王業(yè)全

（濟寧醫(yī)學(xué)院法醫(yī)學(xué)與醫(yī)學(xué)檢驗學(xué)院，山東 濟寧272067）

膝關(guān)節(jié)在人體結(jié)構(gòu)中起著重要的樞紐作用，是人體最大、結(jié)構(gòu)最復(fù)雜的關(guān)節(jié)。膝關(guān)節(jié)韌帶是穩(wěn)定膝關(guān)節(jié)的重要結(jié)構(gòu)，也是病變多發(fā)的部位。關(guān)節(jié)腔內(nèi)的前交叉韌帶、后交叉韌帶（posterior cruciate ligament，PCL）等組織的修復(fù)能力很差，而這些組織又不同程度的容易受到機械損傷。當(dāng)前面臨的挑戰(zhàn)就是撕裂損傷的膝關(guān)節(jié)韌帶組織已經(jīng)沒有能力再修復(fù)或再生成具有原始功能性的韌帶。膝關(guān)節(jié)韌帶組織的修復(fù)和重建仍然是生物醫(yī)學(xué)以及臨床醫(yī)學(xué)面臨的重大難題。目前，膝關(guān)節(jié)外科手術(shù)依然是治療ACL損傷的主要手段，但令人遺憾的是雖然手術(shù)有治療作用，但它仍然是一種“拆東墻補西墻”以有損傷為代價的治療方法，術(shù)后遠景不佳，很難滿足臨床救治的需要，離人們所希望的“重建出一條具有完整功能的韌帶”相差甚遠［1］。

力學(xué)生物學(xué)是生物力學(xué)新興的研究領(lǐng)域成為當(dāng)前國內(nèi)外研究的熱點。力學(xué)生物學(xué)是研究通過體外施加力學(xué)刺激來模擬生物體損傷、修復(fù)機理，闡明機體的力學(xué)過程與生物學(xué)過程之間的相互關(guān)系，從而研發(fā)出新技術(shù)、新方法，促進生物醫(yī)學(xué)基礎(chǔ)與臨床研究的發(fā)展［2］。

目前，臨床上主要使用自體移植物、異體移植物和人工合成生物材料進行ACL重建手術(shù)。雖然用自體或異體移植物重建交叉韌帶是臨床手術(shù)的最佳選擇，并且效果不錯，如自體髕韌帶移植能夠保證較高的力學(xué)強度，但自體供區(qū)會繼發(fā)髕腱炎、髕下脂肪墊攣縮、相應(yīng)部位髕骨骨折等并發(fā)癥。而異體移植物重建ACL不僅材料來源較少，而且會伴有免疫排斥反應(yīng)，甚至有傳播疾病的危險。作為生物移植物，自體和異體移植都要經(jīng)歷組織壞死、血管重建、細(xì)胞增殖和組織重塑“韌帶化”的過程，移植物的強度會明顯下降，影響術(shù)后效果。本文著重從力學(xué)生物學(xué)在膝關(guān)節(jié)韌帶組織損傷與修復(fù)機理研究中應(yīng)用的研究進展進行報道，為臨床診斷與治療提供新的思路。

1 膝關(guān)節(jié)韌帶的結(jié)構(gòu)與功能

膝關(guān)節(jié)韌帶主要是由厚而致密，平行于縱軸的螺旋形膠原纖維束組成。成纖維細(xì)胞在膠原束之間，沿著力學(xué)加載的方向排列。在ACL組織中膠原蛋白大約占蛋白總量的80%，其中以I型膠原為主，其次為III型膠原，相比之下，在內(nèi)側(cè)副韌帶（medial cruciate ligament，MCL）組織中膠原蛋白所占比例遠遠高于ACL組織，I型膠原和III型膠原分別占膠原蛋白總量的95%、5%。Woo等報道在兔子模型中 MCL的楊氏模量［（1120±153）MPa］是ACL組織［（516±64）MPa］的兩倍之多，因此，MCL組織具有很強的力學(xué)特性［3］。

