寇建平，孫亞妮，趙 欽，周恩民＊

（1.農(nóng)業(yè)部優(yōu)質(zhì)農(nóng)產(chǎn)品開發(fā)服務(wù)中心，北京100020；2.西北農(nóng)林科技大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院，農(nóng)業(yè)部獸用藥物與獸醫(yī)生物技術(shù)陜西科學(xué)觀測實驗站，陜西楊凌712100）

RNA 干擾（RNA interference，RNAi）是指一種分子生物學(xué)上由雙鏈RNA 誘發(fā)的基因沉默現(xiàn)象，其機制是通過阻礙特定基因的翻譯或轉(zhuǎn)錄來抑制基因表達。小RNA（microRNA，miRNA）能夠識別特定的靶mRNA，通過降解或抑制mRNA，從而負(fù)調(diào)控靶基因的表達［1］。根據(jù)miRNA 前體分子結(jié)構(gòu)特點而設(shè)計并合成的人工miRNA 也可以在體內(nèi)通過與內(nèi)源miRNA 相同或相似的途徑發(fā)揮RNAi作用，目前人工miRNA 技術(shù)已成功的應(yīng)用于調(diào)控基因表達以及抗病毒領(lǐng)域［2－5］。由于其在抗病毒領(lǐng)域的突出優(yōu)勢，目前以人工miRNA 介導(dǎo)的RNAi技術(shù)為基礎(chǔ)的抗病轉(zhuǎn)基因動物的研究具有廣泛的發(fā)展應(yīng)用前景［6］。然而隨著人們對轉(zhuǎn)基因動物及其產(chǎn)品的日益關(guān)注，其安全性也逐漸進入人們的視野，其核心問題集中于環(huán)境安全、動物健康與福利、人類健康與食品安全等方面。

非肌肉肌球蛋白重鏈Ⅱ－A 亞型（non－muscle myosin Ⅱ－A，NMHCⅡ－A）是與豬繁殖與呼吸綜合征病毒（Porcine reproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV）感染有關(guān)的細胞蛋白之一。體外試驗證實，通過RNAi技術(shù)敲低NMHCⅡ－A的表達可以降低PRRSV 在易感細胞內(nèi)的增殖［7］。同時通過將構(gòu)建的重組表達質(zhì)粒pcDNA 6.2－miRNMHCⅡ－A 注射豬體內(nèi)敲低肺臟巨噬細胞的NMHCⅡ－A 表達后，也可以部分抵抗PRRSV 的感染［8］。但是，pcDNA6.2－miRNMHCⅡ－A 作為一種外源性DNA 進入動物體后的環(huán)境安全性是其從實驗室走向臨床應(yīng)用必須解決的一個關(guān)鍵性問題。因此，本研究著重綜述了NMHCⅡ－A 人工miRNA 重組表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)入豬體內(nèi)之后，對環(huán)境安全的影響，為NMHCⅡ－A 人工miRNA 轉(zhuǎn)基因豬的環(huán)境安全管理和可持續(xù)發(fā)展提供參考。

1 動物逃逸對環(huán)境的影響

轉(zhuǎn)基因動物一旦逃逸到環(huán)境中，它對環(huán)境的潛在危害包括生物多樣性的影響［9］、對其他動物生存的威脅［10］、傳 播 疾 ?。?1］、打 破 生 態(tài) 平 衡［12］等 可 能性，但已有相關(guān)報道認(rèn)為，轉(zhuǎn)基因動物中昆蟲逃逸的可能性是最大的，其次是魚類，轉(zhuǎn)基因家畜相對說逃逸的可能性最?。?3］。就目前的研究水平來說，即使對于轉(zhuǎn)基因昆蟲和魚類這樣一些逃逸可能性最大的動物來說，也可通過物理、生理和生物等技術(shù)手段來綜合控制。轉(zhuǎn)基因魚類尚且如此，那么轉(zhuǎn)基因豬逃逸對環(huán)境的影響具有很高的可控性。我們對NMHCⅡ－A 人工miRNA 免疫和未免疫豬豬圈之間設(shè)立通道，允許被免疫豬“逃逸”到未免疫豬群中，發(fā)現(xiàn)被免疫豬并沒有影響未免疫豬正常的生存和生長發(fā)育，并且豬圈的土壤、飲水和飼料中也沒有轉(zhuǎn)入基因的存在。所以退一步講，即使NMHCⅡ－A 人工miRNA 免疫豬發(fā)生了逃逸，對于環(huán)境來講也是安全的，更何況目前對于豬的養(yǎng)殖模式主要還是以規(guī)?；B(yǎng)殖和圈養(yǎng)為主，所以可通過物理等控制措施從源頭上遏制其逃逸。

