文繼月，孟多佳，封曄，田賽，時成波，孟繼鴻

(1.東南大學(xué) 醫(yī)學(xué)院，江蘇 南京 210009； 2.長春生物制品研究所有限責(zé)任公司，吉林 長春 130062)

·論 著·

建立雙抗體夾心法ELISA定量檢測戊型肝炎p179疫苗

文繼月1，孟多佳2，封曄1，田賽1，時成波2，孟繼鴻1

(1.東南大學(xué) 醫(yī)學(xué)院，江蘇 南京 210009； 2.長春生物制品研究所有限責(zé)任公司，吉林 長春 130062)

目的:建立雙抗體夾心法ELISA檢測HEV抗原，用于定量檢測戊型肝炎p179疫苗生產(chǎn)過程中初制品、半成品和疫苗成品。方法：將單克隆抗體3G1、5G5、1G10、3A10和4E9分別進(jìn)行辣根過氧化物酶標(biāo)記，通過競爭ELISA檢測確定最佳抗體配對用于建立雙抗體夾心法ELISA，對p179生產(chǎn)過程中所得制品進(jìn)行抗原定量檢測。結(jié)果：5種單克隆抗體可以分成兩組，分別針對p179疫苗抗原上的兩種不同抗原表位，選擇3G1為包被抗體、4E9為酶標(biāo)抗體建立的雙抗體夾心法ELISA具有良好的敏感性和特異性，對p179抗原檢測的最低濃度可至15.6 ng·ml-1。該方法能夠有效檢測p179疫苗生產(chǎn)過程中的初制品、半成品和疫苗成品的抗原含量，反映抗原純化各步驟的得率。結(jié)論:建立的雙抗體夾心法ELISA可作為p179疫苗生產(chǎn)過程中的抗原檢測方法，這有助于定量檢測p179疫苗生產(chǎn)過程中的抗原成分。

戊型肝炎病毒； 疫苗； 重組蛋白； 單克隆抗體； 雙抗體夾心法酶聯(lián)免疫吸附試驗

Quantitative detection of the hepatitis E p179 vaccine with a double antibody sandwich eLISA

戊型肝炎(hepatitis E，HE)是由戊型肝炎病毒(hepatitis E virus，HEV)引起的、主要經(jīng)消化道傳播的一種病毒性肝炎，呈全球分布，常因水源污染而發(fā)生大流行[1]，病死率高，在孕婦[2]中可達(dá)20%以上[3]。近年發(fā)現(xiàn)在器官移植受體中可發(fā)生類似乙型肝炎和丙型肝炎的慢性HEV感染[4-5]。為了有效控制和預(yù)防HE，加強(qiáng)對HE疫苗的研究勢在必行。HEV可分為1、2、3、4共4個基因型，我國流行的是第4基因型，不同基因型之間的抗原性有一定的差異[6]。Meng等[7]將HEV中和抗原表位定位于ORF2 C端編碼的452-617位氨基酸之間(166個氨基酸)，并分別制備了不同基因型p166的單克隆抗體(McAb)。在p166重組蛋白的研究基礎(chǔ)上利用大腸桿菌可溶性表達(dá)了含有中和抗原表位的HEV重組蛋白p179(aa452-630)，p179作為HE疫苗已獲SFDA批準(zhǔn)開展臨床試驗。

在HE疫苗生產(chǎn)、檢定、存儲過程中疫苗抗原的檢測是必不可少的，特別是在疫苗純化過程中的粗制品中尚含有大量的雜蛋白，無法用蛋白定量的方法檢測，需要一種簡單有效的免疫學(xué)檢測手段。為此我們將多個來源于p166的McAbs進(jìn)行辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記，篩選合適的配對抗體，建立雙抗體夾心法ELISA，用于HE p179疫苗生產(chǎn)過程中初制品、半成品和疫苗成品的抗原檢測和檢定。

