侯洪偉，潘崢，2，陳敏，徐佳佳，李衛(wèi)民，嵇振嶺，2

(1.東南大學(xué)醫(yī)學(xué)院，江蘇南京 210009； 2.東南大學(xué)附屬中大醫(yī)院普外科，江蘇南京 210009；3.東南大學(xué)附屬中大醫(yī)院病理科，江蘇南京 210009)

·論 著·

四氯化碳誘導(dǎo)兔肝纖維化模型的改良

侯洪偉1，潘崢1，2，陳敏1，徐佳佳3，李衛(wèi)民1，嵇振嶺1，2

(1.東南大學(xué)醫(yī)學(xué)院，江蘇南京 210009； 2.東南大學(xué)附屬中大醫(yī)院普外科，江蘇南京 210009；3.東南大學(xué)附屬中大醫(yī)院病理科，江蘇南京 210009)

目的：通過改良傳統(tǒng)四氯化碳(CCl4)法誘導(dǎo)兔肝纖維化模型，提高以肝纖維化模型為基礎(chǔ)的相關(guān)研究的實(shí)驗(yàn)效率及動(dòng)物模型質(zhì)量。方法：選取50只健康雄性新西蘭大白兔，每批25只。首批實(shí)驗(yàn)(傳統(tǒng)組)將動(dòng)物隨機(jī)分為兩組，造模組21只，皮下注射50% CCl4橄欖油溶液，每周兩次；對(duì)照組4只，相同方法皮下注射純橄欖油，注射12周，觀察記錄兔一般情況。造模組于0、4、8、12周行影像學(xué)及血清學(xué)生化指標(biāo)檢測(cè)，每次采血后隨機(jī)處死7只兔(兔意外死亡時(shí)按剩余數(shù)量均分計(jì))，測(cè)門靜脈壓(PVP)并取組織行HE、Masson、免疫組化染色及ISHAK評(píng)分；對(duì)照組12周后處死大白兔，其余處理同造模組。針對(duì)第1批實(shí)驗(yàn)中暴露的問題進(jìn)行改良，將改良方案應(yīng)用于第2批(改良組)實(shí)驗(yàn)。結(jié)果：傳統(tǒng)造模組及改良造模組動(dòng)物死亡率分別為42.9%和9.5%，造模成功率分別為57.1%和85.7%，兩組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。改良組兔體重、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶、天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶、白蛋白、總膽紅素與對(duì)照組相比隨實(shí)驗(yàn)進(jìn)行出現(xiàn)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的變化(P<0.05)；造模組12周時(shí)門靜脈血流速度較對(duì)照組減慢，螺旋CT掃描顯示造模組肝實(shí)質(zhì)密度較對(duì)照組降低，HE、Masson及免疫組化染色可見肝實(shí)質(zhì)發(fā)生明顯纖維化改變并可見假小葉形成，造模組4、8、12周時(shí)ISHAK評(píng)分分別為(1.33±0.52)、(1.83±0.75)、(4.17±0.75)分。結(jié)論：通過對(duì)CCl4誘導(dǎo)兔肝纖維化模型的傳統(tǒng)造模方案進(jìn)行針對(duì)性改良，可在保證造模成功率的基礎(chǔ)上降低動(dòng)物死亡率，為以動(dòng)物肝纖維化模型為基礎(chǔ)的實(shí)驗(yàn)研究打下良好基礎(chǔ)。

肝纖維化； 肝硬化； 兔； 動(dòng)物模型； 四氯化碳

肝纖維化是肝臟針對(duì)幾乎所有病因引起的慢性損傷的修復(fù)反應(yīng)，早期肝纖維化可以限制損傷因素的擴(kuò)散，對(duì)肝臟起到一定的保護(hù)作用；但在持續(xù)的病理因素刺激下肝纖維化持續(xù)發(fā)展，最終將導(dǎo)致其終末期改變——肝硬化的發(fā)生[1]。肝臟纖維化發(fā)展呈漸進(jìn)性，相關(guān)研究表明早期變化可逆轉(zhuǎn)[1-3]，但終末期肝硬化逆轉(zhuǎn)困難。因此，及時(shí)阻止纖維化的發(fā)展對(duì)于慢性肝臟疾病的治療極其重要，而肝纖維化動(dòng)物模型的建立是人類肝臟疾病研究的重要前提[4]。

