李書琴 楊珊 任嬡姝 戴紅衛(wèi)

重慶醫(yī)科大學(xué)附屬口腔醫(yī)院正畸科，口腔疾病與生物醫(yī)學(xué)重慶市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，重慶 401147

牙齒移動(dòng)過程中，牙根受力會(huì)發(fā)生一定程度的吸收及修復(fù)。成牙骨質(zhì)細(xì)胞是力學(xué)敏感細(xì)胞，與牙根部牙骨質(zhì)吸收后的修復(fù)密切相關(guān)。Wnt/β-catenin是與力學(xué)刺激和成骨效應(yīng)都有相關(guān)的信號(hào)通路，力學(xué)刺激能夠激活成骨細(xì)胞內(nèi)的Wnt/β-catenin信號(hào)通路，促進(jìn)成骨細(xì)胞Runx2的表達(dá)。目前力學(xué)刺激下Wnt/β-catenin信號(hào)通路對(duì)成牙骨質(zhì)細(xì)胞Runx2表達(dá)的調(diào)控作用尚未可知。本研究通過張應(yīng)力刺激以及特異性阻斷劑的干預(yù)，以Runx2為切入點(diǎn)，研究張應(yīng)力刺激對(duì)成牙骨質(zhì)樣細(xì)胞中Wnt/β-catenin信號(hào)通路的激活效應(yīng)以及該通路對(duì)Runx2的調(diào)控作用。

1 材料和方法

1.1 主要材料和設(shè)備

成牙骨質(zhì)細(xì)胞株OCCM30（四川大學(xué)華西口腔醫(yī)院白丁教授惠贈(zèng)）。BioFlex加力板（Flexcellint公司，美國(guó)）。阻斷劑Dikkopf-1（DKK1）（Sino biological公司，美國(guó)，目錄號(hào)：10170-H08H）。實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（real-time quantitative polymerase chain reaction，RT-PCR）試劑盒（TaKaRa公司，日本）；FX4000T加載裝置（Flexcellint公司，美國(guó)），倒置相差顯微鏡及照相系統(tǒng)（尼康公司，日本），F(xiàn)TC2000型RT-PCR基因擴(kuò)增儀、FTC2000型聚合酶鏈反應(yīng)合成儀（上海楓嶺生物技術(shù)有限公司），高速低溫離心機(jī)（Heraeus公司，德國(guó)），凝膠成像及圖像分析系統(tǒng)（Bio-Rad公司，美國(guó)）。本實(shí)驗(yàn)?zāi)康幕騌unx2以及內(nèi)參甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-phosphate dehydrogenase，GAPDH）的引物序列由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司設(shè)計(jì)合成，其序列見表1。

表1 引物序列Tab 1 Primer sequences

1.2 研究方法

1.2.1 OCCM30的培養(yǎng) 將同一批傳代的細(xì)胞按每毫升1×105個(gè)細(xì)胞的密度接種于BioFlex加力板上，每板加入培養(yǎng)液（90%體積分?jǐn)?shù)DMΕM，10%小牛血清，1%青霉素+鏈霉素）2 mL，于CO2孵箱內(nèi)培養(yǎng)（37 ℃；5%CO2，95%空氣），每2 d更換1次培養(yǎng)液。

1.2.2 應(yīng)力加載下Runx2 mRNA和β-catenin蛋白的表達(dá) 待細(xì)胞生長(zhǎng)鋪滿培養(yǎng)板底80%～90%時(shí)，將加力板置于FX4000T加力系統(tǒng)的孵箱中進(jìn)行應(yīng)力加載（加載參數(shù)為12%形變，1 Hz，1/2正弦波）。實(shí)驗(yàn)分為4個(gè)組，3個(gè)實(shí)驗(yàn)組分別加載3、6、12 h，對(duì)照組在相同孵箱內(nèi)培養(yǎng)但不加力。力學(xué)加載結(jié)束后收集細(xì)胞樣本，采用RT-PCR法半定量分析Runx2 mRNA的表達(dá)，Western blot法檢測(cè)β-catenin蛋白的表達(dá)。

