張 攀 許蒙蒙 林 燕 方正鋒 車(chē)煉強(qiáng) 吳 德 徐盛玉

(四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)研究所，雅安625000)

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重組乳酸乳球菌表達(dá)外源產(chǎn)物在養(yǎng)豬生產(chǎn)中的潛在應(yīng)用

張 攀 許蒙蒙 林 燕 方正鋒 車(chē)煉強(qiáng) 吳 德 徐盛玉*

(四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)研究所，雅安625000)

乳酸乳球菌是乳酸菌中的典型代表，隨著乳酸乳球菌分子生物學(xué)研究的不斷深入，重組乳酸乳球菌因具有益生作用和表達(dá)外源功能蛋白的雙重功能被用做載體菌在畜牧獸醫(yī)學(xué)領(lǐng)域廣泛研究，同時(shí)在養(yǎng)豬產(chǎn)業(yè)中也顯示出良好的應(yīng)用潛力，可為養(yǎng)豬業(yè)的健康發(fā)展提供新的思路。本文主要對(duì)重組乳酸乳球菌表達(dá)表皮生長(zhǎng)因子、乳鐵蛋白等外源產(chǎn)物來(lái)提高豬生產(chǎn)性能以及作為疫苗呈遞載體用于豬疾病防治的應(yīng)用做一綜述。

豬；乳酸乳球菌；表皮生長(zhǎng)因子；乳鐵蛋白；疫苗載體

乳酸乳球菌(Lactococcuslactis,L.lactis)是一種常溫發(fā)酵菌，是乳酸菌(latic acid bacteria, LAB)中的典型菌種。乳酸乳球菌可在動(dòng)物腸道中存活并發(fā)揮重要的生理作用，但并不能在動(dòng)物消化道中長(zhǎng)期定植[1]，是食品級(jí)醫(yī)藥工業(yè)中具有重要應(yīng)用前景的微生物之一，被公認(rèn)為安全的食品級(jí)微生物。

養(yǎng)豬生產(chǎn)中，LAB作為一種新型綠色飼料添加劑，已被證實(shí)在提高豬生產(chǎn)性能，改善豬肉品質(zhì)等方面具有良好的效用[2]。隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，乳酸乳球菌因具有益生作用和表達(dá)外源功能蛋白的雙重功能作為載體菌具有巨大的優(yōu)勢(shì)。將表達(dá)外源產(chǎn)物的重組乳酸乳球菌飼喂給豬，可改善豬的健康狀況、生產(chǎn)性能以及用于疾病的預(yù)防與治療，這可為養(yǎng)豬產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展提供一種新的途徑。

1 乳酸乳球菌

20世紀(jì)80年代開(kāi)始，研究者致力于對(duì)乳酸乳球菌生物學(xué)性質(zhì)和分子機(jī)制研究并已取得重大進(jìn)展，近年來(lái)，關(guān)于乳酸乳球菌作為載體表達(dá)外源基因的研究也不斷開(kāi)展。研究已證明乳酸乳球菌具有安全性，且自分泌蛋白質(zhì)少，無(wú)胞外蛋白質(zhì)，有利于排出干擾和保證外源蛋白質(zhì)功能正常發(fā)揮，并且全基因序列已測(cè)定，表達(dá)系統(tǒng)的研究也較為深入、成熟[3]，十分適合作為載體進(jìn)行運(yùn)用。

1.1 表達(dá)系統(tǒng)

