馬 濤 刁其玉

(中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院飼料研究所，農(nóng)業(yè)部飼料生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京100081)

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瘤胃微生物多樣性與定量

馬 濤 刁其玉*

(中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院飼料研究所，農(nóng)業(yè)部飼料生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京100081)

反芻動(dòng)物由于瘤胃微生物的存在能夠分解并利用飼料中的纖維素來(lái)提供能量和蛋白質(zhì)。瘤胃微生物主要包括細(xì)菌、真菌和原蟲，三者在消化飼料過(guò)程中分工明確，共同實(shí)現(xiàn)碳水化合物和蛋白質(zhì)的分解。本文綜述了定量瘤胃微生物群落多樣性的新方法，尤其是分子生物學(xué)的應(yīng)用，進(jìn)一步提高人們對(duì)于瘤胃功能的認(rèn)識(shí)水平。

瘤胃微生物；細(xì)菌；古細(xì)菌；厭氧真菌；原蟲

瘤胃具有復(fù)雜的微生物區(qū)系，主要包括細(xì)菌、原蟲和真菌這3大類，由于微生物的功能使得反芻動(dòng)物能夠利用飼料中的營(yíng)養(yǎng)成分生成揮發(fā)性脂肪酸以及微生物蛋白質(zhì)[1]，因此瘤胃微生物的研究是反芻動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)領(lǐng)域一個(gè)永恒的課題，直到20世紀(jì)80年代16S rRNA基因序列分析技術(shù)出現(xiàn)之前，研究人員廣泛應(yīng)用培養(yǎng)基的方法對(duì)微生物進(jìn)行研究，涉及到分離、計(jì)數(shù)以及功能鑒定等技術(shù)步驟，應(yīng)用該方法目前已經(jīng)完成了200多種細(xì)菌和100多種原蟲及真菌的鑒定。事實(shí)上，雖然培養(yǎng)基技術(shù)能夠有效地分離有代表性的瘤胃微生物，但其并不能反映瘤胃微生物的整體多樣性，因?yàn)槟鼙慌囵B(yǎng)的瘤胃微生物數(shù)量?jī)H占總微生物數(shù)量的不到20%[2]。過(guò)去的10年間，高通量測(cè)序技術(shù)的發(fā)展為研究瘤胃微生物多樣性提供了極大的便利。利用實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)研究發(fā)現(xiàn)一些不可培養(yǎng)的細(xì)菌數(shù)量甚至與大多數(shù)能夠培養(yǎng)的細(xì)菌數(shù)目一樣豐富，由此可能證明前者同樣在瘤胃發(fā)酵中起著重要作用[3]。此外，微生物多樣性不僅僅受到飼糧組成的影響[4]，同時(shí)也受到宿主遺傳背景[5]和環(huán)境因素[6]的影響。

