王 雪，孟慶峰，劉新欣，王 琪，姚貴哲，王偉利，＊

（1.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，吉林長春130118；2.吉林出入境檢驗(yàn)檢疫局，吉林長春130062）

新孢子蟲是一種頂覆門專性細(xì)胞內(nèi)寄生蟲，最早由Bjerkas I等［1］在患腦膜炎和肌炎的幼犬中發(fā)現(xiàn)，由Dubey J P 等［2］命名為新孢子蟲。新孢子蟲可感染犬、牛、羊等多種溫血?jiǎng)游?，是引起母牛流產(chǎn)的主要原因，因此，新孢子蟲病是一個(gè)獸醫(yī)學(xué)上的嚴(yán)重問題，在經(jīng)濟(jì)學(xué)上也具有重要意義。新孢子蟲感染宿主細(xì)胞主要包括黏附和入侵兩個(gè)過程。在這個(gè)過程中，蟲體內(nèi)的細(xì)胞器及其所所分泌的抗原起到重要的重要。首先細(xì)胞表面因子暴露的瞬間引起新孢子蟲微線體分泌相關(guān)蛋白，開始其黏附過程［3］，微線體蛋白與宿主細(xì)胞膜上的相應(yīng)受體結(jié)合形成可以移動(dòng)的連接區(qū)域，然后，棒狀體分泌相關(guān)蛋白修飾宿主細(xì)胞，開始侵入細(xì)胞。在侵入的過程中，蟲體形態(tài)不變，宿主細(xì)胞內(nèi)陷形成納蟲空泡，使蟲體居于其中，隨后蟲體棒狀體蛋白、致密顆粒蛋白及一些其他因子對(duì)納蟲泡膜進(jìn)行修飾，使其可以避免宿主細(xì)胞對(duì)納蟲泡的裂解作用。新孢子蟲速殖子在納蟲空泡中進(jìn)行繁殖2d～3d后，細(xì)胞破裂，新孢子蟲速殖子進(jìn)行下一輪的入侵。在此過程中，蟲體表面抗原、棒狀體蛋白、微線體蛋白、致密顆粒蛋白等都起著至關(guān)重要的作用［4］。新孢子蟲入侵宿主細(xì)胞后，引起其細(xì)胞免疫反應(yīng)及體液免疫反應(yīng)。細(xì)胞免疫反應(yīng)主要是新孢子蟲的特異性抗原被抗原遞呈細(xì)胞所識(shí)別并活T 細(xì)胞，使其中CD4＋T 淋巴細(xì)胞中的Th1 及Th2細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子發(fā)生改變。新孢子蟲的體液免疫主要是IgG 抗體水平發(fā)生改變，所以新孢子蟲疫苗的研究主要是對(duì)新孢子蟲特異性抗原引起細(xì)胞免疫反應(yīng)及體液免疫反應(yīng)進(jìn)行評(píng)估［5］。

新孢子蟲是引起世界范圍內(nèi)牛流產(chǎn)的主要原因之一，目前最有效的防治方法是通過對(duì)檢測后確定感染及疑似患病的動(dòng)物進(jìn)行淘汰，建立無新孢子蟲感染的牛群，但是處置造成的損失同樣不可估量。因此，有必要建立一種有效的疫苗防止新孢子蟲的傳播。新孢子蟲疫苗主要是抑制新孢子蟲對(duì)宿主細(xì)胞的感染，并對(duì)宿主細(xì)胞提供一定的保護(hù)。現(xiàn)在已經(jīng)研究的疫苗方法主要有滅活疫苗、弱毒疫苗、基因工程亞單位疫苗、基因疫苗、活載體疫苗等方面的研究并取得了很大突破。論文主要對(duì)新孢子蟲在黏附入侵過程中分泌的抗原蛋白及根據(jù)其研制的疫苗進(jìn)行概括。