目前大量的肝纖維化相關(guān)研究都基于鼠類模型[5-8]，但由于鼠類體積小、血量少、生命力較差的緣故不適于長(zhǎng)期的血清學(xué)、影像學(xué)及形態(tài)學(xué)研究，而兔可以很好地克服這些不足。本研究采用新西蘭大白兔作為模型載體，通過持續(xù)皮下注射四氯化碳(CCl4)溶液誘導(dǎo)兔肝纖維化模型，并對(duì)兔的一般情況、血清學(xué)、形態(tài)學(xué)及病理學(xué)等方面的特點(diǎn)進(jìn)行觀察研究，通過改進(jìn)傳統(tǒng)造模流程，在保證造模成功率的基礎(chǔ)上最大程度地降低動(dòng)物死亡率，為以肝纖維化為前提的實(shí)驗(yàn)研究提供較理想的造模方案。

1 材料與方法

1.1 試劑

CCl4(分析純)和橄欖油(南京化學(xué)試劑有限公司)取等量配成50%混合溶液，常溫密封保存?zhèn)溆?。平滑肌肌?dòng)蛋白(α-sma)一抗(英國(guó)Abcam)，Ⅰ型膠原蛋白(Col-Ⅰ)一抗(北京博奧森)，HRP-山羊抗小鼠二抗及HRP-山羊抗兔二抗(美國(guó)KPL)。

1.2 動(dòng)物

健康新西蘭大白兔50只，雄性，體質(zhì)量2.20～2.78 kg，4月齡，由江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院種兔場(chǎng)提供，全部通過檢驗(yàn)檢疫，飼養(yǎng)于東南大學(xué)醫(yī)學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，提供兔專用飼料，自來水飲水，自然生長(zhǎng)1周，1周后進(jìn)行分組實(shí)驗(yàn)。

1.3 肝纖維化模型建立

1.3.1傳統(tǒng)組方案 傳統(tǒng)組造模注射劑量及頻次在參照相關(guān)文獻(xiàn)描述[5-6,9]的基礎(chǔ)上，決定采取50%濃度、1 ml·kg-1、每周兩次皮下注射方式，連續(xù)注射12周。

1.3.2改良組方案 (1) 注射劑量：初始劑量降至0.5 ml·kg-1，濃度不變；(2) 由單點(diǎn)注射改為多點(diǎn)皮下注射，一次劑量同一日內(nèi)分兩次注射，間隔不小于8 h；(3) 根據(jù)動(dòng)物一般狀態(tài)調(diào)整注射劑量，良好者可按0.5 ml·kg-1遞增，上限3 ml·kg-1，若動(dòng)物出現(xiàn)拒食、活動(dòng)減少等中毒現(xiàn)象，酌情減少用量或停注1～2次；(4) 采用動(dòng)物來源地相同飼料，實(shí)驗(yàn)開始時(shí)間選在較為溫暖的4月。

1.4 血生化檢查

于0、4、8、12周末經(jīng)兔耳中央動(dòng)脈采血。生化檢查項(xiàng)目包括丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)、天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶(AST)、總膽紅素(TBil)、白蛋白(ALB)、總蛋白(TP)、前白蛋白(PALB)、堿性磷酸酶(ALP)。

1.5 影像學(xué)檢查

進(jìn)行相關(guān)檢查前動(dòng)物禁食12 h，禁水6 h，耳緣靜脈推注1%戊巴比妥4 ml·kg-1麻醉，行常規(guī)腹部CT檢查及彩色多普勒超聲檢查。

1.6 組織染色及病理分級(jí)

造模組于4、8、12周末分別用過量麻醉法處死7只兔(兔意外死亡時(shí)按剩余數(shù)均分計(jì)算)，觀察肝臟外觀變化情況，行HE、Masson及免疫組化(α-sma及Col-Ⅰ)染色，鏡下觀察肝組織變化情況，并采用ISHAK標(biāo)準(zhǔn)[10]進(jìn)行組織學(xué)評(píng)分。

1.7 門靜脈壓(PVP)測(cè)量

經(jīng)腸系膜上靜脈分支穿刺插管至門靜脈，水柱測(cè)壓計(jì)測(cè)量PVP[11]。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