1 瘤胃細(xì)菌

1.1 瘤胃細(xì)菌多樣性定量研究

每克瘤胃內(nèi)容物中的瘤胃細(xì)菌數(shù)量通常能夠達(dá)到1010～1011個(gè)[7]，Kim等[3]利用16S rRNA基因測(cè)序技術(shù)系統(tǒng)研究了反芻家畜瘤胃中占主導(dǎo)地位的13 478種細(xì)菌和3 516種古細(xì)菌的序列，發(fā)現(xiàn)瘤胃中存在著7 000種細(xì)菌和1 500種古細(xì)菌，這7 000種細(xì)菌歸屬于19個(gè)門，其中硬壁菌門(Firmicutes,57.8%)、擬桿菌門(Bacteroidetes,26.7%)和變形菌門(Proteobacteria,6.9%)在數(shù)量上占據(jù)主導(dǎo)地位。硬壁菌門中，梭菌綱(Clostridia)占90%以上，另外包括桿菌(Bacilli)、產(chǎn)芽胞菌(Erypsipelotrichi)和其他未分類的細(xì)菌。梭菌綱中，毛螺科菌(Lachnospiraceae,23.8%)、瘤胃菌(Ruminococcaceae,25.8%)和韋榮球菌(Veillonellaceae,7.7%)是最大的科，包含丁酸弧菌(Butyrivibrio,4.8%)、醋酸弧菌(Acetivibrio,4.5%)、瘤胃球菌(Ruminococcus,4.1%)、琥珀酸菌(Succiniclasticum,3.7%)、假丁酸弧菌(Pseudobutyrivibrio,2.3%)和Mogibacterium(2.3%)等主要的屬；擬桿菌門中，絕大多數(shù)細(xì)菌屬于擬桿菌綱(Bacteroidia,88.5%)，此外還有鞘脂桿菌綱(Sphingobacteria,1.0%)和未分類的擬桿菌(10.5%)。擬桿菌綱包含15個(gè)屬，其中普氏菌(Prevotella)為主要的屬(41.5%)，鞘脂桿菌綱則只包含2個(gè)屬。Bekele等[8]同樣通過(guò)16S rRNA基因測(cè)序技術(shù)發(fā)現(xiàn)綿羊瘤胃中大部分普氏菌(87.8%)的序列與已知普氏菌序列的相似度低于97%，表明不可培養(yǎng)的普氏菌數(shù)量遠(yuǎn)超過(guò)已知的普氏菌，其特定的生理功能也有待于探索。變形菌門共包括5個(gè)綱，其中α變形菌綱(Alphaproteobacteria)中數(shù)量最多的為苯基桿菌屬(Phenylobacterium,32.8%)；β變形菌綱(Betaproteobacteria)中數(shù)量最多的為水桿菌屬(Aquabacterium,32.4%)；γ變形菌綱(Gammaproteobacteria)中數(shù)量最多的為嗜冷桿菌(Psychrobacter,>58%)，然而嗜冷桿菌是嚴(yán)格的好氧嗜冷菌[9]，考慮到瘤胃內(nèi)的無(wú)氧環(huán)境以及溫度(38.5～40.5 ℃)，嗜冷桿菌的存在還需要進(jìn)一步證實(shí)；δ變形菌綱中數(shù)量最多的則為脫硫弧菌(Desulfovibrio)。

定量瘤胃微生物的方法包括熒光原位雜交(fluorenceinsituhybridization,FISH)、印跡雜交和16S/18S rRNA/rDNA(rrs)技術(shù)。纖維分解菌是反芻動(dòng)物瘤胃中一類重要的細(xì)菌，隨著定量技術(shù)的發(fā)展，人們對(duì)于其認(rèn)識(shí)逐步深入。通過(guò)印跡雜交方法得出的瘤胃主要纖維分解菌產(chǎn)琥珀酸絲狀桿菌、黃色瘤胃球菌和白色瘤胃球(菌)只占總瘤胃細(xì)菌群落的10%以下[10]；應(yīng)用FISH技術(shù)進(jìn)一步得出該3種菌占瘤胃總纖維分解菌的50%左右[11]；隨后通過(guò)實(shí)時(shí)定量PCR定量分析得到產(chǎn)琥珀酸絲狀桿菌是最主要的纖維分解菌[12]。rrs技術(shù)是近年來(lái)最常用的微生物定量手段，Jami等[13]以16頭采食同一飼糧的奶牛為研究對(duì)象定量其瘤胃微生物區(qū)系，發(fā)現(xiàn)雖然區(qū)系在個(gè)體間存在顯著差異，但幾乎所有奶牛的瘤胃中均存在共同的32個(gè)細(xì)菌屬，由此可見(jiàn)反芻動(dòng)物瘤胃中存在著共享的核心菌群。Jami等[14]進(jìn)一步對(duì)上述核心菌群進(jìn)行分析并定量了13種關(guān)鍵功能菌的豐度，發(fā)現(xiàn)不同個(gè)體間核心菌群的豐度差異變化也極為顯著，例如反芻真桿菌(Eubacteriumruminantium)的豐度在不同個(gè)體間相當(dāng)穩(wěn)定，而埃氏巨球菌(Megasphaeraelsdenii)的豐度在不同個(gè)體間差異幅度可達(dá)3倍；Pitta等[15]利用基于16S rRNA的擴(kuò)增子測(cè)序技術(shù)，得出當(dāng)肉牛由飼喂低蛋白質(zhì)高纖維的狗牙根(Bermudagrass)向高蛋白質(zhì)高可溶性營(yíng)養(yǎng)物的冬小麥(Triticumaestivum)轉(zhuǎn)換時(shí)，普氏菌的比例由28%上升到56%，是瘤胃中比例最高的菌屬。對(duì)于瘤胃細(xì)菌群落變化的研究，可利用的手段包括限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性(restriction fragment length polymorphism,RFLP)、變性梯度凝膠電泳(denaturing gradient gel electrophoresis,DGGE)、溫度梯度凝膠電泳(temperature gradient gel electrophoresis,TGGE)和單鏈構(gòu)象多態(tài)性(single-strand conformation polymorphism,SSCP)分析等。Jarvis等[16]利用RFLP研究了牛鏈球菌多樣性受飼糧精粗比例變化的影響情況；Kocherginskaya等[17]利用DGGE和TGGE手段研究表明高谷物飼糧飼喂的牛瘤胃細(xì)菌群落豐富度要顯著高于高粗料飼糧飼喂的肉牛。將不同分子生物學(xué)手段結(jié)合，有利于更好地反映瘤胃細(xì)菌受飼糧影響的變化情況。

