數(shù)來調(diào)控發(fā)酵的技術(shù)還未見報道，我們可以針對我們想要獲得的某一指標(biāo)調(diào)整某一發(fā)酵過程參數(shù)，來控制發(fā)酵結(jié)果，例如，在發(fā)酵過程中，升高或降低溫度調(diào)整微生物生長速度，控制發(fā)酵過程中pH值的改變來中和發(fā)酵過程中產(chǎn)生的乳酸，我們經(jīng)過試驗已經(jīng)證明可以對芽孢的形成速度有所影響，在發(fā)酵過程中控制溶氧的比例也會對發(fā)酵過程工藝有所調(diào)控。另外，在發(fā)酵過程中進行連續(xù)補料可能也會對最終產(chǎn)物的累積形成具有一定的意義。但這些在國內(nèi)的文件中還未見報道，需要我們科技工作者不斷的深入研究，為生物防治領(lǐng)域帶來新的曙光。

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Research progress of fermentation technology of Bacillus amyloliquefaciens in the field of biological control

ZHAOXiao-yu1，2，WANGJia-long1，MENGLi-qiang1，2，ZHANGShu-mei1，2，SHAChang-qing3
（1.Institute ofMicrobiology，HeilongjiangAcademyofSciences，Harbin 150010，China；2.Institute ofAdvanced Technology，HeilongjiangAcademyofSciences，Harbin 150020，China；3.HeilongjiangAcademyofSciences，Harbin 150001，China）

By introducing liquid starch Bacillus fermentation solution in the field of domestic biocontrol basic situation，this paper reviews the soluble starch，glucose，sucrose，tryptone，peanut meal，urea，soybean meal，beef extract，yeast extract as the use of carbon and nitrogen sources and get a good result of fermentation in the current fermentation.Add broth as phosphate buffer solution，and add the appropriate Mn2+and Ca2+to help sporulation. The pH level，dissolved oxygen levels and other processes in fermentation were reviewed，serving as the necessary follow-up research.According to the current situation of domestic research，efforts should be made on more sophisticated statistical analysis application tools，guidance fermentation technology.Further exploration should be done through real-time regulation of fermentation conditions to control the fermentation results，apply continuous fermentation technology，advances in the development of the liquid fermentation technology of Bacillus amyloliquefaciens.

Bacillus amyloliquefaciens；Biocontrol；Fermentation

S476

A

1674-8646（2015）04-0018-03

2015-03-02

黑龍江省科技攻關(guān)項目（GZ13B017）；黑龍江省院所基本應(yīng)用技術(shù)研究專項（CZ14BZXY14）；黑龍江省科學(xué)院學(xué)部委員項目（XB13CZXY14）

趙曉宇（1979-），男，黑龍江肇源人，副研究員，學(xué)士，主要從事生物防治、基因工程研究。

沙長青（1965-），男，黑龍江哈爾濱人，研究員，碩士，主要從事農(nóng)業(yè)微生物領(lǐng)域研究。