劉敏 閆嘉惟 劉婭玲 郝玉慶

1.濱州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院口腔內(nèi)科，濱州 256603；2.口腔疾病研究國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 華西口腔醫(yī)院（四川大學(xué)），成都 610041；3.成都市第五人民醫(yī)院口腔科，成都 610041

自溶酶是革蘭陽(yáng)性菌產(chǎn)生的一種細(xì)胞壁肽聚糖水解酶。目前，細(xì)菌自溶酶的作用與調(diào)控機(jī)制已成為致病性生物膜研究的熱點(diǎn)之一，但對(duì)于有益菌自溶酶的研究甚少，而有益菌自溶酶對(duì)細(xì)菌生存競(jìng)爭(zhēng)與生物膜生態(tài)平衡可能具有重要作用[1]。

口腔有益菌格氏鏈球菌（Streptococcus gordonii，S.gordonii）是菌斑生物膜最早期的定植菌之一，在健康菌斑中占有相當(dāng)高的比例，對(duì)維護(hù)菌斑的生態(tài)平衡具有重要意義[2]。S.gordoniisg2013蛋白是形成正常細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)、生物膜及細(xì)菌自溶酶的關(guān)鍵蛋白。該蛋白能夠水解S.gordonii細(xì)胞壁的肽聚糖，具有自溶酶功能，命名為AtlS[3]。研究[3]發(fā)現(xiàn)，AtlS對(duì)細(xì)菌生存競(jìng)爭(zhēng)及拮抗致齲菌有重要作用。基于AtlS在S.gordonii生存競(jìng)爭(zhēng)及拮抗致齲菌具有重要作用以及氧和pH值對(duì)細(xì)菌生長(zhǎng)的影響，本實(shí)驗(yàn)運(yùn)用熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（fluorescence quantitative polymerase chain reaction，F(xiàn)Q-PCR）的方法研究S.gordonii的atlS基因在不同生長(zhǎng)期及pH值的表達(dá)差異，進(jìn)而分析調(diào)控S.gordoniiatlS表達(dá)的因素。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)菌株和培養(yǎng)基

S.gordoniiATCC 35105購(gòu)于美國(guó)標(biāo)準(zhǔn)品收藏中心。腦心浸液（brian heart infusion，BHI）培養(yǎng)基（Oxoid公司，英國(guó)）；兩種TY（tryptone yeast）培養(yǎng)基，一種pH=7.0，由50 mmol·L-1磷酸鉀緩沖液配制；另一種pH=5.5，由6 mol·L-1鹽酸配制。

1.2 主要儀器及設(shè)備

YJ-875型超凈工作臺(tái)（蘇州凈化設(shè)備廠），7300型FQ-PCR儀（Applied Biosystems公司，美國(guó)），Hermle Z323K型低溫離心機(jī)（Hermle Labartechnik公司，德國(guó)），SPΕCTRONIC 200型分光光度計(jì)（Thermo Fisher公司，美國(guó)），pH計(jì)（Mettler Toledo公司，瑞士），Bio-Rad電泳儀（Bio-Rad公司，美國(guó)）。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 實(shí)驗(yàn)菌株的培養(yǎng) 1）BHI培養(yǎng)基中實(shí)驗(yàn)菌株的培養(yǎng)。S.gordoniiATCC 35105于37 ℃下置于BHI瓊脂培養(yǎng)基中復(fù)蘇，兼性厭氧（80% N2、10% H2、10% CO2）條件下培養(yǎng)24 h后傳代，接種于液體BHI培養(yǎng)基，37 ℃兼性厭氧培養(yǎng)12 h，備用。2）TY培養(yǎng)基中實(shí)驗(yàn)菌株的培養(yǎng)。S.gordoniiATCC 35105于37 ℃下置于BHI瓊脂培養(yǎng)基中復(fù)蘇，兼性厭氧培養(yǎng)24 h后分別接種于TY/pH7.0和TY/pH5.5培養(yǎng)基中傳代，37 ℃兼性厭氧培養(yǎng)12 h，備用。

