李志鋼，王新莊，于文浩，石奎林，秦瑞峰，石育銘，翟明勝，劉遠哲

(1.河南農(nóng)業(yè)大學(xué) 牧醫(yī)工程學(xué)院，河南鄭州 450002；2.平頂山郟縣紅牛繁育中心，河南 平頂山 467000)

郟縣紅牛同期發(fā)情及超數(shù)排卵的研究

李志鋼1,2，王新莊1*，于文浩1，石奎林2，秦瑞峰1,2，石育銘2，翟明勝1，劉遠哲1

(1.河南農(nóng)業(yè)大學(xué) 牧醫(yī)工程學(xué)院，河南鄭州 450002；2.平頂山郟縣紅牛繁育中心，河南 平頂山 467000)

[目的]探討生產(chǎn)中郟縣紅牛同期發(fā)情及超數(shù)排卵的方法。[方法]篩選75頭郟縣紅牛分組分批進行同期發(fā)情及超數(shù)排卵。[結(jié)果]顯示，CIDR+PG法處理組母牛同期發(fā)情率(100%)顯著高于PG二次法處理組(76%)(P>0.05)；用加拿大促卵泡素(FSH)超排時頭均獲胚數(shù)6.33枚，用中科院動物所促卵泡素(FSH)超排時頭均獲胚數(shù)為6.00枚，二者差異不顯著(P>0.05)。[結(jié)論]分析結(jié)果可知，CIDR+PG法處理比PG二次法對郟縣紅牛的同期發(fā)情效果好；進口促卵泡素(FSH)與國產(chǎn)促卵泡素(FSH)對郟縣紅牛的超排效果無顯著差異。

郟縣紅牛；同情發(fā)情；超數(shù)排卵

郟縣紅牛是我國著名的役肉兼用型地方優(yōu)良黃牛品種，是在特定的生態(tài)環(huán)境條件下經(jīng)過農(nóng)民世代精心選育而形成的優(yōu)良地方品種，其耐粗飼，抗病性、適應(yīng)性強，繁殖率高，是優(yōu)秀的肉牛雜交母本，是發(fā)展肉牛產(chǎn)業(yè)、培育優(yōu)良高檔肉牛品種的重要品種資源[1]。目前受社會大環(huán)境的影響，農(nóng)業(yè)機械化程度的提高，農(nóng)戶不需要郟縣紅牛耕役，郟縣紅牛的存欄量大幅下降，一直以來郟縣紅牛群選群育的環(huán)境消失了；改革開放以來，由于過度追求肉牛的經(jīng)濟效益，而且自上世紀90年代開始大力推廣牛的人工授精技術(shù)，便盲目引進高度培育的品種進行雜交，加之缺乏強有力的資金、技術(shù)、安定的社會環(huán)境支持，導(dǎo)致郟縣紅牛數(shù)量日趨減少、品種嚴重衰退、許多寶貴基因丟失。因此針對郟縣紅牛的品種保護工作顯得日益嚴峻。

目前牛保種最經(jīng)濟、最有效、最實用的方法是建立郟縣紅牛的胚胎基因庫[2]。建立胚胎基因庫的關(guān)鍵技術(shù)是同期發(fā)情、超數(shù)排卵和胚胎冷凍保存，該技術(shù)早已在奶牛、水牛上得以廣泛的應(yīng)用與推廣，應(yīng)用于肉牛的報道也屢見不鮮，不少地方品種如南陽黃牛、秦川牛、晉南牛、延邊牛等品種的同期發(fā)情與超數(shù)排卵也已有報道[3-15]。本研究探索了郟縣紅牛同期發(fā)情及超數(shù)排卵，旨在建設(shè)郟縣紅牛胚胎基因庫，為保護郟縣紅牛品種奠定技術(shù)基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 供試動物

試驗于2010年12月～2012年12月在河南省平頂山市羴牛畜禽良種繁育公司郟縣紅牛繁育中心進行。

75頭頭胎經(jīng)產(chǎn)純種郟縣紅牛，均篩選自郟縣紅牛繁育中心，分三批，2010年12月30頭， 2011年11月20頭，2012年12月25頭；每批次分組用進口促卵泡素(FSH)與國產(chǎn)促卵泡素(FSH)。