1.2.3 阻斷劑對(duì)Runx2 mRNA和β-catenin蛋白表達(dá)的影響 將同一批傳代的細(xì)胞按每毫升1×105個(gè)細(xì)胞的密度接種于6孔板中繼續(xù)培養(yǎng)，待生長(zhǎng)到60%～70%時(shí)，將質(zhì)量濃度分別為20、50、80、100、150 ng·mL-1的DKK1分別加入培養(yǎng)板中，對(duì)照組加入PBS液，繼續(xù)培養(yǎng)，48 h后收集樣本，檢測(cè)Runx2 mRNA和βcatenin蛋白的表達(dá)。根據(jù)檢測(cè)結(jié)果選擇信號(hào)通路阻斷效果最佳的DKK1質(zhì)量濃度用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.4 應(yīng)力加載以及阻斷劑處理對(duì)Runx2 mRNA和βcatenin蛋白表達(dá)的影響 將實(shí)驗(yàn)分為A、B、C、D共4組，A組不加力不加阻斷劑，B組加力并加阻斷劑，C組加力不加阻斷劑，D組不加力加阻斷劑。同一批傳代的細(xì)胞按每毫升1×105個(gè)細(xì)胞的密度分別接種于A、B、C、D四組加力板中，生長(zhǎng)至60%～70%時(shí)，B、D組加入150 ng·mL-1DKK1，其余兩組加入PBS液，48 h后，加力組即B、C組放入加力系統(tǒng)（12%形變，1 Hz，1/2正弦波）的孵箱加力12 h，A、D組放入相同孵箱但不加力。培養(yǎng)12 h后檢測(cè)4組細(xì)胞Runx2 mRNA和β-catenin蛋白表達(dá)的變化。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

以上實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次，應(yīng)用SPSS 16.0軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析，采用LSD檢驗(yàn)進(jìn)行組間多重比較，檢驗(yàn)水準(zhǔn)為雙側(cè)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 應(yīng)力加載對(duì)成牙骨質(zhì)細(xì)胞Runx2 mRNA和βcatenin蛋白表達(dá)的影響

張應(yīng)力加載3、6、12 h后，成牙骨質(zhì)細(xì)胞內(nèi)Runx2 mRNA和β-catenin蛋白的表達(dá)情況見圖1、2。與對(duì)照組相比，加力后Runx2 mRNA和β-catenin蛋白的表達(dá)均增強(qiáng)（P＜0.05）。隨著加力時(shí)間延長(zhǎng)，β-catenin表達(dá)水平及Runx2 mRNA表達(dá)活性均呈上升趨勢(shì)。

圖1 應(yīng)力加載0、3、6、12 h后Runx2 mRNA的相對(duì)表達(dá)量Fig 1 Relative expression of Runx2 mRNA loaded by stress for 0,3,6,12 h

圖2 應(yīng)力加載0、3、6、12 h后β-catenin蛋白的相對(duì)表達(dá)量Fig 2 Relative expression of β-catenin protein loaded by stress for 0,3,6,12 h

2.2 阻斷劑處理對(duì)成牙骨質(zhì)細(xì)胞Runx2 mRNA和βcatenin蛋白表達(dá)的影響

阻斷劑處理后Runx2 mRNA的表達(dá)情況見圖3，β-catenin表達(dá)情況見圖4：經(jīng)不同質(zhì)量濃度的DKK1處理后，細(xì)胞內(nèi)Runx2 mRNA和β-catenin的表達(dá)總體上均有下降趨勢(shì)。DKK1質(zhì)量濃度為20、50 ng·mL-1時(shí)，Runx2 mRNA表達(dá)量與對(duì)照組相比無明顯差異（P＞0.05），經(jīng)80、100、150 ng·mL-1的DKK1處理后，Runx2 mRNA表達(dá)量下降，與對(duì)照組的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）（圖3）。經(jīng)5種質(zhì)量濃度的DKK1處理后，β-catenin蛋白的表達(dá)量較對(duì)照組均明顯下降（P＜0.05）（圖4）。DKK1的質(zhì)量濃度達(dá)到150 ng·mL-1時(shí)，β-catenin蛋白的表達(dá)量減少最明顯，說明150 ng·mL-1的DKK1能有效抑制成牙骨質(zhì)細(xì)胞內(nèi)β-catenin蛋白的表達(dá)活性。由此可見，不同質(zhì)量濃度的阻斷劑阻斷效應(yīng)不一樣，隨著質(zhì)量濃度的增大，阻斷效應(yīng)也越強(qiáng)，對(duì)Wnt/β-catenin信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路活性的抑制作用也越強(qiáng)。Wnt/β-catenin信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的活性在150 ng·mL-1的DKK1作用下活性最低，可被有效抑制，因此作為本研究后續(xù)使用DKK1的最佳濃度。