1.3.2S.gordonii生長(zhǎng)曲線的測(cè)量 將S.gordonii培養(yǎng)物調(diào)整到相同的菌密度后，一式三份分別接種于含有50 mL BHI、TY/pH7.0和TY/pH5.5培養(yǎng)基的錐形瓶中，混勻菌液，在96孔板上分3組，每組3孔，每孔加菌液200 μL，培養(yǎng)24 h。用自動(dòng)酶標(biāo)儀每小時(shí)測(cè)量1次光密度（optical density，OD）值，重復(fù)3次，繪制24 h生長(zhǎng)曲線，確定S.gordonii的生長(zhǎng)期。

1.3.3S.gordonii樣本收集 以BHI作為培養(yǎng)基，分別在S.gordonii對(duì)數(shù)生長(zhǎng)早期、對(duì)數(shù)生長(zhǎng)中期、對(duì)數(shù)生長(zhǎng)晚期及生長(zhǎng)穩(wěn)定期收集細(xì)胞。將TY/pH7.0和TY/pH5.5培養(yǎng)基分別植入菌液后置于37 ℃有氧搖床（速度為150 r·min-1）上培養(yǎng)，收集S.gordonii生長(zhǎng)穩(wěn)定期細(xì)胞；其中TY/pH7.0培養(yǎng)基作為中性條件，TY/pH5.5培養(yǎng)基作為酸性條件。

1.3.4 FQ-PCR檢測(cè)atlS基因mRNA表達(dá)水平S.gordonii收集完成后，采用FQ-PCR方法檢測(cè)atlS基因在不同生長(zhǎng)期（對(duì)數(shù)生長(zhǎng)早、中、晚期和穩(wěn)定期）和不同pH值（7.0和5.5）條件下mRNA的表達(dá)水平。1）RNA提取和cDNA合成。按Trizol總RNA抽提試劑說明書分別對(duì)不同生長(zhǎng)期和不同pH值下收集的S.gordonii進(jìn)行RNA提取，按照Fermentas逆轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，-20 ℃保存。2）引物設(shè)計(jì)。采用S.gordoniiATCC 35105的16S rRNA基因?yàn)閮?nèi)參。根據(jù)參考文獻(xiàn)[4]中得到的S.gordoniiATCC 35105的atlS基因片段核苷酸序列，利用Primer5.0軟件設(shè)計(jì)引物，序列如下。atlS基因引物，F(xiàn)：5’-CAGTCATAACGGAAGCATAAGC-3’，R：5’-CACTTGCAAACCAGCCAACTGG -3’，產(chǎn)物154 bp；16S rRNA內(nèi)參[5]引物，F(xiàn)：5’-AAGCAACGCGAAGAACCTTA-3’，R：5’-GTCTCGCTAGAGTGCCCAAC-3’ ，產(chǎn)物195 bp。設(shè)計(jì)的引物在GenBank上用BLAST程序檢測(cè)其特異性，結(jié)果顯示與S.gordonii的atlS基因的匹配率最高。3）FQ-PCR擴(kuò)增。采用TaKaRa公司的SYBR?Premix Εx TaqTMⅡ（Perfect Real Time）試劑盒，操作按說明書進(jìn)行，反應(yīng)體系總體積為20 μL。用RNase Freed H20將每個(gè)cDNA樣本稀釋5～10倍，置于7300型FQPCR儀上，進(jìn)行PCR反應(yīng)，每組的目的基因atlS與內(nèi)參基因16S各設(shè) 3個(gè)平行管。讀取各樣本Ct值。4）瓊脂糖電泳。取5 μL PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，加1 μL 6×Loading Buffer，在1.2%瓊脂糖凝膠，1×TBΕ緩沖液中電泳35 mins，電壓為100 V，電流為80 mA，采用Bio-Rad凝膠成像系統(tǒng)觀察并記錄。5）數(shù)據(jù)分析。atlS基因mRNA的相對(duì)表達(dá)量用2-ΔΔCt法計(jì)算。不同生長(zhǎng)期和不同pH條件下的ΔCt計(jì)算公式如下：ΔCt=atlS基因Ct值-16S rRNA Ct值。對(duì)不同生長(zhǎng)期的分析中，以對(duì)數(shù)生長(zhǎng)早期為對(duì)照組；對(duì)不同pH條件下分析中，以TY/7.0為對(duì)照組。ΔΔCt=ΔCt處理組-ΔCt對(duì)照組，計(jì)算得出atlS基因mRNA的相對(duì)表達(dá)量。使用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，兩組間的比較采用t檢驗(yàn)，多組比較采用方差分析，檢驗(yàn)水準(zhǔn)為雙側(cè)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 S.gordonii的生長(zhǎng)曲線