試驗期間，所有供試母牛均提前1個月檢查，選取性周期正常、無生殖器官疾病、膘情適中的母牛。供試母牛全部舍飼，以青粗飼料搭配精料飼喂，并提前1個月進行強飼，同時補充維生素和礦物質(zhì)。

所用精液均采自平頂山市郟縣紅牛繁育中心合格公牛，制作細管活力在0.35以上。

1.2 儀器及設(shè)備

磁力攪拌器購自金壇市大地自動化儀器廠；CL-5500胚胎冷凍儀購自北京畢特博生物技術(shù)有限責(zé)任公司；XTL-1實體顯微鏡購自北京泰克儀器有限公司；顯微鏡恒溫板購自金壇市大地自動化儀器廠；恒溫水浴鍋購自北京中興偉業(yè)儀器有限公司。

1.3 試劑及藥品

磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)購自GIBCO 公司，氯前列烯醇(PG，0.2 mg/支)購自上海計劃生育科學(xué)研究所，促卵泡素(FSH，20 mg/mL)購自貝爾尼奇(加拿大)動物保健有限公司貝爾默實驗室，促卵泡素(FSH，10 mg/瓶)購自中科院動物研究所，促排3號(20 μg/支Lot No.20080703)購自寧波市激素制品有限公司，孕激素陰道栓(CIDR)購自新西蘭InterAg公司，牛血清白蛋白(BSA)Lot No.0305購自華美生物工程公司。

特級胎牛血清(FBS)(Lot No.041104yk3)購自中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院生物工程研究所。

1.3 試驗方法

1.3.1 試驗牛同期發(fā)情處理

(1) CIDR+PG法 在發(fā)情周期的任一天放置CIDR栓，記為第1 d，第12 d下午撤栓，撤栓的同時肌肉注射PG 0.4 mg/頭，之后觀察發(fā)情，準確記錄發(fā)情時間并統(tǒng)計發(fā)情率。

(2) 肌肉注射PG二次法 在發(fā)情周期的任一天肌注PG 0.4 mg/頭，記為第1 d，第12 d下午再肌注PG 0.4 mg/頭，之后觀察發(fā)情，準確記錄發(fā)情時間并統(tǒng)計發(fā)情率。

1.3.2 試驗牛的超排處理

(1)超排流程 在發(fā)情周期的任一天放置CIDR栓，或第一次肌注PG，記為第1 d，第10 d開始遞減劑量肌注FSH，準確區(qū)分記錄注射國產(chǎn)FSH和進口FSH牛號，每日2次，間隔時間12 h，連續(xù)4 d，每頭供體母牛注射FSH總量360 mg。第6次注射FSH的同時，再肌注氯前列烯醇(PG)0.4 mg/頭。試驗放栓的牛第12 d下午撤栓。觀察發(fā)情，發(fā)情牛輸精2次，間隔12h，每次輸2支細管凍精。

(2)國產(chǎn)FSH和進口FSH的使用

在超排過程中，不同F(xiàn)SH的使用方法相同，其中郟縣紅牛供體母牛中的50頭從第10 d開始連續(xù)四天遞減劑量肌肉注射國產(chǎn)FSH(中科院動物所產(chǎn)，規(guī)格10 mg/支)，對照組25頭郟縣紅牛供體母牛連續(xù)四天遞減劑量肌肉注射進口FSH(加拿大產(chǎn)，規(guī)格20 mg/mL)。

1.3.3 非手術(shù)法沖胚 輸精后6～7 d進行沖胚。沖胚前直腸檢查供體牛的超排反應(yīng)情況，同時記錄左、右側(cè)黃體數(shù)和黃體總數(shù)。使用三通式采胚管進行非手術(shù)法沖胚，每側(cè)子宮角各用500ml沖卵液沖洗7-8次，子宮回流液靜置后實體顯微鏡下檢胚。統(tǒng)計左、右側(cè)黃體數(shù)，黃體總數(shù)和獲胚數(shù)，應(yīng)用SAS8.0軟件分析處理實驗數(shù)據(jù)。