1 材料與方法

1.1 抗原和單克隆抗體

1.1.1抗原制備 將HEV緬甸株(M73218)、墨西哥株(M74506)、美國株(AF035437)、中國株(AJ272108)編碼ORF2 p166(aa 452-617)的基因片段以及HEV緬甸株和中國株編碼ORF2 p146(aa460-605)的基因片段插入PET28a載體(Pharmacia產(chǎn)品)構(gòu)建重組質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109菌株(Promega產(chǎn)品)，表達(dá)6His-ORF2融合蛋白，經(jīng)鎳柱(Pharmacia產(chǎn)品)純化的融合蛋白分別命名為p166Bur、p166Mex、p166Us、p166Chn、p146Bur、p146Chn，由東南大學(xué)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗室保存。p179疫苗生產(chǎn)過程中的初制品、半成品及成品由長春生物制品研究所有限責(zé)任公司提供。

1.1.2單克隆抗體制備 以HEV第1基因型巴基斯坦株HEV ORF2基因編碼蛋白C端452-617aa重組蛋白(p166Sar)為免疫原，常規(guī)方法制備鼠源McAb，獲得特異性McAb 3G1;以HEV第4基因型中國株p166蛋白(p166Chn)為免疫原，獲得特異性鼠源McAb 5G5、1G10，以上McAbs由東南大學(xué)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗室保存。以HEV第4基因型中國株ORF2基因編碼蛋白C端439-617aa(HE疫苗p179)為免疫原，獲得特異性鼠源McAbs 3A10、4E9，由長春生物制品研究所有限責(zé)任公司提供。

1.1.3單克隆抗體的純化 應(yīng)用親和層析法純化各單克隆抗體，SDS-PAGE分析抗體純度，Lowry法測定蛋白含量。

1.1.4HRP標(biāo)記抗HEV單克隆抗體 采用改良的過碘酸鈉法[8]將HRP(KPL公司)標(biāo)記單克隆抗體3G1、1G10、5G5、4E9、3A10。

1.2 單克隆抗體競爭抑制試驗

將p179作為包被抗原，利用直接法ELISA和方陣滴定確定包被抗原、McAbs和酶標(biāo)McAbs的最佳稀釋濃度，使得競爭抑制試驗中參比對照孔的OD450/630值接近1.0，處于線性變化的敏感范圍。試驗條件確定后取最佳稀釋濃度的p179包被ELISA板，分為5個實(shí)驗組，每組每孔分別加入由1% casein PBS稀釋的5株單抗，100 μl·孔-1，另外設(shè)對照組，每孔加入100 μl的1% casein PBS作為對照，37 ℃孵育45 min，吸棄液體后每組每孔分別加入5株HRP標(biāo)記單抗，37 ℃孵育45 min，PBST洗滌5次后加入顯色劑，37 ℃溫育10 min，2 mol·L-1硫酸50 μl終止反應(yīng)。于酶標(biāo)儀讀取OD450/630的值，計算抑制率(抑制率=1-抑制孔OD值/對照孔OD值)，抑制率大于50%判斷為抑制試驗陽性，表明2種McAbs針對的抗原表位相同或相關(guān)；反之，則2種McAbs針對的抗原表位不同或無關(guān)。

1.3 雙抗體夾心法ELISA的建立

親和層析法純化的單克隆抗體3G1、1G10、5G5、4E9、3A10按已確定的最佳稀釋濃度分別溶解于0.05 mol·L-1碳酸包被緩沖液(pH 9.6)中，100 μl·孔-1包被96孔聚乙烯微量滴定板，37 ℃吸附2 h，PBST洗液洗滌2遍，每孔中分別加入等系列稀釋的p179抗原(1 mg·ml-1開始倍比稀釋)。37 ℃溫育45 min；洗滌5次，扣干，每孔分別加入最佳稀釋濃度各酶標(biāo)單克隆抗體3G1、1G10、5G5、4E9、3A10，37 ℃溫育45 min；洗滌5次，扣干，加入顯色劑，37 ℃溫育10 min后加終止液50 μl(2 mol·L-1H2SO4)終止，于酶標(biāo)儀上讀取OD450/630的值。

