屈 鋒 陜西省涇陽縣動物衛(wèi)生監(jiān)督所 713700

王敏杰 陜西省榆林市榆陽區(qū)青云鎮(zhèn)畜牧獸醫(yī)工作站 719000

豬偽狂犬病病毒新流行株的分離鑒定及抗原差異性分析

屈 鋒 陜西省涇陽縣動物衛(wèi)生監(jiān)督所 713700

王敏杰 陜西省榆林市榆陽區(qū)青云鎮(zhèn)畜牧獸醫(yī)工作站 719000

我國多個省份的大規(guī)模養(yǎng)豬場都出現(xiàn)過新生仔豬神經疾病和死亡的案例，為了確定是否豬偽狂犬病病毒的感染所致，本次研究選取我國多個省份的13個PR免疫豬場送檢的156份病毒樣品，采用PCR方法對死亡仔豬腦組織中擴增PRV的gE基因，進行PRV病毒的分離鑒定和血清中和實驗及gE基因序列分析。將疑似PR病毒發(fā)病豬的腦部組織進行勻漿，提取其DNA進行PRV檢測，發(fā)現(xiàn)各個豬場都存在病毒感染。結論：依據(jù)本次實驗結果進行推測，當下各個豬場流行的PRV病毒可能存在一定的抗原變異。

豬偽狂犬病病毒；新流行株；分離鑒定；抗原差異性分析

在現(xiàn)代臨床研究治療中，由PR病毒所引起的豬急性傳染病就是豬偽狂犬病，PRV病毒會導致不同年齡段的豬被感染，其中又以哺乳豬仔和妊娠期母豬感染最為嚴重，致使哺乳豬仔出現(xiàn)麻痹、神經疾病、器官衰竭直至死亡，致使妊娠母豬流產、產木乃伊胎、死胎，此類感染PRV病毒的死亡率達到100%。對于PRV病毒病，我國大型養(yǎng)豬場均采用PRV基因缺失疫苗進行預防和治療，大體上取得了較好的效果。但是從2011年以來，很多采用PRV基因缺失疫苗進行預防和治療的大型養(yǎng)豬場都出現(xiàn)了疑似PR病毒，臨床表現(xiàn)為母豬產死胎、弱仔，哺乳豬仔出現(xiàn)麻痹、神經疾病及死亡。本次研究選取我國多個省份的13個PR免疫豬場送檢的156份病毒樣品進行PRV病毒的分離鑒定和血清中和實驗及gE基因序列分析，結果顯示，這些豬場所流行的PRV病毒擁有某種程度的抗原變異。

1 資料與方法

（1）臨床資料。選取我國多個省份的13個PR免疫豬場送檢的156份病毒樣品進行PRV病毒的分離鑒定和血清中和實驗及gE基因序列分析，PRV經典強毒雙城株和PRV疫苗株都在本院實驗室進行保存。對來自我國河南、內蒙古、吉林、黑龍江、江蘇等多個省區(qū)的13個PR免疫豬場送檢的懷疑是PR的豬腦組織156份病毒樣品，選取適量豬腦組織進行勻漿，依據(jù)臨床操作準則，一部分勻漿液體用于病毒的分離鑒定，一部分用于提取病毒基因組的DNA進行PCR鑒定。

（2）實驗對象和細胞。實驗豬和小鼠購買自獸醫(yī)研究所，Vero細胞在本實驗室進行保存。

（3）引物的設計和合成。依據(jù)GenBank中所登記的PRV基因序列分別設計用來gE全基因擴增和序列分析的引物和擴增部分的gE基因的檢測引物。

（4）病毒基因組的提取和PCR擴增以及病毒的分離。病毒基因組的提取和PCR擴增參考文獻[1]所描述的方法進行臨床操作。病毒的分離是將PCR鑒定為陽性的腦組織勻漿，采用過濾器進行過濾和除菌以后，取接種的Vero單層細胞，進行孵化孕育1小時后，更換含有2%的胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液體，觀察細胞的病變，等待70%左右的細胞出現(xiàn)CPE時收毒，進行凍融一次以后，連續(xù)在Vero細胞中傳代擴大培養(yǎng)。