應(yīng)用SPSS 19.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，血清生化指標(biāo)采用單因素方差分析進(jìn)行比較，死亡率采用Fisher精確概率法比較，體重?cái)?shù)據(jù)組內(nèi)比較采用單因素方差分析，組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，P<0.05差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

因傳統(tǒng)組死亡率高無法統(tǒng)計(jì)，以下獨(dú)立數(shù)據(jù)均取自改良組。

2.1 造模方案改良前后成功率及死亡率比較

傳統(tǒng)組造模兔21只，非正常死亡9只，死亡率42.9%；改良組造模兔21只，非正常死亡2只，死亡率9.5%，12周時(shí)傳統(tǒng)組及改良組分別有12只及18只兔成功達(dá)到了早期肝硬化狀態(tài)(ISHAK≥4分)，成功率分別為57.1%和85.7%；兩組中動(dòng)物主要死亡原因?yàn)榫苁尘茱嫞?周內(nèi)是死亡高峰期(圖1)。

2.2 一般情況

對(duì)照組兔機(jī)警性高，對(duì)外界聲光刺激反應(yīng)迅速，活動(dòng)較頻繁，食欲好，進(jìn)食量較大，體重增長(zhǎng)迅速，毛發(fā)濃密有光澤；造模組兔隨注射時(shí)間增加，對(duì)外界刺激反應(yīng)逐漸遲緩，活動(dòng)減少，進(jìn)食水量減少，毛發(fā)蓬亂無光澤，少數(shù)毛發(fā)脫落較嚴(yán)重；藥物注射后4周內(nèi)時(shí)間段動(dòng)物藥物不良反應(yīng)明顯，出現(xiàn)體重下降及拒食現(xiàn)象，甚至出現(xiàn)急性中毒死亡。對(duì)照組兔體重隨時(shí)間呈遞增趨勢(shì)，且8、12周與0周比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);造模組兔體重未見明顯改變；0周時(shí)兩組兔體重間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，4、8、12周時(shí)對(duì)照組兔體重明顯高于造模組(P<0.05)(圖2)。

aP<0.05

圖1 12周時(shí)傳統(tǒng)組與改良組兔死亡率及造模成功率比較

Fig 1 Comparison of mortality of rabbits and success rate of modeling between traditional patch and modified patch at 12th week

a 組內(nèi)不同時(shí)間點(diǎn)兔體重與0周比較,P<0.05; b 同一時(shí)間點(diǎn)兔體重組間比較,P<0.05

圖2 改良造模組與對(duì)照組兔體重隨時(shí)間變化情況

Fig 2 Comparison of changes of weights in rabbits in modeling group of modified patch and control group

2.3 血清生化檢查結(jié)果

注射CCl44周后ALT、AST較0周明顯增高，并維持于較高狀態(tài)；ALB呈降低趨勢(shì)，12周與0周比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；TBil呈波動(dòng)性變化，其中4周時(shí)升高明顯;其余指標(biāo)各時(shí)間點(diǎn)未見明顯變化(表1)。

2.4 影像學(xué)檢查結(jié)果

彩色多普勒超聲(圖3a、b)示：a為對(duì)照組肝臟圖像，b為造模組12周時(shí)肝臟圖像，兩者肝實(shí)質(zhì)回聲比較未見明顯變化，但造模組兔門靜脈血流速度(12.8 cm·s-1)較對(duì)照組(23.0 cm·s-1)明顯減慢；CT(圖3c、d)示：c、d分別為對(duì)照組及造模組12周時(shí)兔肝臟斷面圖像，其中d圖像肝臟斷面平均CT值54 HU，明顯低于對(duì)照組94 HU，肝臟密度降低，提示造模組在形成肝纖維化的同時(shí)可能伴有不同程度的肝脂肪變性。

2.5 PVP變化

整個(gè)試驗(yàn)過程中動(dòng)物PVP呈進(jìn)行性升高趨勢(shì)，但變化差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

不同時(shí)間點(diǎn)數(shù)據(jù)與0周時(shí)比較：aP<0.01; bP<0.05

圖3 改良后對(duì)照組(a、b)與造模組(c、d)12周時(shí)兔彩色多普勒及CT檢查結(jié)果

Fig 3 Color Doppler flow imaging and CT scan of rabbits of control group and modeling group in modified group