1.4 雙抗體夾心法ELISA的方法驗證

1.4.1特異性驗證 用所建立的雙抗體夾心法ELISA檢測凍干甲型肝炎減毒活疫苗、乙型肝炎病毒表面抗原重組疫苗驗證該方法的特異性。

1.4.2靈敏度驗證 以所建立的雙抗體夾心法ELISA檢測4種基因型p166、基因1型和4型p146(aa460-605)以及p179疫苗(aa439-617)，驗證該方法的靈敏度。

1.5 雙抗體夾心法ELISA檢測p179疫苗純化過程中各步驟的得率

純化3G1以0.05 mol·L-1碳酸包被緩沖液(pH 9.6)稀釋后包被96孔聚乙烯微量滴定板，37 ℃吸附2 h，PBST洗液洗滌2遍，將p179純化過程各步驟樣品以1% casien PBS倍比稀釋，1 mg·ml-1的p179原液同樣稀釋作對照，100 μl·孔-1，37 ℃溫育45 min，PBST洗板5次，扣干，每孔加1% casein PBS稀釋的工作濃度的HRP標(biāo)記的4E9，37 ℃溫育45 min，PBST洗板5次，扣干。加入顯色劑，37 ℃溫育10 min后加終止液終止，于酶標(biāo)儀上讀取OD450/630的值，與已知濃度的p179原液各稀釋度的OD值作對比，計算各樣品中的蛋白含量和純化過程中各步驟的得率。

1.6 雙抗體夾心法ELISA檢測p179疫苗成品

純化3G1以0.05 mol·L-1碳酸包被緩沖液(pH 9.6)稀釋后包被96孔聚乙烯微量滴定板，37 ℃吸附2 h，PBST洗液洗滌2遍，將各p179疫苗(20、30、40 μg·ml-1)以1% casien PBS倍比稀釋，100 μl·孔-1，37 ℃溫育45 min，PBST洗板5次，扣干，每孔加1% casein PBS稀釋的工作濃度的HRP標(biāo)記的4E9，37 ℃溫育45 min，PBST洗板5次，扣干。加入顯色劑，37 ℃溫育10 min后加終止液終止，于酶標(biāo)儀上讀取OD450/630的值。

2 結(jié) 果

2.1 單克隆抗體之間的競爭抑制作用

以p179抗原包被微孔板，將5種McAbs進(jìn)行互相的競爭抑制試驗，結(jié)果見表1。競爭抑制ELISA的結(jié)果基本可以分為兩種類型，一種是McAbs之間能夠相互競爭，如McAbs 1G10與3G1、1G10與5G5、3G1與5G5；另一種結(jié)果是McAbs之間不能相互競爭，如1G10與4E9、1G10與3A10、3G1與4E9、3G1與3A10、5G5與4E9、5G5與3A10。這些結(jié)果說明在p179抗原上至少存在兩種抗原表位。

2.2 雙抗體夾心法ELISA的建立

經(jīng)正交法優(yōu)化單克隆抗體包被濃度和抗原、酶標(biāo)抗體使用濃度以及反應(yīng)條件后，將5株McAbs和相應(yīng)的酶標(biāo)McAbs進(jìn)行分別組合(能相互競爭者除外)，建立雙抗體夾心法ELISA，對系列稀釋的p179(1 mg·ml-1從1∶20 000開始倍比稀釋)進(jìn)行檢測，結(jié)果如表2所示。以3G1和HRP-4E9為基礎(chǔ)建立的雙抗體夾心法ELISA對系列稀釋的p179所檢出的OD平均值最高，從而建立了以3G1和HRP-4E9為基礎(chǔ)的HEV重組抗原p179的雙抗體夾心法ELISA。