在膝關(guān)節(jié)韌帶中每條韌帶各盡其能，同時每條韌帶又與其它韌帶或組織協(xié)同完成一些身體機能方面的功能。ACL起于股骨髁間的后部，向前向下止于脛骨髁間隆突的前外側(cè)，主要功能是防止膝關(guān)節(jié)脛骨過度前移（或股骨后移）。臨床發(fā)現(xiàn)內(nèi)側(cè)副韌帶或外側(cè)副韌帶（laterial collateral ligament，LCL）單獨撕裂，僅能導(dǎo)致內(nèi)側(cè)面或外側(cè)面方向的不穩(wěn)，若ACL和MCL聯(lián)合撕裂，則會導(dǎo)致內(nèi)側(cè)、向前和前內(nèi)側(cè)旋轉(zhuǎn)的不穩(wěn)。膝關(guān)節(jié)前交叉韌帶還有一些其他方面的重要功能，如在保持關(guān)節(jié)面的生理壓力方面起著重要的作用，有助于保護關(guān)節(jié)軟骨，控制關(guān)節(jié)滑動。另外，韌帶具有重要的本體感覺功能，從而對膝關(guān)節(jié)的運動有著重要意義。

2 ACL與MCL損傷與修復(fù)的差異

ACL是由一薄層滑膜組織包裹的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)，處于關(guān)節(jié)腔內(nèi)部微環(huán)境中，一旦滑膜組織破裂，ACL暴露于關(guān)節(jié)液中，就會出現(xiàn)出血性故障，產(chǎn)生蛋白水解酶類。由于其特殊的關(guān)節(jié)位置和非常有限的血管環(huán)境，ACL不能形成中間瘢痕組織且缺乏最初的炎性反應(yīng)，造成組織不能愈合［4－5］。MCL組織損傷修復(fù)期間能夠得到周圍血管提供的足夠營養(yǎng)，從而促進組織自身修復(fù)（圖1）［1］。Murray等研究發(fā)現(xiàn)利用富含血小板的血漿制成的膠原支架有利于損傷的ACL修復(fù)［6］。

圖1 ACL與MCL修復(fù)能力差異示意圖

ACL和MCL組織本身遺傳性差異能夠幫助解釋它們不同的愈合能力。眾多的研究表明，ACL與MCL組織本身存在特異性差異如：細(xì)胞的黏附、遷移和增殖等。細(xì)胞增殖、遷移、蛋白合成以及胞外基質(zhì)合成在結(jié)締組織損傷后修復(fù)以及組織重塑中起主要作用。MCL成纖維細(xì)胞增殖與遷移的能力都高于ACL成纖維細(xì)胞，并且MCL成纖維細(xì)胞對I、III型膠原的黏附力遠遠高于ACL成纖維細(xì)胞。據(jù)報道，機械拉伸損傷后的ACL成纖維細(xì)胞中I型膠原和III型膠原的mRNA表達都增加了，在MCL和ACL受傷部位，MCL組織中原膠原的mRNA表達高于ACL組織［7］。但是，ACL和MCL的損傷與修復(fù)過程是非常復(fù)雜的，需要進一步對ACL損傷機理進行更加深入的研究。ACL與MCL本身遺傳特異性差異確實是其修復(fù)能力存在差異的一個主要因素，但是通過外源性施加生長因子等方法可以很好地改善兩者之間存在的差異［8］。