（5）電鏡觀察病毒粒子。選取Vero細胞培養(yǎng)的病毒液體，采用2%的磷鎢酸負染，在電鏡下觀察病毒的粒子形態(tài)。

（6）小鼠的感染實驗。選取6～8周的55只小鼠，25只接種10×倍比稀釋的PRV-S強毒株，25只接種10×倍比稀釋的F5代分離株，經過腹股溝皮下接種0.1mL，對另外5只小鼠注射等體積的DMEM培養(yǎng)液體來作為陰性對照。觀察小鼠的臨床癥狀和死亡狀況，依據(jù)Reed Muench方法進行計算其LD50。

（7）病毒的中和實驗。對新分離的病毒接種豬血清和疫苗株Bartha k61接種豬血清，采用固定病毒稀釋血清方法測定兩株病毒的中和抗體。

2 結果

病毒資料檢測。將疑似PR病毒的發(fā)病豬的腦部組織進行勻漿，提取其DNA進行PRV檢測，發(fā)現(xiàn)各個豬場都存在病毒感染。

病毒的分離及鑒定。將少部分豬腦腦組織勻漿液體過濾除菌接種Vero細胞，48小時可以觀察到網狀的細胞病變。進行PCR鑒定，可以擴增到預期的大小片段，采用豬圓環(huán)病毒、豬繁殖、豬瘟和呼吸綜合征病毒特異性物擴增，都呈現(xiàn)陰性反應。電鏡檢測，觀察到病毒的粒子呈圓形，臨床體征有實心和中心，分為沒有囊膜和有囊膜兩種。

gE基因序列的分析。最近分離的PRV都處于相對獨立的分支中，和以往分離的病毒株親緣關系比較遠。

小鼠的感染實驗。小鼠接種的PRV-S強毒株和F5代分離株都出現(xiàn)了PR臨床癥狀，發(fā)病白鼠撕咬接種的部位，致使局部皮膚出血、皮毛脫落、撕咬肢體，病毒接種量達到103.0～106.0的TCID50的小鼠72小時后死亡，F(xiàn)5代分離株小鼠的 LD50為 103.37 TCID50，PRV-S小鼠的LD50為103.83 TCID50，注射DMEM培養(yǎng)液體的對照組小鼠沒有臨床癥狀。

血清交叉中和實驗。疫苗株Bartha k61接種豬血清產生的中和抗體水平和病毒接種豬血清相比比較低，可以50%中和自身病毒的血清稀釋度都在1∶20～1∶40。對于分離病毒接種豬血清的中和能力更加低，分離病毒接種豬感染2周就可以產生高水平的中和抗體，50%中和病毒的血清稀釋度都在1∶80以上，對兩種病毒的中和能力都比較。

3 討論

危害養(yǎng)豬業(yè)的嚴重傳染病就包括豬偽狂犬病，對豬偽狂犬病的預防主要依靠基因缺失疫苗的接種[2]。

采用微量中和實驗進行血清學進行分析，Bartha k61接種豬血清所產生的中和病毒接種豬血清產生的中和抗體水平比較低，對新分離的病毒接種豬血清產生的抗體水平較高，表明PR當下流行的病毒株和疫苗株之間在抗原性上存在一定的差異。

[1]彭金美，王瑜，田志軍，等．帶BAC質粒的重組偽狂犬病病毒的構建及其體外生長特性研究[J]．中國預防獸醫(yī)學報，2010，31 (1)：10-15．

[2]童光志，周艷君，郝曉芳，等．高致病性豬繁殖與呼吸綜合征病毒的分離鑒定及其分子流行病學分析 [J]．中國預防獸醫(yī)學報，2011，29(5)：323-327．