圖3 不同質(zhì)量濃度DKK-1處理后Runx2 mRNA的相對(duì)表達(dá)量Fig 3 Relative expression of Runx2 mRNA proceed by DKK-1 of different concentrations

圖4 不同質(zhì)量濃度DKK-1處理后β-catenin蛋白的相對(duì)表達(dá)量Fig 4 Relative expression of β-catenin protein proceed by DKK-1 of different concentrations

2.3 應(yīng)力加載及阻斷劑處理后β-catenin蛋白以及Runx2 mRNA的表達(dá)

應(yīng)力加載及阻斷劑處理后β-catenin蛋白的表達(dá)情況見圖5：A、D組比較，未加載張應(yīng)力的情況下，DKK1明顯抑制了β-catenin蛋白的表達(dá)，Wnt/β-catenin通路被抑制；B、C組比較，加載張應(yīng)力的情況下，DKK1處理組β-catenin蛋白表達(dá)明顯低于未加DKK1處理組；A、C組比較，不加阻斷劑時(shí)，張應(yīng)力刺激增強(qiáng)了β-catenin蛋白的表達(dá)；B、D組比較，阻斷劑作用后，應(yīng)力刺激組β-catenin蛋白表達(dá)相對(duì)較高。

圖5 應(yīng)力加載及阻斷劑處理后各組β-catenin蛋白的相對(duì)表達(dá)量Fig 5 Relative expression of β-catenin protein proceed by DKK-1 of different concentrations and loaded by stress

應(yīng)力加載及阻斷劑處理后Runx2 mRNA的表達(dá)情況見圖6：B、C組比較，張應(yīng)力刺激下，C組Wnt/β-catenin通路活性較高，此時(shí)Runx2基因的表達(dá)也表現(xiàn)為C組高于B組；B、D組比較，Wnt/β-catenin通路同時(shí)被抑制的狀態(tài)下，加力組細(xì)胞通路活性仍高于不加力組，即B組活性高于D組，此狀態(tài)下B組Runx2基因的表達(dá)也高于D組；而未加載張應(yīng)力的A、D組結(jié)果與本研究前述結(jié)果一致，抑制Wnt/β-catenin通路后，Runx2基因的表達(dá)相對(duì)未抑制組降低。

圖6 應(yīng)力加載及阻斷劑處理后各組Runx2 mRNA的相對(duì)表達(dá)量Fig 6 Relative expression of Runx2 mRNA proceed by DKK-1 of different concentrations and loaded by stress

3 討論

Runx2是一個(gè)力學(xué)相關(guān)因子，應(yīng)力刺激可促進(jìn)其在細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)。應(yīng)力環(huán)境下，牙周組織中的牙周膜細(xì)胞、成骨細(xì)胞均被證實(shí)為Runx2的靶細(xì)胞[1-3]。成牙骨質(zhì)細(xì)胞位于牙周膜中牙骨質(zhì)表面。本研究通過體外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，張應(yīng)力刺激促進(jìn)了Runx2 mRNA在成牙骨質(zhì)細(xì)胞中的表達(dá)。

β-catenin是Wnt/β-catenin信號(hào)通路的第二信使，細(xì)胞核內(nèi)β-catenin水平直接反映了該信號(hào)通路的活化水平[4]。本研究結(jié)果表明，張應(yīng)力加載后，OCCM30細(xì)胞核內(nèi)β-catenin的水平與對(duì)照組相比都增高，證實(shí)張應(yīng)力刺激激活了OCCM30內(nèi)經(jīng)典Wnt信號(hào)通路，在加載的12 h內(nèi)細(xì)胞核內(nèi)積聚的β-catenin量逐漸增多，說明在加載的12 h作用時(shí)間內(nèi)，Wnt信號(hào)通路都處于激活狀態(tài)，且隨著加力時(shí)間的延長(zhǎng)活性增強(qiáng)。

