孫 愷 謝 楠 陶慶霞 王 翀

（1濰坊醫(yī)學(xué)院2013級(jí)研究生，山東 濰坊261053；2徐州市中心醫(yī)院，江蘇 徐州221000；3濟(jì)寧醫(yī)學(xué)院附屬濟(jì)寧市第一人民醫(yī)院，山東 濟(jì)寧272011）

缺血性腦卒中（ischemic stroke，IS）已經(jīng)成為世界范圍內(nèi)主要的公共健康問題，也是引發(fā)較高致殘率及致死率的首要原因［1］。腦缺血后通過快速恢復(fù)缺血組織血液灌注的方式在可以挽救瀕臨死亡的腦細(xì)胞的同時(shí)，也會(huì)產(chǎn)生腦缺血－再灌注損傷。大量研究表明，炎癥反應(yīng)在腦缺血－再灌注損傷發(fā)病機(jī)制中扮演極為重要的角色［2］。作為炎癥反應(yīng)的關(guān)鍵調(diào)控因子，高遷移率族蛋白B1（high mobility group protein box 1，HMGB1）通過與其受體結(jié)合參與炎癥反應(yīng)［3］。因此，通過以HMGB1為靶點(diǎn)治療腦缺血－再灌注損傷已經(jīng)成為人們研究的熱點(diǎn)。本文通過建立小鼠局灶性缺血－再灌注模型，觀察使用抗 HMGB1單抗（anti－HMGB1 monoclonal antibody，mAb）前后小鼠神經(jīng)行為學(xué)、病理形態(tài)及腦水腫程度的改變，并對(duì)比腦組織內(nèi)IL－1β和IL－6mRNA表達(dá)的差異，進(jìn)而探討使用mAb治療腦缺血－再灌注損傷的可能機(jī)制。

1 材料與方法

1．1 主要試劑及儀器

栓線購自北京西濃科技有限公司；HMGB1單克隆抗體購自Abcam公司；抗HMGB1單克隆抗體由美國范斯坦醫(yī)學(xué)研究所提供；小鼠單抗對(duì)照IgG抗體購自北京百奧萊博科技有限公司；HMGB1ELISA試劑盒購自美國R＆D System Inc；Trizol試劑盒和 RT－PCR kit（二步法）購自加拿大invitrogen公司，使用Primers 3軟件設(shè)計(jì)IL－1β和IL－6PCR引物。

1．2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組

8～12周C57BL／6J小鼠48只，體重16～20g，由北京軍區(qū)總醫(yī)院附屬八一腦科醫(yī)院實(shí)驗(yàn)室提供。隨機(jī)分為假手術(shù)組（sham組），腦缺血－再灌注組（I／R組），抗 HMGB1單克隆抗體組（mAb組）和單抗對(duì)照組（control IgG組）4組，每組12只，分別用于腦水腫評(píng)估、腦部HE染色、腦組織IL－Iβ和IL－6mRNA 表達(dá)的檢測，sham 組和I／R組測定血清HMGB1的水平。

1．3 腦缺血－再灌注模型制備

大腦中動(dòng)脈閉塞（middle cerebral artery occlusion，MCAO）模型參考Zea Longa法經(jīng)適當(dāng)改良后制備。小鼠稱重后腹腔注射3．6%水合氯醛（350mg／kg），顯微鏡下分離右側(cè)頸總動(dòng)脈（CCA），頸外動(dòng)脈（ECA）和頸內(nèi)動(dòng)脈（ICA），充分游離ECA并于其在殘端剪一小口，將栓線向內(nèi)上方插入ICA顱內(nèi)段，當(dāng)遇到輕微阻力時(shí)停止，結(jié)扎ECA根部絲線。確認(rèn)無出血后，消毒并縫合皮膚，2h后取出栓線。假手術(shù)組不插入線栓，余步驟同I／R組。

1．4 血清HMGB1水平測定

再灌注24h后采用心臟穿刺獲取小鼠血樣，按照ELISA試劑盒說明檢測各組血清樣本中HMGB1含量。每個(gè)樣本重復(fù)3個(gè)復(fù)孔，將HMGB1單抗包被于酶標(biāo)板上，加入生物素化的抗HMGB1抗體和辣根過氧化物酶標(biāo)記的親和素，3者形成免疫復(fù)合物，洗去游離成分，加顯色底物及終止液，以酶標(biāo)儀450nm測定吸光度，通過繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線求出樣品中HMGB1濃度。

1．5 腦組織含水量測定

再灌注后24h處死小鼠，沿腦橋上界水平面切斷并分離左右半球，放于分析天平上稱取腦半球組織濕重后，立即放入100℃烤箱烘烤48h得到干重。腦半球含水量的百分比通過公式計(jì)算：腦半球含水量百分比＝（濕重－干重）／濕重×100% 。

1．6 HE染色觀察各組小鼠腦組織病理變化

4組各取3只小鼠，4%多聚甲醛心臟灌注后斷頭取腦，4μm連續(xù)切片，常規(guī)HE染色，光學(xué)顯微鏡下觀察腦組織切片上HE染色所示的細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化。