1 新孢子蟲抗原

1.1 蟲體表面抗原

新孢子蟲的蟲體表面抗原主要有NcSAG1、Nc－SRS2、NcP0、p38、NcP29 和NcP40等蛋白［6］。Nc－SAG1與NcSRS2 是新孢子蟲重要的蟲體表面抗原，NcSAG1僅在速殖子階段表達(dá)，NcSRS2在速殖子與緩殖子階段均表達(dá)，它們?cè)诮閷?dǎo)蟲體入侵細(xì)胞中起到重要的作用［5］。NcSAG1與NcSRS2是免疫與檢測試驗(yàn)中常用的抗原，它們具有較好的免疫原性，以其制備的重組疫苗可有效阻斷新孢子蟲對(duì)小鼠的入侵［7］。NcSAG4 在緩殖子階段表達(dá)的蛋白，在新孢子蟲感染細(xì)胞的周期中始終持續(xù)存在［8］。高建偉等人用P0基因制備DNA 疫苗，證明DNA 疫苗能夠激起細(xì)胞免疫反應(yīng)，具有很好的保護(hù)原性［11］。楊濱僮等人用PCR 方法擴(kuò)增P40 基因，構(gòu)建pET－28a－P40質(zhì)粒并成功在大腸埃希菌Rosseta（DE3）中表達(dá)，證明了P40基因具有很好的免疫原性，可以作為疫苗的候選基因［9］。

1.2 致密顆?？乖?/h3>

致密顆粒蛋白GRA 在形成帶蟲空泡時(shí)起到重要的作用，目前已經(jīng)被評(píng)價(jià)為候選抗原的有NcGRA1，NcGRA2，NcGRA6，NcGRA7 以及Nc－MAG1等［10］。賈立軍等［11］用NcGRA7蛋白基因構(gòu)建重組質(zhì)粒pMD18－NcGRA7，并應(yīng)用SDS－PAGE及Western blot方法對(duì)其進(jìn)行分析，證明其具有很好的免疫原性，可以作為疫苗的候選基因。金春梅等［12］對(duì)NcGRA2t基因進(jìn)行克隆測序，通過對(duì)其編碼蛋白進(jìn)行分析，說明其編碼蛋白具有很強(qiáng)的抗原性，可以做為疫苗的候選基因。MAG1在蟲體黏附細(xì)胞過程中具有一定的介導(dǎo)作用，焦石對(duì)其進(jìn)行克隆分析，并用其與γ 干擾素基因融合，構(gòu)建重組質(zhì)粒，證明其具有一定的免疫原性，為其疫苗的研究提供一定的理論基礎(chǔ)［13］。NcGRA14是長為1 215bp無內(nèi)含子的基因，是新發(fā)現(xiàn)的一種致密顆粒蛋白，其免疫原性至今還沒有確定［14］。

1.3 微線抗原

微線蛋白是由新孢子蟲頂端的微線體分泌的一類蛋白，目前已知微線抗原蛋白主要有NcMIC1、NcMIC2、NcMIC3、NcMIC4及NcMIC10等。Yin J G 等［15］重組NcMIC10蛋白在大腸埃希菌中進(jìn)行表達(dá)，并針對(duì)該蛋白的非重疊片段制備多克隆抗體，然后用ELISA 方法檢測山羊血清中的抗體，對(duì)現(xiàn)有的抗原進(jìn)行補(bǔ)充。AMA1是由微線分泌的頂膜抗原，是典型跨膜蛋白，在入侵對(duì)宿主細(xì)胞過程中具有一定的介導(dǎo)作用。郭煥平等［16］構(gòu)建pMD18T－NcAMA 重組克隆質(zhì)粒并克隆到腺病毒中，為以病毒為載體的新孢子蟲重組疫苗提供依據(jù)。Srinivasan S以RIBI為佐劑，用重組NcMIC4蛋白免疫小鼠，可以引起體液免疫應(yīng)答，IgG1 水平明顯升高，同時(shí)減少新孢子蟲對(duì)腦的感染性，NcMIC4 可以以作為疫苗的候選基因［17］。