S.gordonii在BHI和TY/pH7.0、TY/pH5.5培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)曲線見圖1、2：該細(xì)菌的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)早期為3 h，對(duì)數(shù)生長(zhǎng)中期為4 h，對(duì)數(shù)生長(zhǎng)晚期為5 h，穩(wěn)定期為7 h；在中性和酸性條件下到達(dá)穩(wěn)定期的時(shí)間分別為7 h和8 h。

圖1 BHI培養(yǎng)基中S.gordonii的生長(zhǎng)曲線Fig 1 The growth curve of S.gordonii in BHI culture medium

圖2 TY培養(yǎng)基中S.gordonii的生長(zhǎng)曲線Fig 2 The growth curve of S.gordonii in TY culture medium

2.2 atlS基因mRNA的相對(duì)表達(dá)量分析

atlS基因在不同生長(zhǎng)期和pH值下的相對(duì)表達(dá)量見圖3、4。經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)檢驗(yàn)，在不同生長(zhǎng)時(shí)期atlS基因的相對(duì)表達(dá)量均有差異（P＜0.05），可以認(rèn)為從對(duì)數(shù)生長(zhǎng)早期到穩(wěn)定期該基因的表達(dá)逐步升高；在中性和酸性條件下表達(dá)量的差異也有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），中性條件下的表達(dá)量高于酸性條件下。

圖3 S.gordonii在不同生長(zhǎng)期atlS基因表達(dá)差異Fig 3 Differential expression of atlS gene of S.gordonii at different growth stages

圖4 S.gordonii在不同pH值下atlS基因表達(dá)差異Fig 4 Differential expression of atlS gene of S.gordonii at different pH value

3 討論

齲病是最常見的人類感染性疾病之一，屬于生態(tài)失衡性疾病，其發(fā)生與菌斑生物膜密切相關(guān)。如何維護(hù)菌斑的生態(tài)平衡是齲病防治的關(guān)鍵，有效的抗齲治療不能對(duì)有益的共生菌造成危害，因此自溶途徑有望成為抗齲治療的潛在靶點(diǎn)[6-7]。

2006年，H?varstein等[8]發(fā)現(xiàn)肺炎鏈球菌自溶酶LytA與細(xì)菌壓力耐受密切相關(guān)。在酸性、抗生素等多種壓力下，LytA表達(dá)增強(qiáng)，作為分泌蛋白溶解其他細(xì)菌的同時(shí)產(chǎn)生保護(hù)機(jī)制使自身免于溶解；通過清除“老弱病殘”的同種細(xì)菌并拮抗其他種類的細(xì)菌，同時(shí)獲得外源性DNA與生長(zhǎng)所需營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，減少細(xì)菌間的競(jìng)爭(zhēng)壓力[8-9]。LytA的作用機(jī)制被認(rèn)為是肺炎鏈球菌應(yīng)對(duì)環(huán)境壓力的重要應(yīng)答反應(yīng)，對(duì)細(xì)菌的生存競(jìng)爭(zhēng)具有重大意義[8,10-11]。

有研究發(fā)現(xiàn)，S.gordonii通過產(chǎn)生多種蛋白水解酶、過氧化氫及細(xì)菌素可抑制變異鏈球菌（Streptococcus mutans，S.mutans）的過度生長(zhǎng)與毒力因子的產(chǎn)生[5]；臨床研究也證實(shí)，當(dāng)牙菌斑生物膜中檢出高比例的S.gordonii時(shí)，變異鏈球菌產(chǎn)酸及細(xì)菌毒力作用能夠被有效地抑制[12]。AtlS是S.gordoniisg2013蛋白，因其能夠溶解S.gordonii的細(xì)胞壁肽聚糖而命名。Liu等[3]已經(jīng)證實(shí)，S.gordoniiatlS與細(xì)菌形成感受態(tài)、耐酸耐氧密切相關(guān)，在培養(yǎng)了48 h的S.gordonii生物膜中可以檢測(cè)到大量的AtlS蛋白，提示AtlS可能在菌斑生物膜中大量釋放。在與變異鏈球菌的生存競(jìng)爭(zhēng)實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，加入AtlS重組蛋白可以明顯提高S.gordonii拮抗S.mutans的能力[3]。由此推測(cè)，S.gordoniiAtlS的作用機(jī)制可能與肺炎鏈球菌LytA相似。