1.2 瘤胃古細(xì)菌多樣性定量研究

反芻動(dòng)物瘤胃中存在的古細(xì)菌基本為產(chǎn)甲烷菌[18]，每克瘤胃內(nèi)容物中的古細(xì)菌基因拷貝數(shù)量在108～1010之間[19]，絕大部分(99.6%)屬于廣古菌門(Euryarchaeota)，其中90%以上的序列與甲烷短桿菌屬(Methanobrevibacter,50%)、甲烷微菌屬(Methanomicrobium,15%)和甲烷球形菌屬(Methanosphaera,13%)等產(chǎn)甲烷菌屬相關(guān)[3]。上述產(chǎn)甲烷菌的主導(dǎo)地位使其在利用氫氣(H2)和二氧化碳(CO2)等發(fā)酵產(chǎn)物時(shí)更具有競(jìng)爭(zhēng)力，從而能夠迅速生長(zhǎng)，與此對(duì)應(yīng)，反芻動(dòng)物甲烷排放的降低也直接與產(chǎn)甲烷菌生長(zhǎng)受抑制相關(guān)。雖然首次分離產(chǎn)甲烷菌至今已有50多年[20]，但相當(dāng)長(zhǎng)的一段時(shí)間以來(lái)對(duì)于其了解程度遠(yuǎn)不如瘤胃細(xì)菌，而隨著微生物分析技術(shù)的發(fā)展，人們逐漸開始探究產(chǎn)甲烷菌和其他瘤胃微生物之間，以及不同種屬產(chǎn)甲烷菌的相互影響作用。Yanagita等[21]利用FISH技術(shù)得出游動(dòng)甲烷微菌(Methanomicrobiummobile)占綿羊瘤胃總甲烷菌的54%左右；Soliva等[22]同樣通過(guò)FISH技術(shù)闡明了月桂酸和肉豆蔻酸共同作用抑制甲烷菌生長(zhǎng)的機(jī)理；Ohene-Adjei等[23]通過(guò)分析古細(xì)菌16S rRNA基因克隆文庫(kù)，首次證明了瘤胃原蟲對(duì)古細(xì)菌的種類存在直接影響；Mosoni等[19]利用DGGE技術(shù)研究發(fā)現(xiàn)盡量去原蟲能夠顯著降低甲烷排放量，但主要產(chǎn)甲烷菌的豐度和多樣性均不受去原蟲的影響；Leahy等[24]對(duì)甲烷短桿菌進(jìn)行了全基因組測(cè)序，這也是首個(gè)得到完整序列的瘤胃古細(xì)菌，上述研究者發(fā)現(xiàn)其含有大量編碼表面黏附蛋白的基因，而這些蛋白質(zhì)的發(fā)現(xiàn)可能有助于研究者更有針對(duì)性地開發(fā)相應(yīng)疫苗，從而抑制甲烷菌的產(chǎn)生以及甲烷的排放。自2006年以來(lái)，大氣甲烷的產(chǎn)生量以每年0.4%的速率增加[25]，甲烷減排日益成為研究熱點(diǎn)，應(yīng)用生物技術(shù)能夠針對(duì)反芻動(dòng)物主要的甲烷來(lái)源--古細(xì)菌進(jìn)行直接分析，有助于人們更好地闡明瘤胃甲烷產(chǎn)生或抑制的相關(guān)機(jī)理。