2.6 組織外觀、病理學(xué)檢查及ISHAK分期

0周時(shí)：肝臟色澤紅潤(rùn)，表面光滑，質(zhì)地柔軟，HE及Masson染色可見肝細(xì)胞索排列整齊，無明顯炎細(xì)胞浸潤(rùn)，肝小葉結(jié)構(gòu)清晰，肝血竇以中央靜脈為中心呈放射狀排列，肝實(shí)質(zhì)免疫組化未見明顯Col-Ⅰ及α-sma異常表達(dá)；12周時(shí)：造模組兔肝臟外觀呈淺棕色，表面凹凸不平，有小結(jié)節(jié)樣改變，質(zhì)地硬，HE染色可見部分肝細(xì)胞空泡樣脂肪變性，正常肝小葉結(jié)構(gòu)破壞伴纖維間隔形成，肝細(xì)胞索排列紊亂，伴炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，可見部分假小葉形成；Masson染色可見匯管區(qū)膠原纖維明顯增生，形成纖維間隔，包繞、分割正常肝組織，假小葉形成；免疫組化可見匯管區(qū)及纖維間隔中Col-Ⅰ及α-sma表達(dá)明顯升高(圖4)。造模組4、8、12周時(shí)ISHAK評(píng)分分別為(1.33±0.52)、(1.83±0.75)、(4.17±0.75)分，提示隨著造模時(shí)間延長(zhǎng)，肝纖維化程度呈遞增改變。

A、B、C、D分別代表肝臟組織HE染色、Masson染色、免疫組化標(biāo)記Col-Ⅰ及α-sma鏡下表現(xiàn)； 1、2分別代表0周和12周

圖4 改良后造模組0周與12周時(shí)兔肝臟組織病理學(xué)變化比較 ×100倍光鏡

Fig 4 Histopathologic comparison between 0 and 12 weeks of modeling group in modified patch(Magnification:×100)

3 討 論

目前對(duì)于肝纖維化機(jī)制的理解很大程度上依賴于對(duì)動(dòng)物模型的研究。良好的動(dòng)物模型應(yīng)該能夠模擬人類疾病的形態(tài)學(xué)、組織學(xué)的漸進(jìn)性變化，并且具有較好的可重復(fù)性及低死亡率，能夠產(chǎn)生可逆及不可逆性的病理生理學(xué)結(jié)局[12]。將動(dòng)物種屬及造模方法合理搭配形成最優(yōu)化的造模方案，是保證各項(xiàng)相關(guān)研究順利進(jìn)行的基礎(chǔ)。

在肝纖維化模型制作方面，國(guó)內(nèi)外相關(guān)研究主要討論的問題包括動(dòng)物的選擇、造模方式及與研究?jī)?nèi)容的相關(guān)性等。George等[13]通過腹腔注射DMN法成功制作出了小鼠肝硬化模型，指出DMN法制作小鼠肝纖維化模型可為人類肝硬化的研究提供可重復(fù)及有價(jià)值的動(dòng)物模型平臺(tái)，但其實(shí)驗(yàn)動(dòng)物14 d 25%及21 d 42%的高死亡率阻礙了后續(xù)研究的實(shí)施。Chang等[14]將肝毒性藥物法與結(jié)扎膽總管法制作鼠類肝硬化模型相比較，指出結(jié)扎膽總管法造模時(shí)間短，但同樣面臨動(dòng)物死亡率高的問題，適用于短期研究；CCl4法造模的時(shí)間及動(dòng)物死亡率與藥物劑量及注射方式有關(guān)，可用于急慢性肝纖維化研究。Ding等[4]通過皮下注射CCl4在16周時(shí)誘導(dǎo)出猴肝硬化模型，成功率75%，他指出由于生理相似性，靈長(zhǎng)類動(dòng)物更適用于人類相關(guān)疾病研究的動(dòng)物模型。陳剛等[15]通過皮下注射CCl4法成功誘導(dǎo)大鼠肝纖維化模型，但仍有20%的較高動(dòng)物死亡率。

CCl4具有選擇性的肝臟毒性，長(zhǎng)期注射可誘導(dǎo)肝纖維化，其引起肝細(xì)胞損害的重要原因是CCl4導(dǎo)致膜脂質(zhì)過氧化或與蛋白質(zhì)的巰基反應(yīng)[12]。大量研究[3,16-17]表明，HSC表型改變導(dǎo)致了纖維化過程中ECM的過度沉積；同時(shí)膠原蛋白酶合成減少[18]及基質(zhì)金屬蛋白酶組織抑制物(tissue inhibitor of metalloproteinases，TIMPs)表達(dá)失調(diào)導(dǎo)致ECM的分解減少也是肝纖維化發(fā)展的重要原因。由于具有多種給藥途徑、可重復(fù)、組織學(xué)變化相對(duì)連續(xù)等優(yōu)點(diǎn)，CCl4可作為肝纖維化模型較為理想的誘導(dǎo)劑。