根據(jù)LAB表達(dá)載體啟動(dòng)子類(lèi)型的不同，乳酸乳球菌表達(dá)系統(tǒng)中外源蛋白質(zhì)的表達(dá)可分為組成型、誘導(dǎo)型。相比而言，誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng)使外源基因的時(shí)空表達(dá)得到控制，使細(xì)菌生長(zhǎng)和外源基因的高效表達(dá)分開(kāi)，因此誘導(dǎo)型表達(dá)更有利于外源蛋白質(zhì)表達(dá)[4]。采用誘導(dǎo)型啟動(dòng)子已實(shí)現(xiàn)了許多外源蛋白質(zhì)在乳酸乳球菌中的大量表達(dá)，并開(kāi)發(fā)出含有不同誘導(dǎo)型啟動(dòng)子的多種表達(dá)系統(tǒng)，如T7啟動(dòng)子的表達(dá)系統(tǒng)、乳糖誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)、溫度誘導(dǎo)系統(tǒng)、噬菌體感染系統(tǒng)和乳鏈菌肽(nisin)誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng)(nisin-controlled expression system，NICE)等。其中NICE系統(tǒng)是目前最為有效、應(yīng)用最為廣泛的乳酸乳球菌食品級(jí)誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng)[5]，近年來(lái)由乳酸乳球菌表達(dá)外源蛋白質(zhì)大多數(shù)都利用了此系統(tǒng)。

1.2 重組乳酸乳球菌構(gòu)建的一般策略

根據(jù)目的基因序列及表達(dá)載體質(zhì)粒多克隆位點(diǎn)的特點(diǎn)，設(shè)計(jì)并合成引物，從組織樣中提取總RNA，并以之為模板，逆轉(zhuǎn)錄后進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得含目的基因的片段，將該片段與表達(dá)載體質(zhì)粒連接，隨后轉(zhuǎn)化進(jìn)入宿主菌細(xì)胞內(nèi)，通過(guò)質(zhì)粒提取、PCR鑒定、酶切鑒定和序列測(cè)定分析，證明目的基因已成功插入到表達(dá)載體質(zhì)粒中，獲得含有目的基因的表達(dá)載體質(zhì)粒。將獲得的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入乳酸乳球菌中，經(jīng)誘導(dǎo)表達(dá)后利用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)電泳分析，該重組乳酸乳球菌表達(dá)產(chǎn)物與預(yù)期大小是否相符，并經(jīng)Western blot測(cè)定目的產(chǎn)物抗原特異性及產(chǎn)量，獲得表達(dá)目的產(chǎn)物的重組乳酸乳球菌[6-9]。

2 重組乳酸乳球菌在養(yǎng)豬生產(chǎn)中的應(yīng)用

2.1 重組乳酸乳球菌表達(dá)外源功能性蛋白質(zhì)的應(yīng)用

2.1.1 表達(dá)表皮生長(zhǎng)因子(epidermal growth factor，EGF)重組乳酸乳球菌的應(yīng)用

EGF是一種廣泛存在于動(dòng)物體液與腺體中的生長(zhǎng)因子，動(dòng)物乳中的EGF含量豐富且能夠促進(jìn)新生動(dòng)物胃、腸道發(fā)育。研究表明，EGF具有促進(jìn)豬早期胚胎發(fā)育[10]、促進(jìn)斷奶仔豬生長(zhǎng)[11]的作用。因此利用表達(dá)EGF的乳酸乳球菌(EGF-LL)來(lái)緩解因早期斷奶造成的腸道黏膜損傷，促進(jìn)腸道發(fā)育具有重要的應(yīng)用價(jià)值。