表1 不同單克隆抗體之間的競爭抑制作用

Tab 1 Inhibitory effect of competition between different McAbs

2.3 雙抗體夾心法ELISA的靈敏度和特異性

由3G1和HRP-4E9建立的雙抗體夾心法ELISA經(jīng)正交法優(yōu)化反應(yīng)條件后，對倍比稀釋后的4種基因型p166(p166Bur、p166Mex、p166Us、p166Chn)、p146w01、p146Chn、p179疫苗進(jìn)行檢測，結(jié)果7種抗原均能檢測，OD值隨抗原稀釋度升高而逐漸下降，其對p179的檢出最低濃度可至15.6 ng·ml-1。表明該方法具有良好的靈敏度，見圖1A；而凍干甲型肝炎減毒活疫苗、乙型肝炎病毒表面抗原重組疫苗檢測結(jié)果的OD值均在0.1以下，表明該方法特異性較高，見圖1B。

表2 雙抗體夾心法ELISA對p179的檢測結(jié)果

Tab 2 The detection of p179 by double antibody sandwich ELISA

圖1 雙抗體夾心法ELISA靈敏度(A)和特異性(B)

Fig 1 The sensitivity(A)and specificity(B)of double antibody sandwich ELISA

2.4 雙抗體夾心法ELISA檢測p179疫苗純化過程中的抗原回收率

雙抗體夾心法ELISA對p179疫苗純化工藝中各純化過程中洗脫液進(jìn)行檢測，將已知濃度的p179原液系列稀釋作為陽性對照，根據(jù)每組OD值的平均值對各洗脫液的蛋白含量及各純化方式的回收率進(jìn)行估算，并與SDS-PAGE蛋白定量法所計算的蛋白回收率作對比，結(jié)果如表3所示。p179純化過程中的各洗脫液均能檢出，通過與已知濃度的p179原液的各稀釋度所對應(yīng)的OD值對比并計算蛋白質(zhì)的回收率，與SDS-PAGE蛋白質(zhì)定量所得蛋白回收率數(shù)據(jù)非常接近。

表3 雙抗體夾心法ELISA對p179純化洗脫液的檢測結(jié)果(OD值)

Tab 3 The detcetion of elution liquids during purified process of p179 by double antibody sandwich ELISA(OD)

2.5 雙抗體夾心法ELISA檢測不同濃度的p179鋁吸附疫苗

雙抗體夾心法ELISA分別多次檢測20、30、40 μg·ml-1的p179鋁吸附疫苗成品解離后抗原含量，結(jié)果如表4所示，各濃度的p179疫苗均能與單抗反應(yīng)，隨p179疫苗濃度的下降OD值亦逐漸降低，可以體現(xiàn)p179疫苗之間的濃度差異。

表4 雙抗體夾心法ELISA p179鋁制劑疫苗的檢測結(jié)果(OD值)

Tab 4 The detection of p179 vaccine by double antibody sandwich ELISA(OD)

3 討 論

目前已有3種HE疫苗進(jìn)入臨床試驗階段或已上市：Purcell等[9]利用桿狀病毒表達(dá)HEV ORF2片段編碼的56 kD的重組蛋白；我國廈門大學(xué)利用大腸桿菌以包涵體形式表達(dá)HEV 1型ORF2片段編碼的重組蛋白p239[10-11]；我們在p166重組蛋白的研究基礎(chǔ)上利用大腸桿菌可溶性表達(dá)了含有中和抗原表位的HEV重組蛋白p179(aa439-617)，能夠誘導(dǎo)動物產(chǎn)生高滴度的特異性HEV中和抗體，目前已完成Ⅰ期臨床試驗。