血清生化指標(biāo)是檢測(cè)肝臟損傷程度的重要手段：ALT血液中濃度升高與肝細(xì)胞損傷、肝細(xì)胞膜通透性增高有關(guān)，AST反映肝細(xì)胞內(nèi)線粒體損傷程度，ALB是反映肝臟整體合成功能的重要指標(biāo)。在纖維化的肝組織中Col-Ⅰ由肌成纖維細(xì)胞大量分泌，主要存在于富含肌成纖維細(xì)胞的纖維隔膜的中心部分[19]，α-SMA是肝星狀細(xì)胞的活化標(biāo)志，這兩種蛋白表達(dá)水平與肝纖維化程度密切相關(guān)。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明，CCl4皮下注射能夠成功誘導(dǎo)兔肝纖維化模型，同時(shí)較其他造模方法具有簡(jiǎn)便、經(jīng)濟(jì)、可重復(fù)且造模成功率高等優(yōu)點(diǎn)。血清生化指標(biāo)方面，AST、ALT明顯升高，并在造模過程中維持于較高水平，提示CCl4對(duì)肝細(xì)胞具有相對(duì)特異的毒性作用，持續(xù)的肝臟損傷進(jìn)一步破壞了肝臟合成功能，導(dǎo)致ALB合成減少，但肝臟儲(chǔ)備功能仍保持相對(duì)穩(wěn)定水平，所以PALB、TP等未見明顯降低；肝臟形態(tài)學(xué)方面，多普勒血管超聲顯示實(shí)驗(yàn)組門靜脈血流速度較對(duì)照組明顯減慢，提示肝臟血流阻力增大；12周時(shí)實(shí)驗(yàn)組兔肝臟HE及Masson染色均可見明顯肝細(xì)胞壞死及空泡樣脂肪變性，伴橋接樣纖維間隔形成，部分假小葉形成，考慮在肝纖維化形成同時(shí)CCl4破壞細(xì)胞線粒體及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜穩(wěn)定性，肝細(xì)胞能量代謝障礙影響脂蛋白合成及脂質(zhì)排出，導(dǎo)致肝細(xì)胞脂肪變性；免疫組化結(jié)果顯示實(shí)驗(yàn)組12周時(shí)α-sma及Col-Ⅰ表達(dá)明顯增強(qiáng)，且以纖維間隔及匯管區(qū)部分尤為明顯，提示HSC大量活化成為具有促纖維化功能的肌成纖維樣細(xì)胞表型，極大促進(jìn)了肝纖維化的發(fā)展。螺旋CT掃描可見肝臟實(shí)質(zhì)密度降低，結(jié)合組織病理結(jié)果提示肝臟在纖維化的同時(shí)發(fā)生了脂肪變性，這也是CCl4法誘導(dǎo)兔肝纖維化模型的弊端之一。CCl4為劇毒藥物，劑量控制不當(dāng)可導(dǎo)致動(dòng)物產(chǎn)生嚴(yán)重不良反應(yīng)，因此傳統(tǒng)造模組動(dòng)物死亡率高，我們?cè)诳偨Y(jié)傳統(tǒng)造模組經(jīng)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，從低劑量開始給予動(dòng)物一定的適應(yīng)期，同時(shí)根據(jù)不同動(dòng)物對(duì)藥物反應(yīng)適時(shí)調(diào)整CCl4用量，可以顯著降低動(dòng)物嚴(yán)重不良反應(yīng)的發(fā)生率，且8周以后雖然所有動(dòng)物的注射劑量均提升至1 ml·kg-1以上，仍未見明顯的藥物過量反應(yīng)。根據(jù)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的狀態(tài)調(diào)整CCl4的注射劑量，雖然可能會(huì)導(dǎo)致動(dòng)物肝纖維化程度的不均一，但是這種劑量調(diào)節(jié)方式主要著眼于降低動(dòng)物死亡率，一旦度過早期的適應(yīng)階段后動(dòng)物對(duì)藥物產(chǎn)生耐受，這時(shí)再根據(jù)實(shí)驗(yàn)要求來調(diào)整劑量便可以誘導(dǎo)出成功率高且符合實(shí)驗(yàn)要求的動(dòng)物肝纖維化模型。