Cheung等[6]以pAMJ399為表達(dá)載體(啟動(dòng)子受pH調(diào)控)來(lái)構(gòu)建EGF-LL，并給斷奶小鼠口服飼喂為期9 d的EGF-LL菌液，結(jié)果表明，試驗(yàn)組小鼠平均體重以及十二指腸、空腸、回腸的絨毛高度高于磷酸鹽緩沖液組和空載體組。重組菌發(fā)酵后的全細(xì)胞懸液胃內(nèi)灌服斷奶仔豬，試驗(yàn)組仔豬十二指腸、空腸絨毛高度顯著高于對(duì)照組[7]。本實(shí)驗(yàn)室以NICE系統(tǒng)構(gòu)建表達(dá)豬源生長(zhǎng)表皮因子(porcine epidermal growth factor，pEGF)的重組乳酸乳球菌，研究發(fā)現(xiàn)，21日齡斷奶仔豬連續(xù)飼喂14 d誘導(dǎo)表達(dá)pEGF后的重組乳酸乳球菌懸混液(LL-pEGF)，試驗(yàn)組最終體重顯著高于對(duì)照組；且試驗(yàn)組仔豬十二指腸、空腸、回腸的絨毛高度顯著高于對(duì)照組和空載體組[8]；進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，LL-pEGF能影響斷奶仔豬腸道功能和結(jié)構(gòu)完整性相關(guān)蛋白質(zhì)mRNA的表達(dá)，LL-pEGF較對(duì)照組提高了空腸和回腸腸道結(jié)構(gòu)相關(guān)蛋白、氨肽酶A、氨肽酶N及養(yǎng)分轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白mRNA的表達(dá)水平[9]。與mRNA表達(dá)水平結(jié)果一致，LL-pEGF組較對(duì)照組和抗生素組提高了十二指腸氨肽酶A、氨肽酶N的活性[8]。這與Bedford等[12]有關(guān)EGF對(duì)仔豬生產(chǎn)性能的影響機(jī)制研究相類(lèi)似，并且EGF-LL還能降低斷奶應(yīng)激造成的炎癥反應(yīng)，調(diào)控空腸絨毛杯狀細(xì)胞的增殖和成熟。

2.1.2 表達(dá)乳鐵蛋白(lactoferrin，LF)重組乳酸乳球菌的應(yīng)用

LF是一種天然活性鐵結(jié)合蛋白質(zhì)，研究表明，給仔豬飼喂LF具有調(diào)節(jié)腸道菌群[13]、促進(jìn)腸道細(xì)胞增殖[14]、提高養(yǎng)分利用率[15]、增強(qiáng)免疫力和抗氧化能力[16]、促進(jìn)仔豬早期神經(jīng)發(fā)育[17]的功能。從乳清中提取純化獲得LF的傳統(tǒng)工藝較為復(fù)雜，如果利用基因工程宿主菌表達(dá)外源蛋白質(zhì)則需純化，但乳酸乳球菌對(duì)動(dòng)物有有益作用，LF的抑菌作用對(duì)需鐵量低的乳酸乳球菌不產(chǎn)生影響，因此利用乳酸乳球菌表達(dá)LF具有巨大的優(yōu)勢(shì)。

黃薇薇等[18]在基礎(chǔ)飼糧中攪拌添加表達(dá)LF的乳酸乳球菌發(fā)酵菌液飼喂斷奶仔豬，試驗(yàn)21 d后結(jié)果顯示，試驗(yàn)組仔豬較對(duì)照組與抗生素組的十二指腸、空腸絨毛高度/隱窩深度極顯著提高，電鏡下觀察腸黏膜發(fā)現(xiàn)試驗(yàn)組仔豬腸絨毛完整，整齊度均一，腸基部致密緊湊，說(shuō)明試驗(yàn)組仔豬腸道發(fā)育得到了改善；試驗(yàn)組較對(duì)照組與抗生素組仔豬的脾臟指數(shù)和胸腺指數(shù)顯著提高，血清免疫球蛋白(Ig)G、腸黏液分泌型免疫球蛋白A(sIgA)含量顯著提高，血清白細(xì)胞介素(IL)-1與IL-2含量增加，說(shuō)明試驗(yàn)組仔豬免疫器官的成熟更快，免疫功能也得到增強(qiáng)，因此生產(chǎn)性能得到改善，平均日增重顯著提高，料重比極顯著降低。