雙抗體夾心法是檢測特異性抗原有效的方法，它的原理是將高度特異的單克隆抗體包被于微孔板，專一地捕獲抗原,然后與酶標(biāo)單克隆抗體結(jié)合，再加入底物液顯色。雙抗體夾心法檢測抗原陰性本底很低，特異性好，便于結(jié)果的判斷[12]。在本研究中首先分別應(yīng)用針對HEV ORF2重組蛋白的特異性McAbs進(jìn)行純化并用HRP標(biāo)記，以此建立競爭抑制ELISA進(jìn)行單抗的篩選，將針對兩種不同抗原表位的McAbs分別作為包被抗體和酶標(biāo)抗體，才有可能成功建立雙抗體夾心法ELISA，其結(jié)果表明部分McAbs之間可以相互競爭與p179結(jié)合，表示它們針對相同的抗原表位;而部分McAbs之間完全不能競爭，可同時與p179結(jié)合，表示其針對不同的抗原表位。綜合以上結(jié)果，p179上至少存在2種或2種以上抗原表位，兩種抗原表位在空間結(jié)構(gòu)上無相互影響，滿足建立雙抗體夾心法ELISA檢測抗原的理論基礎(chǔ)。目前尚無市售HEV ORF2重組蛋白抗原檢測的試劑盒，也沒有統(tǒng)一的快速準(zhǔn)確的方法對HEV ORF2重組蛋白抗原進(jìn)行檢測。我們設(shè)計多種實(shí)驗對本檢測方法的靈敏度和特異性進(jìn)行評價，用本方法檢測多個HEV ORF2重組蛋白抗原，陽性率100%，特別是對等量的不同基因型p166抗原無差異檢出。另外，在疫苗儲存過程中是否會出現(xiàn)疫苗抗原性的下降國內(nèi)外均未見相關(guān)報道。本研究使用多組McAbs并相互比較所建立的雙抗體夾心法ELISA，可快速、準(zhǔn)確檢測p179純化過程中初制品、半成品以及成品，同時能進(jìn)行抗原定量，且重復(fù)性好。

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WEN Ji-yue1，MENG Duo-jia2，F(xiàn)ENG Ye1，TIAN Sai1，

SHI Cheng-bo2，MENG Ji-hong1

(1.SchoolofMedicine，SoutheastUniversity，Nanjing210009，China; 2.ChangchunInstituteofBiologicalProductsCo.，LTD，Changchun130062，China)

Objective： To establish a double antibody sandwich ELISA for detection of hepatitis E virus antigen，and quantitative detection of p179 vaccine in early， semi-finished and finished products during vaccine production process. Methods: McAbs 3G1， 5G5， 1G10， 3A10 and 4E9 were prepared， conjugated with horseradish peroxidase and were used in a competitive inhibitory ELISA. Then， the appropriate paired McAbs were chosen to the establishment of the double antibody sandwich ELISA. Serial dilutions of p179 vaccine were used for the optimization of the double antibody sandwich ELISA and then the in-process p179 vaccine products were detected and quantified with the established assay. Results: Double antibody sandwich ELISA that can detect p179 vaccine during production process was established and optimized. McAbs 3G1 was selected as a coating antibody and 4E9 as an enzyme-conjugated antibody. Repeated detection of p179 using the sandwich ELISA has shown appreciable specificity and sensitivity，with a minimum detectable concentration of p179 vaccine up to 15.6 ng·ml-1. No cross reactivity was observed with both freeze-dried hepatitis A attenuated live vaccine and Hepatitis B virus surface antigen recombinant vaccine. Conclusion: The established double antibody sandwich ELISA can be used for the detection and quantitation of p179 antigen during vaccine production process．

hepatitis E virus; vaccine; recombinant protein; monoclonal antibody; double antibody sandwich enzyme-linked immunosorbent assay

2015-04-14

2015-04-20

國家863疫苗重點(diǎn)項目(2006AA02A235); 東南大學(xué)國家大學(xué)生創(chuàng)新訓(xùn)練計劃項目(1210286097)

文繼月(1978-)，女，安徽六安人,在讀博士研究生。E-mail:wenjiyue139@aliyun.com

孟繼鴻 E-mail:jihongmeng@163.com

文繼月,孟多佳,封曄,等.建立雙抗體夾心法ELISA定量檢測戊型肝炎p179疫苗[J].東南大學(xué)學(xué)報:醫(yī)學(xué)版,2015,34(4):501-506.

R392-33

A

1671-6264(2015)04-0501-06

10.3969/j.issn.1671-6264.2015.04．003