2 NMHCⅡ－A 人工miRNA 重組表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)入豬體后通過基因水平轉(zhuǎn)移方式對環(huán)境釋放安全的影響

基 因 水 平 轉(zhuǎn) 移 （horizontal gene transfer，HGT）是生物安全研究中很受關(guān)注的問題。HGT常見于微生物之間，植物和動物雖然發(fā)生HGT 的現(xiàn)象很少，但也存在HGT 的可能性，比如轉(zhuǎn)基因動物有可能會通過腸道系統(tǒng)將外源基因轉(zhuǎn)入腸道菌中；轉(zhuǎn)基因動物在飼養(yǎng)過程中有可能會通過接觸、交配、分娩和泌乳等行為產(chǎn)生HGT 現(xiàn)象。

2.1 通過排泄物發(fā)生HGT 可能性分析

轉(zhuǎn)基因動物的排泄物是轉(zhuǎn)基因動物對環(huán)境造成影響的直接因素之一。轉(zhuǎn)基因動物中的外源基因有可能與動物自身腸道微生物發(fā)生基因交換重組，從而形成新的微生物群落，隨著糞便和尿液排放到環(huán)境中，產(chǎn)生新的致病微生物危害人類健康和環(huán)境安全［14］。中國農(nóng)業(yè)大學(xué)趙杰、許建香等已發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因豬和轉(zhuǎn)基因牛的腸道和周圍環(huán)境中均不會發(fā)生外源基因的HGT 現(xiàn) 象［14－16］。利用PCR－DGGE 聯(lián) 合16 S rDNA 測序技術(shù)對NMHCⅡ－A 人工miRNA 免疫豬的腸道內(nèi)微生物結(jié)構(gòu)進行分析，并未發(fā)現(xiàn)外源基因水平轉(zhuǎn)移到腸道菌，同時NMHCⅡ－A 人工miRNA 重組表達質(zhì)粒pcDNA6.2－miRNMHCⅡ－A免疫豬后不同時間，糞便和尿液中均不含有外源基因，轉(zhuǎn)入的NMHCⅡ－A 人工miRNA 重組表達質(zhì)?；虿]有發(fā)生HGT 而漂移到腸道菌，也沒有隨著排泄物排出體外。因此，NMHCⅡ－A 人工miRNA 免疫豬后，轉(zhuǎn)入基因不會通過排泄物對環(huán)境安全造成威脅。

2.2 通過物理接觸發(fā)生HGT 可能性分析

轉(zhuǎn)基因動物在飼養(yǎng)過程中有可能會通過接觸、交配等行為產(chǎn)生HGT 現(xiàn)象。NMHCⅡ－A 人工miRNA 重組表達質(zhì)粒pcDNA6.2－miRNMHCⅡ－A基因是否會通過豬之間的物理接觸發(fā)生HGT 也是我們所關(guān)心的問題之一。Wheeler M B等［17］已通過轉(zhuǎn)基因豬實驗證明轉(zhuǎn)基因豬不會通過物理接觸將外源基因轉(zhuǎn)移到生活在同一環(huán)境中的非轉(zhuǎn)基因豬中。pcDNA6.2－miRNMHCⅡ－A 免疫豬合群至未免疫豬群中，合群后不同時間，免疫豬和未免疫豬的口鼻分泌物和精液中、未免疫豬群的糞便、尿液、血液和內(nèi)臟中均無轉(zhuǎn)入基因的存在；而且未免疫豬的生長發(fā)育并未收到明顯影響。因此，轉(zhuǎn)NMHCⅡ－A 人工miRNA 豬同樣也不會通過平時的物理接觸而發(fā)生HGT 對周圍健康非免疫豬產(chǎn)生不良影響。

