王敏永 劉鶴 李盛林 秦滿

1.北京大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院·口腔醫(yī)院兒童口腔科；2.口腔頜面外科研究室，北京 100081

牙髓治療的最理想的方法是活髓保存，蓋髓劑可以通過某種機制消除牙髓早期炎癥并形成封閉使之保存活力[1-2]。蓋髓劑性能的關(guān)鍵在于其生物相容性，以及對牙髓細(xì)胞增殖和分化能力的影響。作為經(jīng)典蓋髓劑——氫氧化鈣制劑在恒牙蓋髓治療上取得了很好效果，但是在乳牙蓋髓治療中效果差強人意[3]。三氧化礦物凝聚體（mineral trioxide aggregate，MTA）與氫氧化鈣相似，可以促進(jìn)牙髓細(xì)胞增殖及分化，促進(jìn)形成修復(fù)性牙本質(zhì)[4-6]。由于其良好的生物相容性和封閉性，近些年被廣泛應(yīng)用于蓋髓術(shù)，并取得了良好的臨床效果。特別是在乳牙蓋髓治療方面，MTA可以取得更好的臨床效果[7-8]。但MTA對乳、恒牙牙髓細(xì)胞作用差別的機制尚不清楚。

本研究通過對比MTA和氫氧化鈣對乳、恒牙牙髓細(xì)胞增殖以及與成牙本質(zhì)相關(guān)因子堿性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）、牙本質(zhì)涎磷蛋白（dentin sialophosphoprotein，DSPP）和破牙本質(zhì)相關(guān)因子骨保護(hù)因子（osteoprotegerin，OPG）和核因子κB受體活化因子配體（receptor activator of NF-κB ligand，RANKL）等基因表達(dá)的影響，探討其對乳、恒牙牙髓作用的機制，為MTA的臨床應(yīng)用提供依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 實驗材料

α-MΕM培養(yǎng)基、15%胎牛血清（Gibco公司，美國），2 mmol·L-1谷氨酰胺、100 μmol·L-1左旋抗壞血酸磷酸鹽（Sigma公司，美國），100 U·mL-1青霉素、100 μg·mL-1鏈霉素（華北制藥集團(tuán)）。

ΕLx808酶標(biāo)儀（BioTek公司，美國），RNA酶抑制劑（Biolab公司，美國），逆轉(zhuǎn)錄酶M-MLV（Invitrogen公司，美國），7500實時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（real time polymerase chain reaction，real time PCR）儀、SYBR GRΕΕN PCR MASTΕR MIX（ABI公司，美國）。

1.2 乳、恒牙牙髓細(xì)胞培養(yǎng)

經(jīng)患者及家屬知情同意，臨床收集健康、無明顯根吸收的滯留乳牙及因正畸拔除的前磨牙，即刻在無菌條件下取出牙髓，棄用根尖2 mm，剪碎后平鋪于25 cm2培養(yǎng)瓶，使用α-MΕM培養(yǎng)基，加入15%胎牛血清、2 mmol·L-1谷氨酰胺、100 μmol·L-1左旋抗壞血酸磷酸鹽、100 U·mL-1青霉素、100 μg·mL-1鏈霉素，置于37 ℃、5%CO2、飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。傳代培養(yǎng)后，取4～8代細(xì)胞進(jìn)行實驗。

1.3 實驗分組

參照Cavalcanti等[9]的方法制備氫氧化鈣和MTA浸提液。乳、恒牙牙髓細(xì)胞各分為對照組、氫氧化鈣組、MTA組，對照組使用常規(guī)培養(yǎng)基，另兩個實驗組分別在常規(guī)培養(yǎng)基中加入1/10體積相應(yīng)材料的浸提液。

1.4 細(xì)胞增殖檢測

各組牙髓細(xì)胞按密度為每毫升1.2×104個細(xì)胞接種于96孔板。各孔每24 h測定1次光密度值（optical density，OD），共計10 d。使用ΕLx808酶標(biāo)儀波長490 nm，參考波長630 nm，繪制生長曲線，按照公式計算細(xì)胞增殖率，細(xì)胞增殖率=實驗組OD值/對照組OD值×100%，并行統(tǒng)計學(xué)分析。

1.5 鈣結(jié)節(jié)染色

按照文獻(xiàn)[10]等采用的方法，將各組牙髓細(xì)胞按密度為每毫升1×104個細(xì)胞接種于6孔板培養(yǎng)，4周后進(jìn)行Von kossa染色觀察鈣結(jié)節(jié)形成。

1.6 ALP、DSPP、OPG、RANKL基因表達(dá)檢測

牙髓細(xì)胞按密度為每毫升1×104個細(xì)胞接種，分組培養(yǎng)10 d。Trizol法提取總RNA，經(jīng)聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）合成cDNA：初始體系13 μL（RNA 2 μg，Oligodt 1 μL，DΕPC水70 ℃反應(yīng)5 min；4 ℃下加入5×緩沖液4 μL、dNTP 1.5 μL、逆轉(zhuǎn)錄酶M-MLV 1 μL、RNA酶抑制劑0.5 μL，45 ℃反應(yīng)1 h，85 ℃反應(yīng)5 min，-20 ℃保存產(chǎn)物。