本研究中，張應(yīng)力刺激下細(xì)胞內(nèi)β-catenin蛋白和Runx2 mRNA均增多，表明張應(yīng)力刺激既能激活Wnt/β-catenin信號(hào)通路又能上調(diào)Runx2基因的表達(dá)。Runx2的活性水平由許多因素調(diào)控，信號(hào)通路是其中之一。一些與成骨相關(guān)的細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)通路可以通過激活輔助因子與Runx2的相互作用正向或負(fù)向調(diào)控其與DNA結(jié)合或轉(zhuǎn)錄活性，或者通過影響Runx2啟動(dòng)子來實(shí)現(xiàn)對(duì)其表達(dá)的調(diào)控[5]。另外許多關(guān)于細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶（extracellular regulated protein kinases，ΕRK）信號(hào)通路的研究發(fā)現(xiàn)，該通路也能調(diào)節(jié)Runx2的表達(dá)。有學(xué)者[6]用敲除分泌型卷曲相關(guān)蛋白1（secreted frizzled-related proteins 1，SFRP1）后的小鼠進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)，Wnt/β-catenin信號(hào)通路被激活后，Runx2 mRNA以及Runx2啟動(dòng)子活性均增強(qiáng)，并且其下游骨鈣素基因表達(dá)上調(diào)形成新骨。這說明Runx2是Wnt信號(hào)通路中的一個(gè)效應(yīng)因子，Wnt/βcatenin信號(hào)通路調(diào)控成骨細(xì)胞分化至少部分是通過Runx2基因表達(dá)的活性實(shí)現(xiàn)的[7]。

本研究中，當(dāng)Wnt/β-catenin信號(hào)傳導(dǎo)通路被抑制后，Runx2基因的表達(dá)也有減少，說明Wnt/β-catenin信號(hào)傳導(dǎo)通路對(duì)成骨效應(yīng)因子Runx2有調(diào)控作用，且抑制該通路Runx2 mRNA的表達(dá)表現(xiàn)為下調(diào)的趨勢(shì)，進(jìn)一步說明Wnt/β-catenin信號(hào)通路可能通過影響Runx2基因表達(dá)進(jìn)而影響成牙骨質(zhì)細(xì)胞的成骨效應(yīng)。正畸治療中，矯治力是影響牙根吸收后修復(fù)及牙周組織再生的關(guān)鍵因素，本研究?jī)H僅證明了Wnt/β-catenin信號(hào)通路可以調(diào)控Runx2因子，對(duì)應(yīng)力促進(jìn)成牙骨質(zhì)細(xì)胞成骨效應(yīng)機(jī)制還不能清楚說明，研究加載應(yīng)力模擬臨床正畸矯治力的情況下兩者關(guān)系是十分有必要的。

張應(yīng)力刺激作用能夠激活成牙骨質(zhì)細(xì)胞內(nèi)Wnt/β-catenin信號(hào)通路。無張應(yīng)力刺激作用時(shí)，阻斷該信號(hào)通路Runx2基因的表達(dá)減少；而張應(yīng)力刺激下，抑制Wnt/β-catenin通路活性，Runx2基因的表達(dá)也相應(yīng)減少。由此可見，張應(yīng)力刺激上調(diào)Runx2基因的表達(dá)機(jī)制中Wnt/β-catenin信號(hào)通路發(fā)揮了促進(jìn)作用。應(yīng)力刺激后，成牙骨質(zhì)細(xì)胞內(nèi)Wnt/β-catenin信號(hào)通路被激活，Runx2基因表達(dá)水平也上調(diào)，說明在正畸治療過程中成牙骨質(zhì)細(xì)胞仍能發(fā)揮成骨分化的功能，促進(jìn)牙根吸收后的修復(fù)。除了Wnt/β-catenin通路外，可能還存在其他調(diào)控因素影響Runx2基因的表達(dá)。類似對(duì)成骨細(xì)胞的研究[8]也表明，力學(xué)刺激能夠促進(jìn)成骨細(xì)胞的成骨分化。還有學(xué)者[9-10]通過激活和阻斷成牙骨質(zhì)細(xì)胞內(nèi)Wnt/β-catenin信號(hào)通路的研究發(fā)現(xiàn)，Wnt/β-catenin信號(hào)通路可以抑制成牙骨質(zhì)細(xì)胞的分化但促進(jìn)其增殖。但是，成牙骨質(zhì)細(xì)胞在正畸治療過程中的生物學(xué)功能還存在爭(zhēng)議，尚需要進(jìn)一步研究。

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