2.1.3 表達(dá)IL乳酸乳球菌的應(yīng)用

IL是細(xì)胞因子的一大類(lèi)，在免疫細(xì)胞的成熟、活化、增殖和免疫調(diào)節(jié)等一系列過(guò)程中均發(fā)揮重要作用。研究表明IL具有提高免疫能力、抗病毒[19]、抗炎癥[20]等作用。表達(dá)豬源IL-2的乳酸乳球菌成功構(gòu)建為IL在養(yǎng)豬生產(chǎn)中應(yīng)用提供了依據(jù)[21]。通過(guò)分離豬外周血單核淋巴細(xì)胞，以及生物學(xué)技術(shù)獲得表達(dá)豬白細(xì)胞介素-18(pIL-18)的重組乳酸乳球菌，該重組菌分泌表達(dá)的pIL-18能促進(jìn)豬脾臟淋巴細(xì)胞增殖，且對(duì)病毒增殖有明顯抑制作用[22]。王美芳等[23]成功構(gòu)建了表達(dá)豬源IL-10重組植物乳酸桿菌，將倍比稀釋后的菌液灌服斷奶仔豬，并對(duì)仔豬進(jìn)行產(chǎn)腸毒素大腸桿菌(ETEC)攻毒，直至發(fā)病為止停止攻毒，結(jié)果發(fā)現(xiàn)飼喂重組菌菌液組斷奶仔豬體增重更快，且在第2、3周時(shí)血清中IgG和腸黏膜sIgA含量極顯著升高，淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率高，說(shuō)明重組菌的菌液具有調(diào)節(jié)仔豬免疫功能作用；同時(shí)試驗(yàn)組仔豬IL-4含量顯著提高，炎性細(xì)胞因子腫瘤壞死因子-α(TNF-α)含量極顯著下降，說(shuō)明重組菌的菌液具有抗炎作用。

2.1.4 表達(dá)其他蛋白質(zhì)重組乳酸乳球菌的應(yīng)用

利用重組乳酸乳球菌表達(dá)的功能性蛋白質(zhì)還有很多，但是在養(yǎng)豬產(chǎn)業(yè)中的應(yīng)用還需要進(jìn)一步的研究。如豬源干擾素-γ在乳酸乳球菌中的成功表達(dá)[24]，可為調(diào)節(jié)豬過(guò)敏性免疫反應(yīng)能力，增強(qiáng)豬對(duì)疾病的抵抗能力提供可能性；豬脂聯(lián)素球狀結(jié)構(gòu)域gAd也在乳酸乳球菌中成功誘導(dǎo)表達(dá)，將含gAd蛋白的生理鹽水溶液通過(guò)尾靜脈注射至高糖飼喂的小鼠體內(nèi)以鑒定其生物活性，結(jié)果顯示gAd蛋白具有加快糖代謝、降低血糖含量的作用[25]，這提示我們可否將其運(yùn)用于調(diào)節(jié)豬脂肪沉積，改善豬肉品質(zhì)，為優(yōu)質(zhì)豬肉生產(chǎn)奠定基礎(chǔ)；此外，多個(gè)來(lái)源的抗菌肽基因已經(jīng)在乳酸乳球菌中成功表達(dá)，包括enterocin P[26]、apidaecin[27]、pediocin PA-1[28]等。抗菌肽作為一類(lèi)具有抗菌活性的多肽，研究表明仔豬飼糧中添加抗菌肽具有緩解早期斷奶應(yīng)激、減少腹瀉、提高飼料報(bào)酬、促進(jìn)生長(zhǎng)、提高免疫力等的效果[29]，種豬飼糧中添加抗菌肽能夠改善種豬的繁殖性能并提高新生仔豬生長(zhǎng)性能[30-31]。利用重組乳酸乳球菌解決傳統(tǒng)抗菌肽提取工藝中的困難和天然資源有限的問(wèn)題，選擇適用于養(yǎng)豬生產(chǎn)的抗菌肽作為飼料添加劑將有助于提高生產(chǎn)效益；Ozkose等[32]成功構(gòu)建了表達(dá)纖維素酶的重組乳酸乳球菌，啟示我們是否可以嘗試用表達(dá)纖維素酶的重組乳酸乳球菌來(lái)解決由于豬體內(nèi)缺乏內(nèi)源性纖維素消化酶而造成的粗纖維飼料消化率低的影響，提高豬對(duì)纖維素的消化率，改善飼料報(bào)酬。