1．7 實(shí) 時(shí) 熒 光 定 量 PCR 測 定IL－1β 和IL－6mRNA的表達(dá)

采用Trizol兩步法提取總RNA，采用Primer3引物設(shè)計(jì)軟件設(shè)計(jì)引物，引物分別為：IL－1β（L5＇－GTGGAACTTGAGGCCACATT－3＇；R5＇－T G T GA CA AA AA TG CC TG GA A），IL－6 （L5＇－C CG GA GA GG AG AC TT CA CAG－3＇；R5＇－T CC AC GA TT TC CC AG AG AA C－3＇），HPRT （L5＇－C AA GC TT GC TG GT GA AA AG GA－3＇；R5＇－T GA AG TA CT CA TT AT AG TC AA GG GC AT ATC－3＇）。PCR擴(kuò)增條件：95℃預(yù)變性10min，95℃15s，60℃60s，72℃延伸1min，重復(fù)共40個(gè)循環(huán)，得到IL－1β、IL－6和內(nèi)參 HPRT的Ct值，以HPRT內(nèi)參照作為內(nèi)標(biāo)，算出IL－1β、IL－6的相對(duì)表達(dá)量，以2－△△Ct為指標(biāo)。

1．8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS17．0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果

2．1 血清HMGB1的水平

I／R組、sham組小鼠 HMGB1濃度分別為（5．353±1．489）ng／ml、（47．75±3．667）ng／ml，I／R組明顯高于sham組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t值為10．71，P＜0．001）。見圖1。

圖1 腦缺血－再灌注組和假手術(shù)組小鼠血清HMGB1的水平

2．2 各組小鼠腦組織含水量的測定

干濕重法測得各組小鼠腦組織含水量的比較。I／R組、sham組、mAb組和control IgG組腦組織含 水 量 分 別 為 （78．34±2．836）%、（65．09±1．934）%、（67．47±1．775）% 和 （79．01±2．804）%，I／R組顯著高于sham組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t值為3．86，P＜0．05），control IgG組顯著高于mAb組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t值為3．477，P＜0．05），I／R組顯著高于 mAb組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t值為3．249，P＜0．05）。見圖2。

圖2 各組小鼠腦組織含水量變化（%）

2．3 各組小鼠腦組織HE染色比較

sham組腦組織HE染色可見細(xì)胞及血管形態(tài)正常，結(jié)構(gòu)完整，細(xì)胞間質(zhì)均勻。I／R組腦組織神經(jīng)元細(xì)胞數(shù)量明顯減少，細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)不清，間質(zhì)水腫明顯，部分細(xì)胞出現(xiàn)壞死。IgG組與I／R組相比無明顯變化，而mAb組腦組織較I／R組明顯減輕，壞死細(xì)胞數(shù)量減少，可見部分細(xì)胞完整，細(xì)胞間質(zhì)水腫程度減輕。

2．4 各組小鼠腦組織IL－1β和IL－6mRNA 的表達(dá)

利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)測得各組小鼠IL－1β 和 IL－6mRNA 的 表 達(dá) 變 化。I／R 組 IL－1βmRNA的表達(dá)量 （0．783±0．028）明顯高于sham組 （0．126±0．009），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t值為22．08，P＜0．0001）；mAb組 （0．417±0．047）與IgG組 （0．834±0．059）相比，前者表達(dá)量明顯高于后者，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t值為5．5，P＜0．01）；I／R 組 IL－1βmRNA 表 達(dá) 量 （0．783±0．028）顯著高于 mAb組 （0．417±0．047），差異同樣有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t值為6．681，P＜0．01）。在IL－6mRNA 表達(dá)方面，I／R 組 （0．650±0．052）顯著高于sham組 （0．059±0．009），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t值為11．6，P＜0．001）；而IgG組 （0．655±0．031）和 mAb組 （0．655±0．052）相比，mAb組（0．655±0．052）與I／R組 （0．650±0．052）相比，兩組對(duì)比均無明顯差異（t值分別為0．004和0．089，p值均＞0．05）。見圖3。

圖3 各組小鼠IL－1β、IL－6mRNA 的表達(dá)變化

3 討論

腦缺血－再灌注損傷通過一系列復(fù)雜的病理生理機(jī)制導(dǎo)致神經(jīng)元細(xì)胞死亡以及神經(jīng)功能障礙等腦損傷表現(xiàn)［4］。其中，炎癥反應(yīng)是參與上述復(fù)雜機(jī)制中較為重要的因素。腦缺血－再灌注時(shí)，在缺血灶局部存在大量炎癥因子，并且炎癥細(xì)胞的激活、浸潤及黏附分子的合成分泌呈一種相互增強(qiáng)相互促進(jìn)的級(jí)聯(lián)反應(yīng)，并通過一定的炎癥信號(hào)通路使腦組織由缺血性損傷轉(zhuǎn)向炎癥性損傷［5］。