同時(shí)本實(shí)驗(yàn)中也暴露出一些問題，CCl4植物油溶液誘導(dǎo)肝纖維化常合并一定程度的脂肪變性，考慮與CCl4作用機(jī)制及劑量濃度有關(guān)；CCl4誘導(dǎo)早期肝纖維化存在自發(fā)逆轉(zhuǎn)現(xiàn)象，一方面可通過改變?cè)炷r(shí)間滿足不同的實(shí)驗(yàn)需求，但另一方面也使造模的不穩(wěn)定性增加。

綜上所述，本研究利用CCl4法成功誘導(dǎo)兔肝纖維化模型，并且通過對(duì)傳統(tǒng)造模方案進(jìn)行分階段、多步驟、個(gè)體化的改良，在保證造模成功率的基礎(chǔ)上最大程度地降低了動(dòng)物死亡率，為以肝纖維化為基礎(chǔ)的相關(guān)研究工作提供了可靠的動(dòng)物模型誘導(dǎo)方案。

[1] ELLIS E L,MANN D A.Clinical evidence for the regression of liver fibrosis [J].Journal of Hepatology,2012,56(5):1171-1180.

[2] CASADO J L,QUEREDA C,MORENO A,et al.Regression of liver fibrosis is progressive after sustained virological response to HCV therapy in patients with hepatitis C and HIV coinfection [J].Journal of Viral Hepatitis,2013,20(12):829-837.

[3] KONG D,ZHANG F,ZHANG Z,et al.Clearance of activated stellate cells for hepatic fibrosis regression:molecular basis and translational potential [J].Biomedicine & Pharmacotherapy,2013,67(3):246-250.

[4] DING K,LIU M R,LI J,et al.Establishment of a liver fibrosis model in cynomolgus monkeys [J].Experimental and Toxicologic Pathology,2014,66(5-6):257-261.

[5] WU J,NORTON P A.Animal models of liver fibrosis[J].Scand J Gastroenterol,1996,31(12):1137-1143.

[6] JIANG Y,KANG Y J.Metallothionein gene therapy for chemical-induced liver fibrosis in mice[J].Molecular Therapy:the Journal of the American Society of Gene Therapy,2004,10(6):1130-1139.

[7] JIANG Y,LIU J,WAALKES M,et al.Changes in the gene expression associated with carbon tetrachloride-induced liver fibrosis persist after cessation of dosing in mice[J].Toxicological Sciences,2004,79(2):404-410.

[8] FORT J,PILETTE C,VEAL N,et al.Effects of long-term administration of interferon alpha in two models of liver fibrosis in rats [J].Journal of Hepatology,1998,29(2):263-270.

[9] AHMED S K,MOHAMMED S A,KHALAF G,et al.Role of bone marrow mesenchymal stem cells in the treatment of CCL4 Induced liver fibrosis in albino rats:a histological and immunohistochemical study[J].International Journal of Stem Cells,2014,7(2):87-97.

[10] BRUNT E M.Grading and staging the histopathological lesions of chronic hepatitis:the Knodell histology activity index and beyond[J].Hepatology,2000,31(1):241-246.

[11] 潘崢,吳性江,李為蘇,等.犬肝硬化模型形成中肝功能性血流量的變化[J].中華實(shí)驗(yàn)外科雜志,2005,22(11):1405.

[12] BRANDAO C,FERREIRA H,PIOVESANA H,et al.Development of an experimental model of liver cirrhosis in rabbits[J].Clinical & Experimental Pharmacology & Physiology,2000,27:987-990.

[13] GEORGE J,RAO K R,STERN R,et al.Dimethylnitrosamine-induced liver injury in rats:the early deposition of collagen [J].Toxicology,2001,156(2-3):129-138.

[14] CHANG M L,YEH C T,CHANG P Y,et al.Comparison of murine cirrhosis models induced by hepatotoxin administration and common bile duct ligation[J].World Journal of Gastroenterology:WJG,2005,11(27):4167-4172.