2.2 重組乳酸乳球菌作為疫苗呈遞載體的應(yīng)用

豬疾病的預(yù)防與治療是保障養(yǎng)豬業(yè)健康發(fā)展的一個(gè)關(guān)鍵步驟，但隨著集約化、現(xiàn)代化養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展，傳統(tǒng)的疾病預(yù)防和治療方法不斷受到挑戰(zhàn)，尋找更安全的方式勢(shì)在必行。近年來(lái)，細(xì)菌載體疫苗成為了新興現(xiàn)代疫苗的重要發(fā)展方向，利用乳酸乳球菌將靶抗原或病原體特異性抗原DNA片段插入質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)入菌體中誘導(dǎo)表達(dá)，并作為疫苗向動(dòng)物體內(nèi)免疫系統(tǒng)呈遞抗原，刺激機(jī)體進(jìn)行免疫應(yīng)答，從而達(dá)到疾病預(yù)防和治療的目的。

2.2.1 ETEC

ETEC誘導(dǎo)的仔豬腹瀉機(jī)制中起關(guān)鍵作用，構(gòu)建含有ETEC黏附素蛋白亞基FaeG基因的重組乳酸乳球菌，將重組菌懸液通過(guò)肌肉注射仔豬，免疫后測(cè)定結(jié)果表明，仔豬血清內(nèi)IgG含量顯著提高，血清IgA和IgM含量適度增加，且脾臟、腸細(xì)胞淋巴結(jié)、空腸的IgG、IgA和IgM抗體分泌細(xì)胞被誘導(dǎo)激活[33]，由此表明表達(dá)FaeG的重組乳酸乳球菌有希望作為一個(gè)針對(duì)ETEC的有效疫苗。

2.2.2 豬流行性腹瀉(porcine epidemic diarrhea,PED)和豬傳染性胃腸炎(porcine transmissible gastroenteritis,TGE)

PED和TGE均是冠狀病毒引起的消化道傳染病。將PED病毒S基因上編碼ps420蛋白的基因片段(1 495～1 916 bp)插入乳酸乳球菌表達(dá)載體，獲得了表達(dá)PED病毒S基因ps420的重組乳酸乳球菌，將重組乳酸乳球菌懸液灌服家兔可有效提高血清IgG含量，從而初步證明ps420蛋白具有中和活性[34]。同理，構(gòu)建含有4個(gè)主要抗原位點(diǎn)的TGE病毒纖突蛋白的全序列的重組乳酸乳球菌，該蛋白具有TGE全病毒的抗原性，將表達(dá)TGEV纖突蛋白的重組乳酸乳球菌乳酸乳球菌及空質(zhì)粒菌株分別口服免疫小鼠，收集糞便樣品進(jìn)行抗體檢測(cè)，結(jié)果表明分泌型重組菌免疫的小鼠能夠產(chǎn)生抗TGEV sIgA抗體[35]。

2.2.3 其他疾病

還有一些常見(jiàn)豬疾病的抗原在乳酸乳球菌成功誘導(dǎo)表達(dá)。表達(dá)豬輪狀病毒VP4蛋白的重組乳酸乳球菌已成功構(gòu)建，小鼠通過(guò)口服重組菌懸液進(jìn)行3次免疫，免疫后飼喂重組菌組小鼠的抗體濃度提高[36]；Wang等[37]構(gòu)建了表達(dá)致病性豬圓環(huán)病毒PCV2衣殼蛋白的重組乳酸乳球菌，通過(guò)口服免疫的方式發(fā)現(xiàn)鼠血清PCV2特異性抗體濃度提高；Wang等[38]以豬繁殖與呼吸綜合征的ORF6基因作為目的基因，構(gòu)建重組乳酸乳球菌活載體疫苗?？梢?jiàn)，多種多樣豬疾病抗原在乳酸乳球菌中不斷得到表達(dá)與應(yīng)用，對(duì)養(yǎng)豬生產(chǎn)中疾病的防治也會(huì)發(fā)揮越來(lái)越大的作用。