細(xì)菌的存在是齲病發(fā)生的先決條件，口腔中主要的致齲菌是S.mutans，它具有極強(qiáng)的產(chǎn)酸、耐酸及附著能力。菌斑中的S.mutans可使局部pH值下降至5.5以下，并能維持相當(dāng)長(zhǎng)的時(shí)間，同時(shí)避開唾液的緩沖作用，從而造成局部脫礦。在口腔鏈球菌中，S.gordonii是有益菌，具有拮抗S.mutans的作用。S.gordonii的atlS基因與S.mutans的atlA基因有36%的同源性。S.mutans的atlA基因與其生物膜形成有重要關(guān)系[13]，由此推測(cè)，atlS與S.gordonii的生物膜形成或許也有相關(guān)性[6]。

基于atlS基因在S.gordonii生存競(jìng)爭(zhēng)及拮抗致齲菌中表現(xiàn)出來的重要作用，本實(shí)驗(yàn)運(yùn)用FQ-PCR法研究S.gordonii的atlS基因在不同生長(zhǎng)期及pH值下的表達(dá)差異，結(jié)果顯示，細(xì)菌生長(zhǎng)期和pH值是影響atlS基因表達(dá)的相關(guān)因素。在不同的生長(zhǎng)期（對(duì)數(shù)生長(zhǎng)早期、對(duì)數(shù)生長(zhǎng)中期、對(duì)數(shù)生長(zhǎng)晚期、穩(wěn)定期）和不同pH值（7.0和5.5）下atlS基因均有表達(dá)，且表達(dá)量高低存在差異。從對(duì)數(shù)生長(zhǎng)早期到穩(wěn)定期，atlS基因表達(dá)量呈上升趨勢(shì)，到穩(wěn)定期達(dá)到最高水平；中性條件下的表達(dá)量高于酸性條件。

本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，S.gordoniiatlS基因在細(xì)菌生長(zhǎng)的不同階段表達(dá)具有差異性，從對(duì)數(shù)生長(zhǎng)早期到穩(wěn)定期呈增長(zhǎng)趨勢(shì)。當(dāng)細(xì)菌生長(zhǎng)到穩(wěn)定期時(shí)，細(xì)菌量達(dá)到最高值，atlS基因的表達(dá)也在穩(wěn)定期達(dá)到最高，這可能與細(xì)菌數(shù)量不斷增多有關(guān)。

菌斑在齲病的發(fā)生過程中起重要的作用是因?yàn)榫咧锌梢苑e聚酸，當(dāng)pH值下降到臨界值（5.5）以下時(shí)，可造成羥磷灰石中的鈣丟失，釉質(zhì)脫礦。只有少數(shù)致齲菌如S.mutans可以在這種環(huán)境下繼續(xù)生長(zhǎng)并產(chǎn)酸[7,14]。Liu等[3]發(fā)現(xiàn)，AtlS可以增加S.gordonii的耐酸性，atlS缺陷株在酸性條件下不能生長(zhǎng)。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，在中性或酸性條件下atlS基因都可以表達(dá)，但是atlS基因在臨界pH值（5.5）時(shí)的表達(dá)不如其在中性條件下高，這可能會(huì)降低了當(dāng)口腔處于易患齲環(huán)境時(shí)對(duì)S.mutans的拮抗作用。

本研究顯示，pH值和細(xì)菌生長(zhǎng)期均能影響atlS的表達(dá)，但需要進(jìn)一步排除各種因素間的相互干擾，篩選調(diào)控atlS表達(dá)的主要因素并明確其作用機(jī)制，及以上因素對(duì)AtlS蛋白水解酶活性的影響。另外，還需篩選并驗(yàn)證調(diào)控atlS表達(dá)的關(guān)鍵分子通路，以了解外界因素是通過怎樣的分子網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行信號(hào)傳遞以調(diào)控atlS基因的表達(dá)。

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