2 瘤胃原蟲

長(zhǎng)期以來(lái)顯微技術(shù)是對(duì)原蟲進(jìn)行鑒定和計(jì)數(shù)的理想方法，由此得到每克瘤胃內(nèi)容物中原蟲數(shù)量為105～106個(gè)，其中95%以上的為內(nèi)毛蟲(Entodinium)[26]。近年來(lái)，分子技術(shù)越來(lái)越多地被應(yīng)用于原蟲種屬間差異的研究。Sylvester等[27]利用DNA指紋技術(shù)就飼糧對(duì)奶牛瘤胃和十二指腸原蟲多樣性展開研究，發(fā)現(xiàn)了尖尾內(nèi)毛蟲(Epidiniumcaudatum)、有尾內(nèi)毛蟲(Entodiniumcaudatum)和原口等毛蟲(Isotrichaprostoma)為主要的種類；Skillman等[28]采集了100只綿羊的瘤胃液樣品，通過(guò)18S rRNA基因測(cè)序技術(shù)發(fā)現(xiàn)不同時(shí)間點(diǎn)同一個(gè)體的原蟲數(shù)量相對(duì)穩(wěn)定，但在不同個(gè)體間每克瘤胃內(nèi)容物中內(nèi)毛蟲的數(shù)量波動(dòng)范圍在1～106之間，因此如果想獲得統(tǒng)計(jì)學(xué)上的差異顯著性，每個(gè)試驗(yàn)處理須至少采集52個(gè)樣品；Tymensen等[29]利用末端限制性片段長(zhǎng)度多樣性(T-RFLP)分析比較了飼喂干草的肉牛和飼喂青貯/谷物飼料的肉牛瘤胃原蟲區(qū)系，發(fā)現(xiàn)飼喂青貯/谷物飼料的肉牛瘤胃中內(nèi)毛屬原蟲(Entodiniumspp.)的豐度以及原蟲多樣性(香儂指數(shù))較飼喂干草的肉牛更高，此外同圈飼養(yǎng)的肉牛在瘤胃原蟲區(qū)系上更傾向于一致，該研究也是首次在瘤胃原蟲上應(yīng)用T-RFLP技術(shù)與傳統(tǒng)的顯微技術(shù)進(jìn)行對(duì)比，從結(jié)果來(lái)看T-RFLP技術(shù)能夠很好地對(duì)顯微結(jié)果進(jìn)行補(bǔ)充說(shuō)明。