[15] 陳剛,李宏波,邱少敏.CCl4皮下注射制備大鼠肝纖維化模型的研究[J].現(xiàn)代醫(yī)學(xué),2010,38(3):225-229.

[16] BEDOSSA P,PARADIS V.Liver extracellular matrix in health and disease[J].The Journal of Pathology,2003,200(4):504-515.

[17] ATZORI L,POLI G,PERRA A.Hepatic stellate cell:a star cell in the liver[J].The International Journal of Biochemistry & Cell Biology,2009,41(8-9):1639-1642.

[18] MONTFORT I,PEREZ-TAMAYO R.Collagenase in experimental carbon tetrachloride cirrhosis of the liver[J].The American Journal of Pathology,1978,92(2):411-420.

[19] POONKHUM R,SHOWPITTAPORNCHAI U,PRADIDARCHEEP W.Collagen arrangement in space of Disse correlates with fluid flow in normal and cirrhotic rat livers[J].Microscopy Research & Technique,2014，78(2):187-193.

Modification of liver fibrosis model of rabbit induced by carbon tetrachloride

HOU Hong-wei1，PAN Zheng1，2，CHEN Min1，XU Jia-jia3，LI Wei-min1，JI Zhen-ling1，2

(1.SchoolofMedicine，SoutheastUniversity，Nanjing210009，China; 2.DepartmentofGeneralSurgery，ZhongdaHospital,SoutheastUniversity，Nanjing210009，China; 3.DepartmentofPathology，ZhongdaHospital,SoutheastUniversity，Nanjing210009，China)

Objective: To increase experimental efficiency and animal model’s quality of fundamental research which based on liver fibrosis model of animal by modify the traditional process of carbon tetrachloride(CCl4) induced liver fibrosis of rabbit. Methods: 50 healthy male new Zealand rabbits were included in this research and divided into 2 batches on average. Rabbits in first batch(traditional batch) were separated into 2 groups: modeling group(n=21) and control group(n=4). Rabbits in modeling group were injected with 50% CCl4olive oil solution subcutaneously twice a week for 12 weeks in succession while control group were treated with the same amount of pure olive oil. Rabbits in modeling group received color Doppler ultrasound， spiral computed tomography and serum biochemical examination every 4 weeks from the beginning to 12 weeks， 7 rabbits(remanent were divided equally when rabbits died unexpected ) were sacrificed after blood drawing every 4 weeks to measure portal venous pressure(PVP) and obtained liver tissues for biopsy and immunohistochemical(IHC) staining as well as staging according the ISHAK grading system; Control group were treated with the same way with modeling group and sacrificed at 12 weeks. Modify disadvantages exposed during experiment of first batch and apply revised scheme to the second batch(modified batch). Results: Mortality of traditional patch was 42.9% and significantly higher than modified batch of 9.5%(P<0.05) and the success rate of traditional patch(57.1%) was obviously lower than that of modified batch(85.7%)，too. With progression of modeling process，ALT， AST， ALB， TP of modeling group underwent significant changes compare to control group(P<0.05); color doppler flow imaging showed the speed of portal venous blood flow of modeling group was obviously slower and CT values were significantly reduced comparing to control group; HE， Masson and IHC staining showed explicit liver fibrosis and pseudolobule could be seen， ISHAK score rised over time(1.33±0.52，1.83±0.75，4.17±0.75 of modified modeling group at 4，8，12 week respectively). Conclusion: Continuous injection of CCl4 can induce explicit liver fibrosis of rabbit. By adjust modeling process of modeling process we can reduce mortality of animals drastically and guarantee the success rate at the same time and provide useful information for research based on liver fibrosis animal models.

liver fibrosis; liver cirrhosis; rabbits; animal models; carbon tetrachloride

2015-02-09

2015-03-19

江蘇省科研基金資助項(xiàng)目(H201230)

侯洪偉(1989-)，男，江蘇連云港人，在讀碩士研究生。E-mail:767714726@qq.com

嵇振嶺 E-mail:zlji@me.com

侯洪偉,潘崢,陳敏,等.四氯化碳誘導(dǎo)兔肝纖維化模型的改良[J].東南大學(xué)學(xué)報(bào):醫(yī)學(xué)版,2015,34(4):562-567.

R575.2; R-332

A

1671-6264(2015)04-0562-06

10.3969/j.issn.1671-6264.2015.04．014