3 小結(jié)與展望

就目前而言，已有大量的外源產(chǎn)物在乳酸乳球菌中成功表達(dá)，在試驗(yàn)條件下對(duì)動(dòng)物也表現(xiàn)出積極的作用，這不僅是作為載體菌的乳酸乳球菌對(duì)動(dòng)物具有有益作用，所表達(dá)產(chǎn)物如細(xì)胞因子、酶類(lèi)等也具有良好生物效用，還包括對(duì)動(dòng)物疾病的預(yù)防治療所展現(xiàn)的應(yīng)用潛力。雖然用于乳酸乳球菌表達(dá)外源產(chǎn)物的工具和條件已相對(duì)成熟，但在實(shí)際生產(chǎn)中廣泛應(yīng)用還存在一定的問(wèn)題，已有研究證明去除基因修飾過(guò)的乳酸乳球菌的表達(dá)產(chǎn)物對(duì)豬的作用仍然明顯，且含有高濃度的乳酸乳球菌反而會(huì)影響表達(dá)產(chǎn)物的效用[39]，因此生產(chǎn)中應(yīng)用的方式還需要探究；表達(dá)的外源蛋白質(zhì)(特別是一些大分子物質(zhì))分泌量不足，表達(dá)系統(tǒng)還需要優(yōu)化；疫苗呈遞載體時(shí)，免疫的劑量與免疫的次數(shù)還需要進(jìn)一步研究。以及改變基因的宿主菌能否在生產(chǎn)中長(zhǎng)時(shí)間存活以及是否存在潛在的生物安全問(wèn)題，目前仍不清楚。但不可否認(rèn)的是隨著研究的不斷深入，乳酸乳球菌表達(dá)系統(tǒng)的不斷完善，諸如此類(lèi)的問(wèn)題將一一被解決，因此，重組乳酸乳球菌以其安全、價(jià)低的優(yōu)勢(shì)，可作為一種具有重要應(yīng)用潛力的載體菌在安全、高效、優(yōu)質(zhì)的養(yǎng)豬產(chǎn)業(yè)中發(fā)揮其重大作用。

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*Corresponding author, associate professor, E-mail: shengyuxu@sicau.edu.cn

(責(zé)任編輯 武海龍)

Potential Application of Expression of Exogenous Products by RecombinantLactococcuslactisin Pig Production

ZHANG Pan XU Mengmeng LIN Yan FANG Zhengfeng CHE Lianqiang WU De XU Shengyu*

(AnimalNutritionInstitute,SichuanAgriculturalUniversity,Ya’an625000,China)

Lactococcuslactisis a typical representative bacterium of lactic acid bacteria. With the deepening research in molecular biology ofLactococcuslactis, recombinantLactococcuslactisis extensively researched as a bacterial carrier in the field of animal husbandry and veterinary due to having prebiotic effects and using expression of exogenous functional proteins. Meanwhile,Lactococcuslactisalso showed good potential in pig industry, which could provide a new way for the healthy development of pig industry. This paper reviewed the expression of exogenous products of recombinantLactococcuslactis(epidermal growth factor, lactoferrin, etc.) for improving pig performance as well as a vaccine carrier for prevention and treatment of swine diseases.[ChineseJournalofAnimalNutrition, 2015, 27(12)：3677-3682]

Pigs;Lactococcuslactis; epidermal growth factor; lactoferrin; vaccine vector

10.3969/j.issn.1006-267x.2015.12.005

2015-06-16

四川農(nóng)業(yè)大學(xué)引進(jìn)人才科研啟動(dòng)項(xiàng)目；川豬遺傳改良與安全生產(chǎn)教育部創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)項(xiàng)目(IRT13083)

張 攀(1990—)，男，四川資陽(yáng)人，碩士研究生，從事動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)與飼料科學(xué)研究。E-mail： zhangpan5335@sina.cn

*通信作者：徐盛玉，副研究員，碩士生導(dǎo)師，E-mail: shengyuxu@sicau.edu.cn

S828

A

1006-267X(2015)12-3677-06