1.3.4 胚胎的凈化 將胚胎集中在一起，移入保存液中，分別從一個液滴移入另一個液滴中進行凈化，共3遍。這些液滴均為預(yù)先平衡1 h的保存液液滴。

1.3.5 胚胎的鑒定 首先剔除明顯退化胚胎和未受精卵，然后進行分級(圖1)。在7～40倍實體顯微鏡下觀察胚胎的形態(tài)、色調(diào)、分裂球的大小、均勻度、細胞的密度、與透明帶的間隙以及變性情況等，詳細記錄胚胎撿胚表。

圖1a A級與B級可用胚胎 圖1b C級和C級以下不可用胚胎

胚胎等級鑒定標準

A級胚胎：形態(tài)典型，卵細胞和分裂球的輪廓清晰，細胞質(zhì)致密，色調(diào)和分布極均一。

B級胚胎：與典型的胚胎相比，稍有變形，但卵細胞和分裂球的輪廓清晰，細胞質(zhì)較致，分布均勻，變性細胞和水泡不超過10%～30%。

C級胚胎：形態(tài)有明顯變異，卵細胞和分裂球輪廓稍不清晰，或部分不清晰，細胞質(zhì)不致密，分布不均勻，色調(diào)發(fā)暗，突出的細胞、水泡和變性細胞占20%～50%。

1.3.6 胚胎冷凍 收集到的可用胚胎轉(zhuǎn)入胚胎保護液中，吸入2.5 mm細管以三段法裝管，放入冷凍儀中冷凍，當(dāng)溫度降到-5～7℃進行植冰，然后繼續(xù)冷凍，降溫到-30～35℃，投入液氮保存。

2 結(jié)果與分析

2.1 兩種同期發(fā)情效果的比較

由表1可見，PG二次法處理的同期發(fā)情率為76%，而CIDR+PG法的同期發(fā)情率為100%，二者差異顯著(P<0.05)。

2.2 郟縣紅?？傮w超排效果比較

由表2可見，應(yīng)用連續(xù)4d遞減肌注FSH法對郟縣紅牛供體牛進行超排處理，獲得頭均黃體數(shù)9.89個，頭均獲胚數(shù)7.05枚，頭均獲可用胚數(shù)4.53枚。

2.3 進口FSH與國產(chǎn)FSH對超排效果的影響

由表3可見，采用加拿大進口和中科院動物所生產(chǎn)的FSH進行超排，二者獲得的頭均黃體數(shù)分別為14.00個和7.29個，差異顯著(P<0.05)，頭均獲胚數(shù)分別為6.33枚和6.00枚，差異不顯著(P>0.05)。

表1 不同同期發(fā)情處理方法對郟縣紅牛同期發(fā)情效果的影響

注：同列字母不同表示差異顯著(P<0.05)，下同。

表2 郟縣紅?？傮w超排效果比較

注：同列字母不同表示差異顯著(P<0.05)。

表3 進口與國產(chǎn)FSH對供體超排效果的比較

3 討論

3.1 不同同期發(fā)情處理方法對郟縣紅牛供體母牛同期發(fā)情效果的影響

氯前列烯醇(PG)具有溶解黃體的作用，但它只對母牛發(fā)情周期5～18 d的黃體有溶解作用，而對發(fā)情前后3～5 d則無溶解功能。因此，PG二次法處理后仍有部分母牛無反應(yīng)。本研究結(jié)果顯示，PG二次法處理郟縣紅牛同期發(fā)情率為76.0%，這與所選牛群的個體差異有一定的關(guān)系。