3 瘤胃真菌

瘤胃真菌只占到瘤胃總微生物量的10%左右，且受飼糧和個(gè)體顯著影響[2]。由于真菌18S rRNA序列具有高度保守性，因此無(wú)法利用該序列對(duì)其進(jìn)行鑒定或比較[30]，而真菌rRNA的內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)序列(internal transcribed spacer sequence,ITS)具有高度可變性，為區(qū)分不同的真菌類型提供了依據(jù)[31]。隨后該技術(shù)不斷得到改進(jìn)，Denman等[32]通過(guò)自動(dòng)分析的方法能夠區(qū)分3個(gè)不同屬[根囊鞭菌屬(Orpinomyces)、梨囊鞭菌屬(Piromyces)和新麗鞭毛菌(Neocallimastix)]的真菌品種；Griffith等[33]和Liggenstoffer等[34]通過(guò)分離包括反芻動(dòng)物和單胃動(dòng)物在內(nèi)的數(shù)種食草動(dòng)物瘤胃及糞便中的厭氧真菌，并將其歸為新的門類——新美鞭菌門(Neocallimastigomycota)。在Liggenstoffer等[34]的研究中共獲得了267 286條能夠代表全部已知真菌屬的序列，其中梨囊鞭菌屬數(shù)量最多，占總序列的36%；枝梗鞭菌屬(Cyllamyces)和根囊鞭菌屬則最少，分別只占總序列的0.7%和1.1%，此外有多達(dá)38.3%的序列并不屬于已鑒定的6個(gè)屬，而是形成了8個(gè)在發(fā)育上差異顯著的新型譜系。Youssef等[35]利用高通量測(cè)序和單分子實(shí)時(shí)測(cè)序技術(shù)，闡明了根囊鞭菌屬中C1A菌株降解木質(zhì)纖維素的相關(guān)機(jī)制，但目前為止關(guān)于瘤胃真菌的研究報(bào)道仍然不多。

4 瘤胃噬菌體

瘤胃中的噬菌體含量豐度，每毫升瘤胃內(nèi)容物中噬菌體數(shù)量為107～109個(gè)[36]，然而人們對(duì)其多樣性及功能作用仍知之甚少。Berg等[37]首次對(duì)牛瘤胃病毒組進(jìn)行了全基因組分析，鑒定出28 000種不同的病毒基因型，然而其中高達(dá)78%的基因型與以知基因型并不匹配；前噬菌體的數(shù)量約為溶解性噬菌體的2倍，而絕大多數(shù)噬菌體和前噬菌體與瘤胃中占主導(dǎo)地位的門類(硬壁菌、擬桿菌和變形菌)密切相關(guān)。

5 瘤胃微生物區(qū)系的建立

在過(guò)去的20年時(shí)間里，法國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院的研究人員通過(guò)對(duì)無(wú)菌條件下出生的羔羊在不同條件下瘤胃微生物生長(zhǎng)情況開展了一系列研究[38-40]。近年來(lái)Jami等[41]應(yīng)用焦磷酸測(cè)序技術(shù)對(duì)1日齡～2歲的反芻動(dòng)物瘤胃細(xì)菌組成開展了研究，表明瘤胃微生物區(qū)系在出生后迅速建立，一致出現(xiàn)好氧和兼性厭氧微生物數(shù)量的下降，以及厭氧微生物數(shù)量的上升；一些瘤胃細(xì)菌在動(dòng)物出生第1天就具備功能，且在采食固體飼料前其功能已相當(dāng)完備。出生后的反芻動(dòng)物瘤胃微生物區(qū)系可通過(guò)接觸母體的產(chǎn)道、乳頭、皮膚和唾液等建立，這種微生物區(qū)系的建立有利于瘤胃上皮的正常發(fā)育，從而能夠保證正常的瘤胃發(fā)酵和消化功能，維持動(dòng)物健康生長(zhǎng)。

6 小 結(jié)

瘤胃微生物群落是反芻動(dòng)物獨(dú)有的生物平衡體系，是反芻動(dòng)物的生命和生產(chǎn)基礎(chǔ)，是一個(gè)需要無(wú)止境探索和研究的發(fā)酵實(shí)體，而基于核酸的分離鑒定技術(shù)逐漸成為研究瘤胃微生物種類及其在瘤胃中扮演角色的重要手段。2011年，瘤胃微生物組織(新西蘭)開啟了“Hungate 1000”項(xiàng)目，旨在建立1 000種可培養(yǎng)的瘤胃細(xì)菌、古細(xì)菌、厭氧真菌和纖毛蟲的全基因組序列，能夠代表瘤胃中最主要的微生物多樣性。該項(xiàng)目的啟動(dòng)與實(shí)施具有重要意義，例如通過(guò)發(fā)現(xiàn)編碼降解纖維活性的新基因用于提高動(dòng)物生產(chǎn)性能、飼料原料解聚、生產(chǎn)生物燃料，或通過(guò)對(duì)古細(xì)菌全基因組序列的測(cè)定更有效地降低甲烷排放。隨著現(xiàn)代科學(xué)的發(fā)展，瘤胃微生物的奧妙正在逐步被發(fā)現(xiàn)，其活動(dòng)原理也在逐層被揭示，瘤胃微生物發(fā)生發(fā)展是微觀也是宏觀的，正期待人們用更進(jìn)一步的手段去發(fā)現(xiàn)和解密。

