任寧濤,張 恒,李 潔,雷 偉,張 然,張永剛,崔 賡

論 著

模擬失重對(duì)雌性大鼠背根神經(jīng)節(jié)的影響

任寧濤1,張 恒1,李 潔2,雷 偉4,張 然3,張永剛1,崔 賡1

目的 觀察模擬失重對(duì)雌性大鼠背根神經(jīng)節(jié)(dorsal rootganglion, DRG)的影響。方法 選取健康雌性大鼠80只，隨機(jī)分為尾部懸吊實(shí)驗(yàn)組(n=40)和正常對(duì)照組(n=40)。實(shí)驗(yàn)組按照Morey-Holton教授提出的方法保持-30°頭低位及后肢自由懸垂不負(fù)重的狀態(tài)，各組大鼠按標(biāo)準(zhǔn)條件進(jìn)行飼養(yǎng)。4周后取右側(cè)L5DRG，HE染色觀測(cè)DRG細(xì)胞形態(tài)，免疫組化觀測(cè)髓鞘情況，電鏡觀測(cè)DRG髓鞘及線粒體超微結(jié)構(gòu)。結(jié)果 HE染色結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)組DRG細(xì)胞間隙輕度增寬，部分節(jié)細(xì)胞與衛(wèi)星細(xì)胞分離。免疫組化結(jié)果顯示，對(duì)照組免疫組化染色及IOD值(0.573±0.007)較實(shí)驗(yàn)組IOD值(0.802±0.009)降低(P<0.05)，電鏡下可見(jiàn)實(shí)驗(yàn)組髓鞘結(jié)構(gòu)紊亂、松散，線粒體腫大、變形。結(jié)論 模擬失重可引起雌性大鼠DRG髓鞘及線粒體發(fā)生損傷性變化，推測(cè)模擬失重下可導(dǎo)致雌性大鼠DRG損傷。

模擬失重；背根神經(jīng)節(jié)；動(dòng)物模型

隨著天空科技的不斷進(jìn)步，人類向宇宙探索的步伐愈來(lái)愈快，當(dāng)宇航員離開(kāi)地球重力環(huán)境暴露于失重環(huán)境下時(shí)可引起機(jī)體生理功能發(fā)生變化[1-3]，如骨質(zhì)疏松[4，5]、肌肉萎縮[6]、心血管功能紊亂[7，8]等。背根神經(jīng)節(jié)(dorsal rootganglion, DRG)作為感覺(jué)傳入第一級(jí)神經(jīng)元，作為功能性脊柱單位的“大腦”[9]，與腰背痛和根性痛有著密切的關(guān)系,失重狀態(tài)下可引起DRG大神經(jīng)元發(fā)生改變[10]。Morey-Holton和Globus[11]提出的大鼠尾部懸吊模型能夠有效模擬失重狀態(tài)，通過(guò)此模型發(fā)現(xiàn)模擬失重下可引起雌性大鼠L5DRG動(dòng)作電位傳導(dǎo)速度下降，髓鞘呈退變性改變[12]，但此研究未深入研究髓鞘形態(tài)改變，有其局限性。隨著女航天員人數(shù)的日益增多，針對(duì)女性或雌性方面研究的重要性顯得愈來(lái)愈凸顯。為此，筆者研究模擬失重對(duì)雌性大鼠DRG影響，完善此類研究，為模擬失重下雌性大鼠DRG損傷提供更多的實(shí)驗(yàn)證據(jù)。

1 材料與方法

1.1 制備大鼠模擬失重模型 選用健康雌性SD大鼠80只，鼠齡為12～14周(體重約300 g)，隨機(jī)分為實(shí)驗(yàn)組(n=40)和對(duì)照組(n=40)，實(shí)驗(yàn)組按照Morey- Holton[20]教授提出的方法保持-30°頭低位及后肢自由懸垂不負(fù)重的狀態(tài)，各組大鼠按標(biāo)準(zhǔn)條件進(jìn)行飼養(yǎng)。

1.2 取材 4周后，每組大鼠腹腔內(nèi)注射戊巴比妥鈉(45 mg/kg)進(jìn)行麻醉，麻醉后，進(jìn)行DRG的摘取，兩組各取右側(cè)L5DRG 20個(gè)，制作冷凍切片，厚度為5 μm，用于DRG HE染色和免疫組化染色。相同的方法摘取右側(cè)L5DRG 40個(gè)，兩組各20個(gè)，用于電鏡觀測(cè)。

1.3 觀測(cè)指標(biāo)