根據(jù)人類基因庫ALP、DSPP、OPG、RANKL基因mRNA序列，以GAPDH為內(nèi)參，設(shè)計擴增引物（表1）。使用7500實時熒光定量PCR儀檢測上述基因表達(dá)。50 μL反應(yīng)體系含25 μL SYBR GRΕΕN PCR MASTΕR MIX、雙蒸水20 μL 、cDNA 1 μL、上下游引物各2 μL。ALP、OPG、RANKL基因檢測反應(yīng)條件為：50 ℃ 2 min、95 ℃ 10 min，之后95 ℃ 15 s、59 ℃ 1 min，40個循環(huán)；DSPP基因檢測反應(yīng)條件為：50 ℃ 2 min、95 ℃ 10 min，之后95 ℃ 15 s、56 ℃30 s、72 ℃ 30 s，40個循環(huán)。取反應(yīng)產(chǎn)物測序以明確是否為目的基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物。根據(jù)相對定量計算公式ΔΔCt算法，計算ALP、DSPP、OPG和RANKL基因相對表達(dá)水平（relative quantif ication，RQ）。

1.7 統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS 11.5統(tǒng)計軟件的One Way ANOVA對實驗數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

表1 real time PCR引物序列Tab 1 real time PCR primers

2 結(jié)果

2.1 牙髓細(xì)胞增殖

MTA對乳牙和恒牙牙髓細(xì)胞增殖均有促進(jìn)作用，乳牙從第6天開始、恒牙從第8天開始顯著高于各自的對照組（F乳牙=1 835.065，P＜0.01；F恒牙=1 792.301，P＜0.01），分別于第9天和第10天達(dá)到對照組最大增殖率的118.40%和104.15%（圖1）。氫氧化鈣對乳牙和恒牙牙髓細(xì)胞增殖均有抑制作用（F乳牙=1 792.301，P＜0.01；F恒牙=19 413.11，P＜0.01），分別于第9天和第10天達(dá)到各自對照組最大增殖率的89.70%和84.48%（圖1）。

圖1 牙髓細(xì)胞生長曲線Fig 1 Growth curve of dental pulp cells

2.2 Von kossa染色結(jié)果

牙髓細(xì)胞連續(xù)培養(yǎng)4周后，MTA組和氫氧化鈣組乳、恒牙牙髓細(xì)胞的染色均呈陽性，在倒置顯微鏡下可見Von kossa染色陽性的鈣結(jié)節(jié)，而對照組兩種細(xì)胞染色均呈陰性（圖2）。

圖2 各組乳、恒牙牙髓細(xì)胞的觀察結(jié)果 Von kossa染色× 100Fig 2 Observation of dental pulp cells from primary and permanent teeth in every group Von kossa staining× 100

2.3 ALP、DSPP、OPG和RANKL表達(dá)的檢測結(jié)果

各組乳、恒牙牙髓細(xì)胞ALP、DSPP、OPG和RANKL表達(dá)的檢測結(jié)果見圖3～6。實時熒光定量PCR的產(chǎn)物經(jīng)測序證實為目的基因的特異擴增。乳牙氫氧化鈣組ALP、DSPP和OPG的表達(dá)顯著低于對照組，MTA組上述因子的表達(dá)顯著高于對照組（FALP=39.48，P＜0.01；FDSPP=170.72，P＜0.01；FOPG=54.29，P＜0.01）；氫氧化鈣組RANKL的表達(dá)顯著高于對照組（F=112.43，P＜0.01），MTA組RANKL表達(dá)則與對照組無顯著差異（F=1.20，P＞0.05）。

圖3 乳牙、恒牙牙髓細(xì)胞ALP的表達(dá)Fig 3 ALP expression of dental pulp cells from primary and permanent teeth

3 討論

圖4 乳牙、恒牙牙髓細(xì)胞DSPP的表達(dá)Fig 4 DSPP expression of dental pulp cells from primary and permanent teeth

圖5 乳牙、恒牙牙髓細(xì)胞OPG的表達(dá)Fig 5 OPG expression of dental pulp cells from primary and permanent teeth

圖6 乳牙、恒牙牙髓細(xì)胞RANKL表達(dá)Fig 6 RANKL expression of dental pulp cells from primary and permanent teeth

恒牙氫氧化鈣組ALP和DSPP的表達(dá)與對照組相比無顯著差異（FALP=1.37，P＞0.05；FDSPP=0.14，P＞0.05），MTA組ALP和DSPP表達(dá)顯著增加（FALP=23.76，P＜0.01；FDSPP=52.13，P＜0.01）。3組間OPG、RANKL表達(dá)均無顯著差異（FOPG=0.32，P＞0.05；FRANKL=0.73，P＞0.05）。