1.4 棒狀體抗原

棒狀體蛋白在新孢子蟲蟲體入侵及對(duì)納蟲空泡進(jìn)行修飾的過程中起到了重要作用。目前已知的棒狀體 蛋 白 主 要 有NcROP1、NcROP2、NcROP3、NcROP4、NcROP8及NcROP30?，F(xiàn)在研究比較多的是NcROP2 蛋白，也是確定的疫苗候選抗原之一。Debachea K 將NcROP2基因在大腸埃希菌中表達(dá)形成重組蛋白recNcROP2并與乳化的弗氏不完全佐劑接種到已經(jīng)感染新孢子蟲的小鼠體內(nèi)，結(jié)果是接種重組蛋白的小鼠存活率比較高，其IgG 水平明顯升高，說明其對(duì)新孢子蟲具有一定的免疫作用［18］。新孢子蟲的大部分基因都與弓形蟲相似，有研究說明，棒狀體蛋白可能與新孢子蟲的毒力有關(guān)。Lei T 用弓形蟲的TgROP18基因轉(zhuǎn)染新孢子蟲上，構(gòu)建Nc1－TgROP18，然后對(duì)其毒力進(jìn)行分析，轉(zhuǎn)基因的新孢子蟲比野生新孢子蟲的毒力強(qiáng)，確定ROP18是弓形蟲與新孢子蟲毒力差異的關(guān)鍵因素［19］，并且可能與新孢子蟲入侵宿主細(xì)胞并在宿主細(xì)胞內(nèi)繁殖有關(guān)。

2 新孢子蟲疫苗

2.1 滅活苗

滅活苗是指通過對(duì)蟲體進(jìn)行一定的處理使其失活，失去感染力和致病力，但保留其組成成分而制成的疫苗，具有安全性高、無毒力返祖現(xiàn)象等優(yōu)點(diǎn)，但它不能激活細(xì)胞的免疫反應(yīng)，并且在滅活過程中可能會(huì)導(dǎo)致一些保護(hù)性抗原缺失［5］。Andrianarivo A G 等［20］研 制 出 一 種 疫 苗，該 疫 苗 用Havlogen 和Polygen兩種佐劑滅活新孢子蟲的速殖子，Polygen能夠引起機(jī)體較高的抗體水平，具有較好的免疫原性，但是Polygen是否對(duì)γ干擾素具有很強(qiáng)的刺激，目前還未明確，雖其不能預(yù)防妊娠奶牛的垂直傳播，但通過靜脈注射或肌肉注射能夠達(dá)到一定的預(yù)防作用。Rojo－Montejoa S等用3種不同的佐劑滅活速殖子及3種不同蟲體的數(shù)量來免疫小鼠，發(fā)現(xiàn)氫氧化鋁與CpG 寡核苷酸的混合佐劑能夠防止新孢子蟲病慢性階段，阻止新孢子蟲在大腦中增值。而且研究表明了不同佐劑使疫苗的療效發(fā)生變化［21］。