1.3.1 HE染色 取DRG冷凍切片20個(gè)，兩組各10個(gè)，切片固定→水洗→染蘇木素→分化→于堿水中返藍(lán)→伊紅染色→脫水，透明，封片，鏡下觀察結(jié)果。

1.3.2 免疫組化檢測(cè) 取DRG冷凍切片，室溫放置30 min后，入4 ℃丙酮固定10 min，PBS洗。用3%過(guò)氧化氫孵育5～10 min。5%～10%正常山羊血清(PBS稀釋)封閉，室溫孵育10 min。滴加一抗：?jiǎn)慰沟腄egen MBP (1∶1000; Chemicon Inc.)，37 ℃孵育2 h。滴加二抗：FITC標(biāo)記的驢抗兔IgG，(1∶200；J ackson Immuno Research Laboratories Inc., West Grove, PA)，37 ℃孵育30 min，滴加辣根酶標(biāo)記鏈霉卵白素，37 ℃孵育30 min。封片后顯微鏡(奧林巴斯CX31)下觀測(cè)，測(cè)定比較兩組IOD值。

1.3.3 電鏡觀察 取DRG 40個(gè)，兩組各20個(gè)，經(jīng) 2%戊二醛和1%餓酸4 ℃固定，乙醇逐級(jí)脫水，Epon 812包埋液常規(guī)浸透、包埋,半薄切片,經(jīng)甲苯胺藍(lán)染色,光鏡下定位,超薄切片(70 nm),再經(jīng)鈾-鉛鹽雙染色，電鏡(Hitachi，S-3400N)下觀測(cè)實(shí)驗(yàn)組(尾部懸吊組)和對(duì)照組的髓鞘形態(tài)板層排列及DRG內(nèi)線粒體形態(tài)。

2 結(jié) 果

2.1 兩組大鼠基本情況 實(shí)驗(yàn)組大鼠飲食及活動(dòng)均正常，體重增加與對(duì)照組差異不明顯，無(wú)脫毛等現(xiàn)象。

2.2 DRG HE染色結(jié)果 與對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)組

DRG細(xì)胞間隙輕度增寬，部分節(jié)細(xì)胞與衛(wèi)星細(xì)胞分離(圖1)。

2.3 DRG免疫組化結(jié)果 實(shí)驗(yàn)組Degen MBP表達(dá)較對(duì)照組增多(圖2)，實(shí)驗(yàn)組免疫組化IOD值為0.802±0.009，對(duì)照組免疫組化IOD值為0.573±0.007，兩組IOD值對(duì)比，對(duì)照組較實(shí)驗(yàn)組降低(P<0.05)。

2.4 DRG電鏡觀測(cè)結(jié)果 與對(duì)照組髓鞘致密板層結(jié)構(gòu)相比，實(shí)驗(yàn)組髓鞘結(jié)構(gòu)變得紊亂、松散(圖3)，實(shí)驗(yàn)組髓鞘超微結(jié)構(gòu)示髓鞘水腫、變性、部分脫落(圖4)。線粒體電鏡下觀測(cè)示，實(shí)驗(yàn)組線粒體腫大、變形(圖5)。

圖1 大鼠背根神經(jīng)節(jié)(HE，×100)

圖2 大鼠背根神經(jīng)節(jié)Degen MBP表達(dá)的

圖3 電鏡下大鼠背根神經(jīng)節(jié)髓鞘結(jié)構(gòu)(×5000)

圖4 電鏡下大鼠背根神經(jīng)節(jié)髓鞘超微結(jié)構(gòu) (×50 000)

圖5 電鏡下大鼠背根神經(jīng)節(jié)線粒體超微結(jié)構(gòu)(×50 000)

3 討 論

由于空間搭載進(jìn)行實(shí)驗(yàn)研究的機(jī)會(huì)相對(duì)較少，而且成本很高，因此地面模擬失重研究成為對(duì)空間生命科學(xué)研究的重要補(bǔ)充。Morey-Holton等[11]提出的大鼠尾部懸吊模型已被廣泛采用，可有效模擬失重狀態(tài)。DRG作為功能性脊柱單位的“大腦”[9]，與腰背痛和根性痛有著密切的關(guān)系,其研究意義不言而明。與此同時(shí)，隨著人類對(duì)外太空探索的需要，女航天員的人數(shù)越來(lái)越多，對(duì)雌性大鼠研究就越顯尤為重要。前期的實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，尾部懸吊4周后即可出現(xiàn)明顯的變化[5,7]，故本實(shí)驗(yàn)直接通過(guò)懸吊4周來(lái)觀測(cè)模擬失重對(duì)雌性大鼠DRG的影響。本研究HE染色結(jié)果顯示，通過(guò)4周的模擬失重，實(shí)驗(yàn)組DRG內(nèi)出現(xiàn)細(xì)胞間隙輕度增寬，部分節(jié)細(xì)胞與衛(wèi)星細(xì)胞分離，與其他研究失重下DRG變化結(jié)果相一致，證明此次造模成功，為后面的實(shí)驗(yàn)結(jié)果奠定理論基礎(chǔ)，亦驗(yàn)證了前期實(shí)驗(yàn)的結(jié)果。