本研究觀察到實驗條件下氫氧化鈣對乳牙和恒牙牙髓細(xì)胞的增殖均有明顯的抑制作用。此現(xiàn)象在以往的研究中曾被間接證實，Alliot-Licht等[11]發(fā)現(xiàn)使用氫氧化鈣浸提液作用后人牙髓成纖維細(xì)胞DNA合成下降。Granchi等[12]發(fā)現(xiàn)氫氧化鈣通過影響細(xì)胞周期的特定環(huán)節(jié)而抑制細(xì)胞增殖。本研究發(fā)現(xiàn)MTA可促進(jìn)乳、恒牙牙髓細(xì)胞增殖。以往的研究[13-14]也發(fā)現(xiàn)MTA對不同細(xì)胞的增殖分化存在促進(jìn)作用。由此可見，MTA的生物相容性優(yōu)于氫氧化鈣。

雖然本實驗顯示氫氧化鈣和MTA均可使乳牙和恒牙牙髓細(xì)胞生成鈣化結(jié)節(jié)，可以部分解釋臨床上MTA或氫氧化鈣蓋髓治療中常見形成牙本質(zhì)橋，但Mente等[15]對122名接受直接蓋髓治療的患者進(jìn)行了最長為期80個月的觀察，經(jīng)過臨床檢查和影像學(xué)評估，MTA組取得了78%的成功率，顯著高于氫氧化鈣組的60%。Nair等[16]在人第三磨牙上分別使用MTA和Dycal進(jìn)行直接蓋髓，分不同時間段拔除牙齒進(jìn)行分析，MTA組較早出現(xiàn)硬組織覆蓋，且其厚度持續(xù)增加；Dycal組硬組織形成明顯不完整，且通常有炎癥表現(xiàn)。說明MTA與氫氧化鈣對恒牙牙髓細(xì)胞的作用有所不同。本研究觀察到，在對乳、恒牙牙髓細(xì)胞中ALP和DSPP基因表達(dá)水平影響上，MTA與氫氧化鈣有所差別，反映其促進(jìn)形成修復(fù)性牙本質(zhì)和礦化的能力在乳、恒牙牙髓細(xì)胞存在差別。乳、恒牙MTA組的ALP/DSPP基因表達(dá)水平明顯高于氫氧化鈣組，提示MTA的促分化能力優(yōu)于氫氧化鈣。乳牙氫氧化鈣組的ALP/DSPP表達(dá)水平顯著低于對照組，而恒牙牙髓細(xì)胞的ALP/DSPP表達(dá)水平卻與對照組沒有顯著差異，在基因水平反應(yīng)了乳、恒牙牙髓細(xì)胞對氫氧化鈣的不同反應(yīng)。

在破骨細(xì)胞分化和骨吸收的過程中，RANK/RANKL/OPG被認(rèn)為是調(diào)節(jié)破骨細(xì)胞分化和骨吸收功能的終極通路，OPG/RANKL表達(dá)的比例決定了骨代謝的進(jìn)程[17]。研究[18]顯示OPG/RANKL也參與了牙髓細(xì)胞中破牙細(xì)胞的分化以及牙根的吸收。本研究中乳牙氫氧化鈣組OPG表達(dá)下降，RANKL表達(dá)升高，提示牙髓細(xì)胞的分化向著有利于破牙本質(zhì)的方向進(jìn)展。臨床上一些治療失敗的病例中可以觀察到氫氧化鈣蓋髓后導(dǎo)致乳牙牙根吸收[19]。乳牙MTA組OPG表達(dá)增加，而RANKL表達(dá)沒有顯著變化，說明MTA可以促進(jìn)OPG的表達(dá)，抑制牙髓細(xì)胞向破牙細(xì)胞的分化。恒牙氫氧化鈣組和MTA組均未觀察到OPG和RANKL的顯著變化，這與臨床上少見恒牙使用氫氧化鈣和MTA蓋髓后出現(xiàn)根吸收相一致[20]。

本研究在mRNA水平上觀察到MTA和氫氧化鈣作用后乳、恒牙牙髓細(xì)胞ALP/DSPP和OPG/RANKL表達(dá)的變化以及差別，但此差別還需要進(jìn)一步的實驗，方能得出更為明確的結(jié)論。另外，本研究使用了特定稀釋比例的浸提液進(jìn)行實驗，并不能完全反映材料在體內(nèi)對牙髓組織的作用效果，不同濃度浸提液作用下牙髓細(xì)胞的反應(yīng)并不明確，未來可能需要設(shè)計進(jìn)一步的實驗來驗證。

本研究表明，MTA可促進(jìn)乳、恒牙牙髓細(xì)胞的增殖，并促使乳牙和恒牙牙髓細(xì)胞向成牙本質(zhì)細(xì)胞方向分化，抑制乳牙牙髓細(xì)胞向破牙本質(zhì)細(xì)胞方向分化。MTA較氫氧化鈣更適合作為乳牙及恒牙的蓋髓劑，其優(yōu)點在乳牙更為顯著。

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