[1] HOBSON P N,STEWART C S.The rumen microbial ecosystem[M].2nd ed.New York:Blackie Academic and Professional,1997.

[2] KRAUSE D O,NAGARAJA T G,WRIGHT A D,et al.Board-invited review:rumen microbiology:leading the way in microbial ecology[J].Journal of Animal Science,2013,91(1):331-341.

[3] KIM M,MORRISON M,YU Z.Status of the phylogenetic diversity census of ruminal microbiomes[J].FEMS Microbiology Ecology,2011,76(1):49-63.

[4] CHAUCHEYRAS-DURAND F,CHEVAUX E,MARTIN C,et al.Use of yeast probiotics in ruminants:effects and mechanisms of action on rumen pH, fibre degradation, and microbiota according to the diet[M].RIGOBELO E C.Probiotic in animals.Rijeka,Croatia：Tech,2012：119-162.

[5] BENSON A K,KELLY S A,LEGGE R,et al.Individuality in gut microbiota composition is a complex polygenic trait shaped by multiple environmental and host genetic factors[J].Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America,2010,107(44):18933-18938.

[6] UYENO Y,SEKIGUCHI Y,TAJIMA K,et al.An rRNA-based analysis for evaluating the effect of heat stress on the rumen microbial composition of Holstein heifers[J].Anaerobe,2010,16(1):27-33.

[7] RUSSELL J B,RYCHLIK J L.Factors that alter rumen microbial ecology[J].Science,2001,292(5519):1119-1122.

[8] BEKELE A Z,KOIKE S,KOBAYASHI Y.Genetic diversity and diet specificity of ruminalPrevotellarevealed by 16S rRNA gene-based analysis[J].FEMS Microbiology Letters,2010,305(1):49-57.

[9] BOZAL N,MONTES M J,TUDELA E,et al.Characterization of several Psychrobacter strains isolated from Antarctic environments and description ofPsychrobacterlutisp. nov. andPsychrobacterfoziisp. nov[J].International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology,2003,53(Pt 4):1093-1100.

[10] STEVENSON D M,WEIMER P J.Dominance ofPrevotellaand low abundance of classical ruminal bacterial species in the bovine rumen revealed by relative quantification real-time PCR[J]. Applied Microbiology and Biotechnology,2007,75(1):165-174.

[11] KONG Y,XIA Y,SEVIOUR R,et al.Insituidentification of carboxymethyl cellulose-digesting bacteria in the rumen of cattle fed alfalfa or triticale[J].FEMS Microbiology Ecology,2012,80(1):159-167.

[12] KOBAYASHI Y,SHINKAI T,KOIKE S.Ecological and physiological characterization shows thatFibrobactersuccinogenesis important in rumen fiber digestion-review[J].Folia Microbiologica,2008,53(3):195-200.

[13] JAMI E,MIZRAHI I.Composition and similarity of bovine rumen microbiota across individual animals[J].PLoS One,2012,7(3):e33306.

[14] JAMI E,MIZRAHI I.Similarity of the ruminal bacteria across individual lactating cows[J].Anaerobe,2012,18(3):338-343.

[15] PITTA D P,PINCHAK W E,DOWD S E,et al.Rumen bacterial dynamics associated with changing fromBermudagrasshay to grazed winter wheat diets[J].Microbial Ecology,2010,59:511-522.