3 力學(xué)生物學(xué)在韌帶組織損傷與修復(fù)的應(yīng)用

由于ACL損傷后治療手段匱乏，因此，需要對ACL的損傷機制做更深入的研究。ACL損傷后關(guān)節(jié)腔內(nèi)大量的基質(zhì)金屬蛋白酶（matrix metalloproteinases，MMPs）累積可能是導(dǎo)致ACL不能自身修復(fù)的原因之一。無論是正常、還是損傷的組織，細(xì)胞外基質(zhì)的降解與合成都處在一個動態(tài)平衡過程。在這個過程中，老化的或者損傷的組織退化降解，被新合成的組織所代替，這個平衡受到MMPs和基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑 （tissue inhibitors of metalloproteinases，TIMPs）協(xié)調(diào)控制。TIMPs和MMPs是作為調(diào)節(jié)組織再生的效應(yīng)分子，其中MMPs是組織修復(fù)過程的退化因子，而TIMP是其抑制因子。

長期慢性潰瘍組織液檢測發(fā)現(xiàn)組織液中大量MMPs的釋放與積累，損傷后早期MMPs的表達明顯增加，而其天然特異性抑制劑TIMP－1的表達則無顯著變化［9］。細(xì)胞水平實驗結(jié)果表明，在機械損傷應(yīng)力作用下，ACL成纖維細(xì)胞釋放大量酶原形式 MMP－2，并可轉(zhuǎn)化為活化形式的 MMP－2，從而破壞修復(fù)的進程。研究還發(fā)現(xiàn)ACL損傷后，整體MMPs的活性和MMPs基因表達一致上調(diào)，而TIMPs作用則不顯著，這表明ACL損傷后，MMPs／TIMPs平衡被破壞［10－11］。

當(dāng)韌帶組織撕裂后，損傷的ACL組織就完全暴露于關(guān)節(jié)液中，關(guān)節(jié)液中的炎癥因子也已經(jīng)被證明在正常和病理條件下可以誘發(fā)一系列的MMPs的表達。當(dāng)對韌帶組織施加機械應(yīng)力時，細(xì)胞因子IL－1β、TGF－β1和 TNF－α都能顯著增加 MMPs的表達［12－13］。因此，可以認(rèn)為 ACL損傷后不能修復(fù)的原因可能是由于機械損傷與炎癥因子進一步誘導(dǎo)MMPs的表達與酶的活性增加從而破壞關(guān)節(jié)腔內(nèi)組織胞外基質(zhì)合成與降解平衡導(dǎo)致。

Zhou等研究發(fā)現(xiàn)在機械應(yīng)力的作用下ACL成纖維細(xì)胞比MCL成纖維細(xì)胞釋放更多的酶原以及活化形式的MMP－2，且是 MCL成纖維細(xì)胞的 MMP－2活性的20倍左右［14］。ACL成纖維細(xì)胞與MCL成纖維細(xì)胞相比在機械損傷應(yīng)力作用下賴氨酰氧化酶 （Lysyl oxidase，LOX）的表達不同，無論分子還是蛋白水平MCL都顯著高于ACL［15］。大鼠ACL扭轉(zhuǎn)損傷模型也證明膝關(guān)節(jié)腔內(nèi)組織在ACL扭轉(zhuǎn)損傷后釋放大量的MMPs，尤其是滑膜組織，大量酶原形式的MMP－2轉(zhuǎn)化成活性形式［14］。因此，研究關(guān)節(jié)腔內(nèi)組織在機械應(yīng)力作用下誘導(dǎo)MMPs、LOXs等組織損傷與修復(fù)相關(guān)蛋白的表達機制以及炎癥因子的作用，可以使我們更深入的了解組織損傷與修復(fù)過程。

因此，力學(xué)生物學(xué)在ACL損傷與修復(fù)以及組織功能性再生的體外實驗研究中是不可或缺的。它可以很好的模擬體內(nèi)ACL組織的受力情況，為其機理研究提供可靠的實驗平臺。