髓鞘堿性蛋白(myelin basic protein, MBP) 位于髓鞘漿膜面, 是組成髓鞘的主要蛋白之一, 是神經(jīng)系統(tǒng)所特有的蛋白質(zhì)，具有神經(jīng)組織特異性。Degen MBP是指退變的MBP，通過(guò)檢測(cè)Degen MBP表達(dá)量可反映髓鞘的退變情況。本實(shí)驗(yàn)免疫組化結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)組Degen MBP表達(dá)較對(duì)照組增多，兩組IOD值比較，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，由此可見(jiàn)模擬失重狀態(tài)下可加速髓鞘的退變。電鏡下亦可見(jiàn)實(shí)驗(yàn)組DRG髓鞘結(jié)構(gòu)紊亂、扭曲，呈退變性改變，此結(jié)果更加直觀的顯示出模擬失重引起的髓鞘改變，與免疫組化結(jié)果相一致，從另一個(gè)角度驗(yàn)證了失重環(huán)境對(duì)雌性大鼠DRG的影響。

線粒體是細(xì)胞內(nèi)氧化磷酸化和合成三磷酸腺苷(ATP)的主要場(chǎng)所，為細(xì)胞的活動(dòng)提供能量，因此有“細(xì)胞動(dòng)力工廠”之稱。除了為細(xì)胞供能外，線粒體還參與諸如細(xì)胞分化、細(xì)胞信息傳遞和細(xì)胞凋亡等過(guò)程，并擁有調(diào)控細(xì)胞生長(zhǎng)和細(xì)胞周期的能力。本研究4周的尾部懸吊發(fā)現(xiàn)，實(shí)驗(yàn)組線粒體腫脹明顯、變形，呈損傷性變化，當(dāng)線粒體發(fā)生損傷時(shí)，那么DRG的能量供應(yīng)和細(xì)胞傳遞等過(guò)程都將受損?？砷g接引起DRG的損傷，此實(shí)驗(yàn)結(jié)果從能量供應(yīng)方面驗(yàn)證了失重環(huán)境對(duì)雌性大鼠DRG的損害，為后期進(jìn)一步的研究損傷機(jī)制奠定理論基礎(chǔ)。

綜上所述，4周模擬失重可以引起雌性大鼠DRG損傷，為尾部懸吊大鼠作為模擬失重的實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ吞峁└鄬?shí)驗(yàn)依據(jù)。但本實(shí)驗(yàn)未進(jìn)行雌雄性別之間的比較，后期需對(duì)性別因素進(jìn)行研究。對(duì)于長(zhǎng)時(shí)間(>4周)懸吊大鼠模型DRG改變的情況、失重條件去除后損傷是否可逆還有待于后期進(jìn)一步研究。

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(2015-03-24收稿 2014-04-24修回)

(責(zé)任編輯 梁秋野)

Effects of simulated weightlessness on DRG in female rats

REN Ningtao1, ZHANG Heng1, LI Jie2, LEI Wei4, ZHANG Ran3, ZHANG Yonggang1,and CUI Geng1.

1.Orthopedics Department， 2.Gynecology Department， 3.Cardiology Department, General Hospital of PLA， Beijing，100853，China；4. Orthopedics Department, Xijing Hospital, The Fourth Military Medical University, Xi’an 710032, China

Objective To observe the effect of simulated weightlessness on DRG in female rat model. Method 80 female Sprague-Dawley rats were randomly designated as HU groups (n=40) and normal control(NC) groups (n=40). Four weeks later, the L5 DRG was excised, lumbar 5 DRG were stained with HE staining, the myelin of DRG was observed by using immunohistochemistry. TEM method aimed to observe the DRG myelin and mitochondria. Results HE staining showed that, in HU groups, the arrangement between cells in DRG were slightly loose, some ganglion cells and satellite cells were separated. IOD in NC groups was 0.573±0.007, which was lower than in HU groups (0.802±0.009)(P<0.05). In HU group, the structure of myelin was disorderly and twisted. Mitochondria in HU group were swollen and deformed obviously. Conclusions Stimulated weightlessness can cause the damage changes in the DRG myelin and mitochondria. These suggests that simulated weightlessness can cause damage in female rat DRG.

simulated weightlessness；dorsal root ganglion； animal model

航天醫(yī)學(xué)基礎(chǔ)與應(yīng)用國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室開(kāi)放基金(SMFA15K03)；武器裝備預(yù)研基金(9140A17040109JB1003)

任寧濤，碩士研究生， E-mail：ningtaoren@163.com

100853 北京，解放軍總醫(yī)院：1.骨科，2.婦產(chǎn)科，3.心內(nèi)科；4.710032 西安，第四軍醫(yī)大學(xué)西京醫(yī)院骨科

崔 賡，E-mail：cuigeng@aliyun.com

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