[16] JARVIS G N,KURTOVIC A,HAY A G,et al.The physiological and genetic diversity of bovineStreptococcusbovisstrains(1)[J].FEMS Microbiology Ecology,2001,35(1):49-56.

[17] KOCHERGINSKAYA S A,AMINOV R I,WHITE B A.Analysis of the rumen bacterial diversity under two different diet conditions using denaturing gradient gel electrophoresis, random sequencing, and statistical ecology approaches[J].Anaerobe,2001,7(3):119-134.

[18] JANSSEN P H,KIRS M.Structure of the archaeal community of the rumen[J].Applied and Environmental Microbiology,2008,74(12):3619-3625.

[19] MOSONI P,MARTIN C,FORANO E,et al.Long-term defaunation increases the abundance of cellulolyticRuminococciandMethanogensbut does not affect the bacterial and methanogen diversity in the rumen of sheep[J].Journal of Animal Science,2011,89(3):783-791.

[20] BEIJER W H.Methane fermentation in the rumen of cattle[J].Nature,1952,170:576-577.

[21] YANAGITA K,KAMAGATA Y,KAWAHARASAKI M,et al.Phylogenetic analysis of methanogens in sheep rumen ecosystem and detection ofMethanomicrobiummobile by fluorescenceinsituhybridization[J].Bioscience Biotechnology and Biochemistry,2000,64(8):1737-1742.

[22] SOLIVA C R,MEILE L,HINDRICHSEN I K,et al.Myristic acid supports the immediate inhibitory effect of lauric acid on ruminal methanogens and methane release[J].Anaerobe,2004,10(5):269-276.

[23] OHENE-ADJEI S,TEATHER R M,IVAN M,et al.Postinoculation protozoan establishment and association patterns of methanogenic archaea in the ovine rumen[J].Applied and Environmental Microbiology,2007,73(14):4609-4618.

[24] LEAHY S C,KELLY W J,ALTERMANN E,et al.The genome sequence of the rumen methanogenMethanobrevibacterruminantiumreveals new possibilities for controlling ruminant methane emissions[J].PLoS One,2010,5(1):e8926.

[25] KIRSCHKE S,BOUSQUET P,CIAIS P,et al.Three decades of global methane sources and sinks[J].Nature Geoscience,2013,6(10):813-823.

[26] 馮仰廉.反芻動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)學(xué)[M].科學(xué)出版社,2004.

[27] SYLVESTER J T,KARNATI S K,YU Z,et al.Development of an assay to quantify rumen ciliate protozoal biomass in cows using real-time PCR[J].Journal of Nutrition,2004,134(12):3378-3384.

[28] SKILLMAN L C,TOOVEY A F,WILLIAMS A J,et al.Development and validation of a real-time PCR method to quantify rumen protozoa and examination of variability betweenEntodiniumpopulations in sheep offered a hay-based diet[J].Applied and Environmental Microbiology,2006,72(1):200-206.

[29] TYMENSEN L,BARKLEY C,MCALLISTER T A.Relative diversity and community structure analysis of rumen protozoa according to T-RFLP and microscopic methods[J].Journal of Microbial Methods,2012,88(1):1-6.

[30] MCSWEENEY C S,DENMAN S E,WRIGHT A D G,et al.Application of recent DNA/RNA-based techniques in rumen ecology[J].Asian-Australasian Journal of Animal Sciences,2007,20(2):283-294.

[31] GARCIA-MARTINEZ J,ACINAS S G,ANTON A I,et al.Use of the 16S-23S ribosomal genes spacer region in studies of prokaryotic diversity[J].Journal of Microbial Methods,1999,36(1-2):55-64.

[32] DENMAN S E,NICHOLSON M J,BROOKMAN J L,et al.Detection and monitoring of anaerobic rumen fungi using an ARISA method[J].Letters in Applied Microbiology,2008,47(6):492-499.