試驗中孕酮陰道栓(CIDR)在供體體內(nèi)持續(xù)分泌孕酮，維持血液中孕酮的高水平，抑制卵泡的生長。當(dāng)同時撤栓后，卵泡生長的抑制因素被解除，為卵泡的生長提供了一個共同的起點，具有良好的同期發(fā)情效果，但是，有些個體在撤栓時黃體還未退化，這樣在撤栓后黃體繼續(xù)分泌孕酮，達不到發(fā)情同期化的效果。針對這種情況，在撤栓后肌注PG，從而達到溶解黃體的目的，在一定程度上提高了同期發(fā)情的效果。本研究中郟縣紅牛撤栓后再肌注PG，同期發(fā)情率為100%。應(yīng)用PG二次法和CIDR+PG法對郟縣紅牛進行同期發(fā)情處理，同期發(fā)情率分別為76%和100%，兩者差異顯著(P<0.05)。本研究CIDR+PG處理法的同期發(fā)情率顯著高于PG二次法，同期發(fā)情效果明顯且理想，但是PG二次法在生產(chǎn)操作上，只需肌肉注射，并注意注射劑量一定要到位，操作相對簡單；一支氯前列烯醇(PG，0.2 mg/支)價格為3.5元，按76%發(fā)情率計算，單頭牛藥物成本為：18.4元，而CIDR+PG法生產(chǎn)操作上，需要在陰道投放孕激素陰道栓(CIDR)和肌肉注射，一支CIDR價格為56元，按100%發(fā)情率計算，單頭牛藥物成本為：59.5元。所以在PG二次法具有更高的性價比，也便于生產(chǎn)操作。

3.2 郟縣紅牛超數(shù)排卵研究

據(jù)資料統(tǒng)計，晉南牛頭均可用胚數(shù)3.94枚[7]、溫嶺高峰牛3.04枚[8]、青海黃牛4.00枚[9]、秦川牛4.20枚[10]、南陽牛4.28枚[11]、郟縣紅牛4.28枚，本研究共有效超排郟縣紅牛供體牛67頭次，獲得頭均黃體數(shù)9.89個，頭均獲可用胚數(shù)4.53枚。說明本研究所采用的超排方法處理郟縣紅牛是可行的。但是，在相同的飼養(yǎng)環(huán)境下，相同的技術(shù)方案，相同的技術(shù)條件下，每次生產(chǎn)中總有個體一次貢獻15枚左右的可用胚胎，因此，郟縣紅牛的超數(shù)排卵效果仍有待進一步提高。

3.3 國產(chǎn)與進口FSH對超排效果的影響

現(xiàn)階段國內(nèi)牛超排常用的FSH有進口和國產(chǎn)兩大類。進口FSH價格高，但效果和穩(wěn)定性高于國產(chǎn)產(chǎn)品。國產(chǎn)FSH價格低，從成本方面考慮有一定的優(yōu)勢。本試驗研究同時選用加拿大進口和國內(nèi)中科院動物所生產(chǎn)的FSH進行超排，結(jié)果表明在對郟縣紅牛超排處理后，進口FSH獲得的頭均黃體總數(shù)14.00±1.00個與國產(chǎn)FSH 7.29±5.56個差異顯著(P<0.05)，而進口FSH的頭均獲胚總數(shù)6.33±5.08枚與國產(chǎn)FSH的6.00±5.71枚差異不顯著(P>0.05)。進口FSH的超排效果明顯穩(wěn)定，但考慮到成本因素，生產(chǎn)中可以選用國產(chǎn)FSH對郟縣紅牛進行超數(shù)排卵。

[1] 付學(xué)乾. 河南省地方標準DB41 T012-1997 郟縣紅牛[S], 河南，平頂山市畜牧局，1997.

[2] 肖杰, 牛暉, 王居強, 等. 中國黃牛的現(xiàn)代保種方法[J]. 安徽農(nóng)業(yè)科學(xué), 2007,35(27):8505-8506.

[3] 王新莊, 竇忠英. 牛超排技術(shù)的研究[J]. 黃牛雜志, 1996,22(4):20-22.

[4] 徐照學(xué). 牛超數(shù)排卵技術(shù)的研究[J]. 黃牛雜志, 1999,25(3):17-18.