3 NMHCⅡ－A 人工miRNA 基因在宿主體內(nèi)的殘留時間和分布

人工miRNA 轉(zhuǎn)入動物體內(nèi)之后，在動物體內(nèi)的殘留時間和組織分布也是威脅環(huán)境和其他物種安全的一個重要因素。已有的研究表明對于以肌肉注射方式免疫的動物，轉(zhuǎn)入基因在短時間內(nèi)會在注射部位和血液內(nèi)有殘留，但是一段時間后會逐漸消失，在其他組織器官均無分布。質(zhì)粒在體內(nèi)的停留時間與動物種屬、代謝情況、免疫方法和次數(shù)具有相關(guān)性［18－21］。NMHCⅡ－A 人 工miRNA 重 組 表 達 質(zhì) 粒pcDNA6.2－miRNMHCⅡ－A 以肌肉注射方式免疫豬24h 后，接種部位肌肉組織能檢測到質(zhì)粒的存在，而在其余組織的DNA 中均未檢測出，這提示質(zhì)粒在注射后數(shù)小時內(nèi)還沒有通過血液或淋巴循環(huán)分布到其他組織。在注射1d后，1頭豬的注射部位肌肉和血液的基因組DNA 中檢測出了質(zhì)粒DNA 基因的存在，15d后，所有組織中都檢測不到質(zhì)粒的存在，說明質(zhì)粒進入體內(nèi)后經(jīng)過一段時間后大部分會被代謝降解，而自始至終在被免疫豬的其他組織臟器中均未檢測到轉(zhuǎn)入基因的存在。

4 NMHCⅡ－A 人工miRNA 與宿主細胞基因組發(fā)生整合的可能性分析

重組表達質(zhì)粒作為外源基因轉(zhuǎn)入豬體內(nèi)從實驗室走向臨床必須解決的另一個重要問題是用質(zhì)粒DNA 免疫動物后是否會整合到宿主細胞基因組中［22］，對環(huán)境安全和人類健康造成威脅。重組表達質(zhì)粒存在于動物體內(nèi)有兩種可能，一種是以游離質(zhì)粒形式存在，另一種是重組表達質(zhì)粒整合入宿主DNA 上。為消除染色體外游離質(zhì)粒DNA 的污染，我們將制備好的免疫組豬的基因組DNA 進行純化回收，然后對各組織定量后進行PCR 擴增。哺乳動物染色體組中的基因在不斷地發(fā)生自發(fā)突變，只要其發(fā)生的頻率對于每個基因來說不超過1×10－6，就不會對動物的遺傳和健康造成影響［23］。本研究在免疫豬的所有組織臟器，包括注射部位肌肉組織的1μg基因組DNA 中未檢測到重組表達質(zhì)?；?，這說明1μg基因組DNA 中存在質(zhì)粒數(shù)量小于15.6個拷貝，如果所有質(zhì)粒都整合入gDNA 上而產(chǎn)生突變，按哺乳動物基因組大小為3×109估算，1μg基因組DNA 約相當(dāng)于1.6×105個細胞，按每個細胞有3×104個基因估算，導(dǎo)致的突變率約為2×10－9，相對于自發(fā)突變率2×10－6，僅為其千分之一［24］；此外，質(zhì)粒DNA 和宿主DNA 可能是以插入和同源重組方式發(fā)生整合，但大量試驗表明，有質(zhì)粒DNA 以插入方式的概率極小，而同源重組整合雙方必須有大于600bp高度同源的片段，所以發(fā)生外源DNA重組整合的可能性也是很低的。因此，可以認(rèn)為在未經(jīng)純化處理的注射部位肌肉組織DNA 中檢測到的pcDNA6.2－miRNMHCⅡ－A 基因是以游離質(zhì)粒的方式存在于組織之內(nèi)，而不是與豬的基因組發(fā)生整合。所以，NMHCⅡ－A 人工miRNA 重組表達質(zhì)粒pcDNA6.2－miRNMHCⅡ－A 免疫豬，轉(zhuǎn)入基因不可能整合入豬細胞的基因組中。

研究表明，將NMHCⅡ－A 人工miRNA 轉(zhuǎn)入豬體內(nèi)，可以通過利用針對NMHCⅡ－A 的miRNA 對NMHCⅡ－A 基因表達進行沉默，從而降低PRRSV在豬體內(nèi)的增殖，提高豬抗PRRSV 感染的能力；同時NMHCⅡ－A 人工miRNA 轉(zhuǎn)入豬體內(nèi)之后，對于環(huán)境釋放來講是安全的，這就為利用NMHCⅡ－A人工miRNA 轉(zhuǎn)基因豬技術(shù)培育抗PRRSV 豬新品種奠定基礎(chǔ)和提供科學(xué)支持。

［1］ O′Donnell K A，Wentzel E A，Zeller K I，et al.c－Myc－regulated microRNAs modulate E2F1expression［J］.Nature，2005，435（7043）：839－843.

［2］ Bhomia M，Sharma A，Gayen M，et al.Artificial microRNAs can effectively inhibit replication of Venezuelan equine encephalitis virus［J］.Antiviral Res，2013，100（2）：429－434.