4 力—化學(xué)協(xié)同效應(yīng)對ACL損傷與修復(fù)的影響

組織損傷后都會伴隨急性炎癥反應(yīng)，炎癥因子與細(xì)胞之間的響應(yīng)在皮膚修復(fù)以及韌帶／肌腱損傷等都已經(jīng)得到深入的研究。炎癥因子在損傷修復(fù)機制過程中尤其是在急性炎癥期起到重要的調(diào)控作用。Tang等實驗結(jié)果表明ACL損傷后，炎癥因子（IL－1β、IL－6和 TNF－α）的表達水平呈時間依賴性增高［16］。因此，炎癥期和瘢痕組織形成等常規(guī)的組織損傷愈合機制在ACL損傷后同樣要經(jīng)歷。如果ACL的損傷沒有得到及時有效的治療，關(guān)節(jié)液中高表達的炎癥因子尤其是IL－1β和TNF－α將會引起MMPs等降解酶類活性的增加，從而導(dǎo)致?lián)p傷的ACL以及關(guān)節(jié)軟骨等關(guān)節(jié)腔組織的降解，最終發(fā)展成骨關(guān)節(jié)炎等退行性病變。

在韌帶組織損傷與修復(fù)過程中，伴隨著舊組織的降解以及新組織的合成。胞外基質(zhì)的降解與合成是一個極其復(fù)雜的調(diào)控過程，通過對這一過程的調(diào)控會很大程度上影響韌帶的修復(fù)能力。在韌帶組織重塑過程中，胞外基質(zhì)降解與合成這一動態(tài)過程是由MMPs、TIMPs以及LOXs進行協(xié)同調(diào)控［17］?？傮w上說，在組織重塑胞外基質(zhì)降解過程中MMPs起主導(dǎo)作用，反之TIMP起主要作用。

急性損傷的組織液中MMP－2和MMP－9的活性顯著增加，在慢性皮膚潰瘍疾病中高表達的MMPs最終會導(dǎo)致傷口不能夠愈合［18］。Tang等研究發(fā)現(xiàn)大鼠ACL撕裂損傷后，關(guān)節(jié)液中酶原形式的 MMP－2活性隨時間依賴性增強，并且整體MMPs家族的活性隨著損傷時間的增加而增強。ACL的機械損傷是導(dǎo)致炎癥反應(yīng)以及MMPs活性增強的直接原因，但是炎癥因子的高表達也是誘導(dǎo)MMPs活性進一步增強的因素。

與ACL相比，滑膜組織等關(guān)節(jié)腔內(nèi)其它組織都能夠向體外組織培養(yǎng)的上清液中釋放更多的酶原以及活化形式的MMP－2，并且大量的酶原形式MMP－2轉(zhuǎn)化為活化形式。在ACL損傷的同時，關(guān)節(jié)腔內(nèi)組織如滑膜組織也會受到不同程度的損傷，巨噬細(xì)胞、炎癥細(xì)胞也會增強滑膜細(xì)胞MMP－2的表達［19］。Zhang等［20］研究表明，在機械損傷應(yīng)力作用下 TNF－α抑制LOXs的表達，卻上調(diào)MMPs的表達，而TGF－β1則都上調(diào) MMPs及LOXs的表達。因此，在關(guān)節(jié)腔內(nèi)組織中滑膜組織是關(guān)節(jié)液中MMP－2累積的主要貢獻者，并能使大量的酶原形式MMP－2轉(zhuǎn)化為活化形式［16］。

此外，其它關(guān)節(jié)腔內(nèi)組織比如：后交叉韌帶、關(guān)節(jié)軟骨以及半月板在ACL損傷后的關(guān)節(jié)腔微環(huán)境內(nèi)也會發(fā)生相應(yīng)的變化。與MCL所處的微環(huán)境相比，ACL處于一個相對封閉的關(guān)節(jié)腔微環(huán)境，因此，有利于炎癥因子以及MMPs的累積。大量累積的MMPs能夠打破新組織合成與降解之間的平衡，從而導(dǎo)致關(guān)節(jié)腔內(nèi)組織的可行性退化，不利于組織的修復(fù)。