2.2 弱毒苗

弱毒苗又稱弱毒活疫苗，是一種病原致病力減弱但仍具有活力的完整病原疫苗，也就是用人工致弱或自然篩選的弱毒株，經(jīng)培養(yǎng)后制備的疫苗。此類疫苗可以刺激機(jī)體產(chǎn)生體液免疫應(yīng)答和細(xì)胞免疫應(yīng)答等多種保護(hù)性反應(yīng)。Marugán－Hernández V等［22］應(yīng)用Nc－1株的SAG4c1.1、轉(zhuǎn)基因SAG4c2.1及野生Nc－1（WT）株制備活疫苗，并對(duì)已感染新孢子蟲的懷孕小鼠進(jìn)行免疫，小鼠病死率為40%、7%和5.6%，產(chǎn)后病死率分別為45%，11.1%和10.8%，證明了野生Nc－1（WT）株制備的弱毒苗對(duì)懷孕小鼠的免疫效果最好，也說明野生毒株的毒力弱。Rojo－Montejo S等［23］分離無毒力Nc－Spain 1H株，用5×105個(gè)活的Nc－Spain 1H 速殖子免疫小鼠，新生兒的病死率降低為2.4%，并激發(fā)Th1型免疫，將速殖子進(jìn)行10倍稀釋，低濃度速殖子可以引起IgG2a水平升高，高濃度速殖子能夠引起IgG1升高，表明Nc－Spain 1H 能夠防治新孢子蟲病。但是目前還沒有弱毒活疫苗可以用于預(yù)防新孢子蟲的感染，一是因?yàn)槿醵久缫蕾囉隗w外細(xì)胞培養(yǎng)，需要大量的勞動(dòng)力；二是已經(jīng)用于預(yù)防牛流產(chǎn)的弱毒活疫苗，均導(dǎo)致了懷孕母牛流產(chǎn)，同時(shí)顯示了活疫苗對(duì)孕畜具有一定的威脅。在此看來重組蛋白苗及亞單位疫苗對(duì)預(yù)防新孢子蟲更具有吸引力和潛力［24］。

2.3 重組蛋白疫苗

重組蛋白疫苗是指將新孢子蟲的目的抗原基因構(gòu)建在表達(dá)載體上，將已構(gòu)建的表達(dá)蛋白載體轉(zhuǎn)化到細(xì)菌中，在一定的誘導(dǎo)條件下，表達(dá)出大量的抗原蛋白，通過純化后制備的疫苗。Hecker Y P等［25］應(yīng)用重組蛋白rNcSAG1、rNcHSP20和rNcGRA7 制備免疫刺激復(fù)合物并對(duì)感染新孢子蟲的懷孕的母牛進(jìn)行皮下注射，發(fā)現(xiàn)rNcSAG1，rNcHSP20 和rNcGRA7 具有一定的免疫原性，但是不能阻止新孢子蟲的垂直傳播。Lv Q 等人重組NcP78 和NcGRA7免疫蛋白并對(duì)Balb／c小鼠進(jìn)行接種，發(fā)現(xiàn)重組的NcP78和NcGRA7能夠引起Th1和Th2免疫應(yīng)答，使IgG1和IgG2a抗體水平升高，此外，重組NcP78和NcGRA7可以減少新孢子蟲在大腦的寄生及繁殖。雖然這些疫苗不能緩解人工流產(chǎn)的癥狀，但是可以增加后代的出生數(shù)量，對(duì)小鼠感染新孢子蟲具有一定的保護(hù)作用［10］。

2.4 基因工程亞單位疫苗

基因工程亞單位疫苗是利用DNA 重組技術(shù)，將編碼病原體的保護(hù)性抗原的基因?qū)朐思?xì)胞或真核細(xì)胞，使其在受體細(xì)胞中高效表達(dá)，分泌具有保護(hù)性的抗原肽鏈。新抱子蟲亞單位疫苗是提取新袍子蟲具有免疫原性的蛋白，加以佐劑制成的［9，26］。Otsuki T 等［27］證 明10 只 桑 蠶 能 夠 表 達(dá)1.7 mg SAG1，17只桑蠶能表達(dá)370μg SRS2，表明桑蠶的表達(dá)系統(tǒng)能大量產(chǎn)生重組抗原應(yīng)用于亞單位疫苗的制備。賈立軍等［28］提取新孢子蟲表面蛋白基因Nc－SAG1，進(jìn)行原核表達(dá)，將經(jīng)Western blot鑒定具有免疫活性的重組蛋白與弗氏佐劑混合制備NcSAG1基因工程亞單位疫苗，并免疫小鼠，檢測抗體檢的OD450nm 值為0.688；CD4＋／CD8＋T 細(xì)胞比值為3.650，均高于對(duì)照組，證明制備的基因工程亞單位疫苗具有一定的免疫效果。高建偉制備的新飽子蟲3種不同佐劑亞單位疫苗按常規(guī)免疫程序免疫小鼠，測得3種佐劑亞單位疫苗的抗體效價(jià)及CD4＋T細(xì)胞均高于對(duì)照組，具有一定的保護(hù)作用［9］。