[33] GRIFFITH G W,BAKER S,FLIEGEROVA K,et al.Anaerobic fungi:Neocallimastigomycota[J].IMA Fungus,2010,1(2):181-185.

[34] LIGGENSTOFFER A S,YOUSSEF N H,COUGER M B,et al.Phylogenetic diversity and community structure of anaerobic gut fungi (phylumNeocallimastigomycota) in ruminant and non-ruminant herbivores[J].ISME Journal,2010,4(10):1225-1235.

[35] YOUSSEF N H,COUGER M B,STRUCHTEMEYER C G,et al. The genome of the anaerobic fungusOrpinomycessp. strain C1A reveals the unique evolutionary history of a remarkable plant biomass degrader[J].Applied and Enviromental Microbiology,2013,79(15):4620-4634.

[36] OZKOSE E, THOMAS B J,DAVIES D R,et al.Cyllamycesaberensisgen. nov. sp. nov.,a new anaerobic gut fungus with branched sporangiophores isolated from cattle[J].Canadian Journal of Botany-Revue Canadienne de Botanique,2001,79(6):666-673.

[37] BERG M M,YEOMAN C J,CHIA N,et al.Phage-bacteria relationships and CRISPR elements revealed by a metagenomic survey of the rumen microbiome[J].Environmental Microbiology,2012,14(1):207-227.

[38] CHAUCHEYRAS-DURAND F,MASSEGLIA S,FONTY G,et al.Influence of the composition of the cellulolytic flora on the development of hydrogenotrophic microorganisms, hydrogen utilization, and methane production in the rumens of gnotobiotically reared lambs[J].Applied and Environmental Microbiology,2010,76(24):7931-7937.

[39] FONTY G,GOUET P,RATEFIARIVELO H,et al.Establishment ofBacteroidessuccinogenesand measurement of the main digestive parameters in the rumen of gnotoxenic lambs[J].Canadian Journal of Microbiology,1988,34(8):938-946.

[40] FONTY G,GOUET P,JOUANY J P,et al.Ecological factors determining establishment of cellulolytic bacteria and protozoa in the rumens of meroxenic lambs[J].Journal of General and Applied Microbiology,1983,129(1):213-223.

[41] JAMI E,ISRAEL A,KOTSER A,et al.Exploring the bovine rumen bacterial community from birth to adulthood[J].ISME Journal,2013,7(6):1069-1079.

*Corresponding author, professor, E-mail: diaoqiyu@caas.cn

(責(zé)任編輯 王智航)

Rumial Microbes: Diversity and Quantification

MA Tao DIAO Qiyu*

(FeedResearchInstitute,ChineseAcademyofAgriculturalSciences,KeyLaboratoryofFeedBiotechnologyoftheMinistryofAgriculture,Beijing100081,China)

Ruminants are able to utilize fibrous feed as a source of energy and nutrients due to the ruminal microbes, composed mainly of bacteria, fungi, and ciliate protozoa. Ruminal microbes play different roles in feed digestion and act synergistically to ferment dietary carbohydrates and proteins. This review reported the latest methods for assessment of ruminal microbial diversity, particularly molecular techniques, which allows people to gain new insights into rumen functions. [ChineseJournalofAnimalNutrition, 2015, 27(12)：3649-3654]

ruminal microbes; bacteria; archaea; anaerobic fungi; protozoa

10.3969/j.issn.1006-267x.2015.12.001

2015-07-02

農(nóng)業(yè)部公益性行業(yè)(農(nóng)業(yè))科研專項(xiàng)“南方地區(qū)幼齡草食畜禽飼養(yǎng)技術(shù)研究”(201303143)；國(guó)家肉羊產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)專項(xiàng)資金(CARS-39)

馬 濤(1986—)，男，山東青島人，博士，從事反芻動(dòng)物生理營(yíng)養(yǎng)研究。E-mail： matao@caas.cn

*通信作者：刁其玉，教授，博士生導(dǎo)師，E-mail： diaoqiyu@caas.cn

S823;S826

A

1006-267X(2015)12-3649-06