ACL與MCL兩種韌帶細(xì)胞修復(fù)的差異可能起因于炎癥因子的不同作用。炎癥因子可改變細(xì)胞表面受體的數(shù)量、密度、黏附區(qū)域或成纖維細(xì)胞的形態(tài)，并影響細(xì)胞的遷移速度。Sung等［21］研究發(fā)現(xiàn)LPS、TNF－α、C5a等能夠增加 ACL與 MCL成纖維細(xì)胞的粘附性，在不同時間點抑制作用則不同。

Yang等［16］研究發(fā)現(xiàn)在ACL損傷后關(guān)節(jié)液中IL－1β和TNF－α的表達量顯著增加，這些因子通過刺激其它關(guān)節(jié)腔內(nèi)組織進一步調(diào)控MMPs的表達。Tsuzaki等［22］發(fā)現(xiàn)在人的肌腱機械損傷后，肌腱成纖維細(xì)胞對外源性炎癥因子通過細(xì)胞表面特異性受體進行響應(yīng)，通過表達COX－2和PGE2來激活急性／慢性炎癥反應(yīng)，并釋放大量MMPs降解胞外基質(zhì)，IL－1β能夠誘導(dǎo)韌帶成纖維細(xì)胞MMP－1、MMP－3mRNA的表達。另有研究結(jié)果表明，IL－1β和 TNF－α兩種炎癥因子都能促進 MMP－2活性的增強，其中以IL－1β的作用最為顯著。ACL成纖維細(xì)胞MMP－2的活性對IL－1β不僅有劑量依賴性而且隨作用時間的增加而顯著增強，將這兩種炎癥因子共同作用于ACL成纖維細(xì)胞發(fā)現(xiàn)對MMP－2的活性及蛋白表達有著顯著的增強，這也表明ACL成纖維細(xì)胞對炎癥因子刺激非常敏感，在力—化學(xué)協(xié)同作用下促進MMPs的釋放以及活性的增強。IL－1β和TGF－β1在機械應(yīng)力作用下均能上調(diào)LOXs家族的表達，且以MCL細(xì)胞中的表達尤為顯著，IL－1β上調(diào)LOXs家族的表達呈劑量依 賴 性［23－24］。TNF－α 抑 制 韌 帶 成 纖 維 細(xì) 胞 中LOXs的表達，且以ACL成纖維細(xì)胞的抑制效果較為顯著［25］。由于關(guān)節(jié)液中炎癥因子以及MMPs的大量累積，從而導(dǎo)致胞外基質(zhì)尤其是I型膠原的降解，不利于韌帶的修復(fù)。

在生理條件下，ACL損傷后機械應(yīng)力與其它炎癥因子、細(xì)胞因子共同作用于損傷的關(guān)節(jié)腔內(nèi)組織。這也就意味著ACL損傷后關(guān)節(jié)腔內(nèi)的炎癥因子以及機械應(yīng)力對ACL成纖維細(xì)胞MMPs的活性有著顯著的影響，尤其是在這種復(fù)雜的關(guān)節(jié)腔微環(huán)境下對MMPs的活性具有進一步放大的作用。

此外，關(guān)節(jié)腔是一個相對密閉的微環(huán)境，被滑膜組織所包圍的關(guān)節(jié)腔微環(huán)境有利于炎癥因子的累積。隨著MMPs的表達以及活性的增加，會使新組織合成與壞死組織降解之間的平衡被打破，從而導(dǎo)致?lián)p傷后的關(guān)節(jié)腔內(nèi)組織可行性退化以致消失。

5 結(jié)語

力學(xué)生物學(xué)在膝關(guān)節(jié)韌帶損傷中的應(yīng)用研究得到了國內(nèi)外研究者越來越廣泛的關(guān)注。ACL損傷后除了組織本身存在的先天遺傳不足外，其損傷后關(guān)節(jié)腔力－化學(xué)微環(huán)境的變化也是導(dǎo)致不能自我修復(fù)的主要原因。因此，通過彌補ACL組織的先天不足和改善損傷后關(guān)節(jié)腔微環(huán)境對ACL修復(fù)起到積極促進作用。

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