［3］ 謝佩雯，張秀娟，黃 海，等.利用人工miRNA 技術(shù)建立甲胎蛋白穩(wěn)定沉默肝癌細胞及沉默效果評價［J］.醫(yī)學(xué)綜述，2013，19（10）：1865－1868.

［4］ 褚麗莎，韓 娜，宋向陽，等.誘導(dǎo)型eIF3g人工microRNA表達載體的構(gòu)建及應(yīng)用［J］.細胞與分子免疫學(xué)雜志，2011，27（2）：135－138.

［5］ Song H，Jiang C，Sun H.Construction and screening of the artificial miRNA plasmids targeting porcine Toll－like receptor 7 gene［J］.細胞與分子免疫學(xué)雜志，2013，29（1）：18－21.

［6］ 索朗拉姆.轉(zhuǎn)基因技術(shù)提高動物生產(chǎn)性能的研究進展［J］.動物醫(yī)學(xué)進展，2011，32（4）：103－107.

［7］ Zhou E M，Xiao Y，Shi Y，et al.Generation of internal image monoclonal anti－idiotypic antibodies against idiotypic antibodies to GP5antigen of porcine reproductive and respiratory syndrome virus［J］.J Virol Meth，2008，49（2）：300－308.

［8］ 高繼明.非肌肉肌球蛋白重鏈Ⅱ－A 在PRRSV 感染細胞中的作用研究［D］.山東泰安：山東農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院預(yù)防獸醫(yī)系，2012.

［9］ Hone J.Feral pigs in Namadgi National Park，Australia：dynamic，impacts and management［J］.Biol Conserv，2002，105（2）：231－242.

［10］ Kapuscinski A R，Hallernan E M.Transgenic fish and publicpolicy－anticipating environmental impacts of transgenic fish［J］.Fisheries，1990，15（1）：2－11.

［11］ Tiedje J M，Colwell R K，Grossman Y L，et al.The planned introduction of genetically engineered organisms－ecological considerations and recommendations［J］.Ecology，1989，70（2）：298－315.

［12］ Pimm S L.The complexity and stability of ecosystems［J］.Nature，1984，307（5949）：321－326.

［13］ Muir W M，Howard R D.Assessment of possible ecological risks and hazards of transgenic fish with implications for other sexually reproducing organisms［J］.Transgenic Res，2002，11（2）：101－114.

［14］ Xu J X，Zhao J，Zhao Y F，et al.Molecular－based environmental risk assessment of three varieties of genetically engineered cows［J］.Transgenic Res，2011，20（5）：1043－1054.

［15］ Zhao J，Xu J X，Wang J W，et al.The environmental risk assessment of hLYZ transgenic pigs.Recent advances in animal genetic and breeding research－the 16th national annual conference for animal genetic and breeding［C］.Yangzhou：Chinese Association of Animal Science and Veterinary Medicine，2011.

［16］ Xin L L.Environment safety assessment of appA and MX1 cotransgenic pigs［D］.Beijing：Chinese Academy of Agricultural Sciences，2011.

［17］ Wheeler M B，Hurley W L，Mosley J，et al.Risk analysis of alpha－lactalbumin transgene transfer to non－transgenic control pigs during rearing，breeding，parturition and lactation［J］.Transgenic Res，2010，19（1）：136－137.

［18］ 靳彥文，鐘 輝，馬清鈞.惡性瘧原蟲DNA 疫苗的安全性研究［C］.中國生物工程學(xué)會全國會員代表大會暨學(xué)術(shù)討論會論文摘要集，2001.

［19］ Margaret M，Morris－Downes，Kerry V，et al.Scmliki forest virus based vaccines：persistence，distribution and pathological analysis in two animal systems［J］.Vaccine，2001，19：1978－1988.

［20］ Suezanne E P.Particle－mediated nucleic acid immuniztion［J］.Human Gene Therapy，1999，10：741－758.

［21］ Terrie M.Immunostimulatory DNA immunization sequences necessary for effective introdemal gene［J］.Human Gene Therapy，1999，10：759－768.

［22］ Kurth R.Risk potential of the chromosomal insertion of foreign DNA［J］.Dev Biol Stand，1998，93：45－56.

［23］ Haworth R，Pilling A M.The PCR assay in the preclinical safety evaluation of nucleic acid medicines［J］.Hum Exp Toxicol，2000，9（5）：267－276.

［24］ Nichols W W，Ledwith B J，Manam S V，et al.Potentisl DNA vaccine integration into host cell genome［J］.Ann of Nei York Acad Sci，1995，772：30－39.