[5] 趙維. 氯前列烯醇誘導(dǎo)紅安格斯肉牛同期發(fā)情效果實驗[J]. 黑龍江動物繁殖, 2005,(3):31-32.

[6] 韋英明, 蔣如明. 不同同期發(fā)情方法對水牛發(fā)情和受胎率的影響[J]. 中國畜牧雜志, 2009, (1):35-36.

[7] 明世清. 建立晉南牛性別化胚胎庫的嘗試[J]. 黃牛雜志, 2003,(5):17-19.

[8] 蔣榮翔. 溫嶺高峰黃牛超排效果的分析[J]. 草食家畜, 2003, 增刊:77-78..

[9] 李全. 青海黃牛不同激素劑量超數(shù)排卵試驗初探[J]. 草食家畜, 2003,增刊:79-80.

[10] 李金輝, 王新莊, 梁家奎, 等. 秦川牛超數(shù)排卵效果的研究[J]. 中國畜牧獸醫(yī), 2007,34(2):132-138.

[11] 王木, 王新莊, 牛暉等. 南陽牛超數(shù)排卵研究[J]. 中國農(nóng)學(xué)通報, 2006, 22(8):47-49.

[12] 楊煒峰, 高志敏, 竇忠英. 母牛超數(shù)排卵的研究進展[J]. 西北農(nóng)林科技大學(xué)學(xué)報(自然科學(xué)版), 2003,31(2):166-169.

[13] 高騰云, 傅 彤. 對郟縣紅牛的主動保種問題討論[J]. 中國牛業(yè)科學(xué),2009,11:53-71.

[14] 和占星, 魏紅江. 牛超數(shù)排卵研究與應(yīng)用進展[J]. 中國農(nóng)學(xué)通報2010,26(23):12-17.

[15] 劉丑生. 牛胚胎發(fā)育階段和質(zhì)量等級的評定體系[J] .首屆中國牛業(yè)發(fā)展大會論文集[C].2006.

Study on Synchronization Estrus and Superovulation in Jiaxian Red Cattle

LI Zhi-gang1,2,WANG Xin-zhuang1*,YU Wen-hao1,SHI Kui-lin2,QIN Rui-feng1,2,SHI Yu-min2,ZHAI Ming-sheng1, LIU Yuan-zhe1

(1.CollegeofAnimalScienceandVeterinaryMedicine,HenanAgriculturalUniversity,ZhengzhouHenan450002,China;2.JiaxianRedCattleBreedingCenter,Pingdingshan,Henan, 467000,China)

【Objective】In order to study the method of synchronization estrus and superovulation during the production of Jiaxian red cattle. 【Method】 A total of 75 heads of Jiaxian red cattle were divided to some groups and were treated by synchronization estrus and superovulation in turn. 【Result】 The results showed that synchronization estrus rate of cows that treated with the "CIDR plus PG" method was 100%, which was significantly higher than that of cows that treated with the "PG plus PG" method (76%) (P<0.05). The average embryos of the imported (Canada) FSH were 6.33, which was no significant difference with that of the domestic (Institute of Zoology, Chinese Academy of Sciences) FSH (6.00) (P>0.05). 【Conclusion】 The effect of synchronization estrus in Jiaxian red Cattle treated with the "CIDR plus PG" method was better than another one; The imported (Canada) FSH and the domestic (Institute of Zoology, Chinese Academy of Sciences) FSH demonstrated similar effects on superovulation in Jiaxian red cattle.

Jiaxian Red Cattle; Synchronization Estrus; Superovulation

中國牛業(yè)科學(xué)2015，41(1)：50?54ChinaCattleScience科學(xué)試驗

2014-10-23

2014-12-23

農(nóng)業(yè)部畜禽牧草品種資源保護項目(農(nóng)財發(fā)【2007】43號)。

李志鋼(1982-)，男，漢族，畜牧師，在讀碩士，主要從事郟縣紅牛的保種及育種工作。

王新莊，男，博士，教授，從事獸醫(yī)產(chǎn)科學(xué)及胚胎工程研究。472261294@qq.com

S814.8

A

1001-9111(2015)01-0046-04