最初被發(fā)現(xiàn)是作為核蛋白與染色體結(jié)合參與維持核小體結(jié)構(gòu)穩(wěn)定以及調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄等功能［6］。人們隨后發(fā)現(xiàn)壞死的細(xì)胞可被動(dòng)釋放HMGB1至胞外［7］；同時(shí)，激活后的巨噬細(xì)胞和膠質(zhì)細(xì)胞等可主動(dòng)分泌HMGB1［8］。釋放至胞外的HMGB1具有促進(jìn)炎癥因子樣的活性，通過與細(xì)胞膜表面受體如晚期糖基化終末產(chǎn)物受體（receptor for advanced glycation end products，RAGE）和 Toll樣受體（toll like receptors，TLRs）結(jié)合，介導(dǎo)級(jí)聯(lián)式的炎癥反應(yīng)［7］。在腦缺血－再灌注損傷病理機(jī)制中，HMGB1同樣發(fā)揮著重要的作用。研究發(fā)現(xiàn)，小鼠MCAO模型及缺血性腦卒中患者腦組織中發(fā)現(xiàn)HMGB1由細(xì)胞核轉(zhuǎn)移至細(xì)胞質(zhì)，隨后大量存在于腦脊液中［9］。本文結(jié)果顯示，通過與假手術(shù)組對(duì)比，腦缺血－再灌注組小鼠血清內(nèi)HMGB1的含量明顯高于前者。胞外聚集的較高濃度的HMGB1通過募集單核／巨噬細(xì)胞并進(jìn)一步激活星形細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞，從而促進(jìn)炎癥因子如IL－1β，IL－6，TNF－α等釋放。本文通過對(duì)比腦缺血－再灌注組與假手術(shù)組小鼠腦組織IL－1β和IL－6mRNA的表達(dá)量，發(fā)現(xiàn)前者明顯高于后者。說明HMGB1在參與腦缺血－再灌注損傷機(jī)制的同時(shí)，通過一系列復(fù)雜的級(jí)聯(lián)式反應(yīng)促進(jìn)炎癥因子的釋放，從而進(jìn)一步加重腦損傷。

目前，以HMGB1為治療靶點(diǎn)的研究已經(jīng)成為熱點(diǎn)。通過采用與RAGE結(jié)合的HMGB1競爭性拮抗劑（如重組的HMGB1Box A功能域和由S100P衍生的RAGE），使用天然／合成的小分子HMGB1特異性抑制劑（如甘草酸和甲磺酸加貝酯），以及利用生物來源物質(zhì)如HMGB1的特異性抗體、多肽、蛋白質(zhì)或彎曲的DNA based雙鏈等方式在抑制由HMGB1介導(dǎo)的相關(guān)疾病中發(fā)揮了重要作用［10］。此外，Liu等［11］發(fā)現(xiàn)，注射抗 HMGB1中和mAb可顯著減輕腦梗死程度，表現(xiàn)為腦梗死體積減小90%，神經(jīng)功能缺損評(píng)分明顯提高，并減輕了血腦屏障的破壞。本文通過尾靜脈注射mAb發(fā)現(xiàn)，腦水腫的程度顯著減輕，由缺血－再灌注損傷引起的病理性破壞也得到一定程度的改善。作為神經(jīng)毒性介質(zhì)，IL－1β在腦缺血30min后即開始表達(dá)，并直接引發(fā)神經(jīng)元細(xì)胞的凋亡并促進(jìn)小膠質(zhì)細(xì)胞和星形細(xì)胞過度表達(dá)炎癥化學(xué)因子［12］。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，注射mAb后，IL－1βmRNA的表達(dá)量明顯下降，提示抗HMGB1單抗的保護(hù)性作用。

然而，在本實(shí)驗(yàn)中，使用抗HMGB1單抗后，小鼠腦組織內(nèi)IL－6mRNA的表達(dá)量并沒有發(fā)生明顯改變。我們推測，導(dǎo)致該結(jié)果出現(xiàn)的原因可能是由于IL－6在腦缺血－再灌注損傷過程中發(fā)揮雙重作用有關(guān)。Huang等［13］研究發(fā)現(xiàn)，腦缺血－再灌注24h內(nèi)，IL－6水平明顯升高，可使基質(zhì)金屬蛋白酶－1（MMP－1）表達(dá)增高，促進(jìn)細(xì)胞間黏附分子（ICAM）－1的表達(dá)，而導(dǎo)致腦組織損傷。然而，有研究顯示，由腦細(xì)胞產(chǎn)生的IL－6通過激活STAT3信號(hào)通路發(fā)揮促血管生成及保護(hù)神經(jīng)元細(xì)胞等功能［14－15］。本實(shí) 驗(yàn) 中，注 射 mAb后，IL－6 表 達(dá) 量 未發(fā)生明顯變化，推測可能是其產(chǎn)生與mAb協(xié)同的保護(hù)性作用。

本文通過靜脈注射抗HMGB1單克隆抗體觀察及測定小鼠腦缺血－再灌注損傷后腦水腫程度，腦組織破壞程度以及腦組織內(nèi)IL－1和IL－6mRNA的表達(dá)量的變化，表明HMGB1介導(dǎo)腦缺血－再灌注損傷機(jī)制中炎癥反應(yīng)過程，注射抗HMGB1單抗可有效保護(hù)受損腦組織。

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