2.5 核酸疫苗

核酸疫苗分為兩種，即DNA 疫苗和RNA 疫苗，它可被細(xì)胞吸納，并在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)生成疫苗抗原。與傳統(tǒng)疫苗相比，核酸疫苗具有特異性高、安全性好、制備簡單等特點(diǎn)。核酸疫苗既可以誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生保護(hù)性抗體，同時(shí)也可以引起細(xì)胞免疫反應(yīng)，特別是細(xì)胞T 淋巴細(xì)胞（cTL）反應(yīng)。賈文影構(gòu)建新袍子蟲核糖體磷蛋白NcP0真核表達(dá)載體，轉(zhuǎn)染Vero細(xì)胞，獲得大量的pVAX1－NcP0質(zhì)粒并添加佐劑免疫沙鼠，計(jì)算疫苗攻毒后pVAX1－NcP0 組和添加Cp－M 佐劑組的保護(hù)率分別為66.7%和70%，證明新孢子蟲DNA 疫苗能夠激活機(jī)體細(xì)胞及體液免疫反應(yīng)，對(duì)新孢子蟲病具有一定的預(yù)防作用［29］。

2.6 活載體疫苗

載體疫苗是用基因工程技術(shù)將保護(hù)性抗原基因（目的基因）轉(zhuǎn)移到載體中使之表達(dá)的活疫苗。目前有多種理想的病毒載體，如痘病毒、腺病毒和皰疹病毒等都可以用于活載體疫苗的制備。郭煥平構(gòu)建了含有AMA1基因的腺病毒載體疫苗及核酸疫苗，免疫Balb／c小鼠后腺病毒載體疫苗的IgG、IgGI及IgG2a均高于核酸疫苗，在一定程度上激活機(jī)體免疫反應(yīng)［16］。賈立軍以NcSRS2 基因構(gòu)建重組腺病毒，免疫小鼠測抗體效價(jià)為1∶2 048，證實(shí)了Nc－SRS2重組腺病毒可以作為疫苗預(yù)防新孢子蟲病的可行性［30］。

3 展望

新孢子蟲疫苗的研究主要是對(duì)新孢子蟲特異性抗原引起細(xì)胞免疫反應(yīng)及體液免疫反應(yīng)進(jìn)行評(píng)估。綜上所述，確定的可以作為疫苗候選基因的抗原蛋白主要有表面蛋白NcSAG1和NcSRS2；致密顆?？乖鞍譔cGRA1、NcGRA2、NcGRA6、NcGRA7及NcMAG1；微線抗原蛋白NcMIC1、NcMIC3、Nc－MIC4、NcMIC10 和NcAMA1；棒 狀 體 抗 原 蛋 白NcROP2等。

目前有大量的研究人員對(duì)新孢子蟲特異性抗原進(jìn)行篩選并用已知的試驗(yàn)方法測定其免疫原性的制備疫苗?，F(xiàn)在研究比較廣泛的主要有滅活苗、弱毒苗、基因工程亞單位疫苗、重組蛋白苗、核酸疫苗、活載體疫苗等。弱毒疫苗以及滅活疫苗是研究比較早的人疫苗，在一定程度上都有些不可忽視的缺點(diǎn)，因此在預(yù)防新孢子蟲病上不是比較理想的選擇。亞單位疫苗，重組蛋白疫苗以及核酸疫苗具有安全性高，穩(wěn)定性強(qiáng)、制備簡單、運(yùn)輸方便特點(diǎn)，在此看來可能比弱毒疫苗和滅活疫苗對(duì)預(yù)防新更具有開發(fā)力及潛力?；钶d體疫苗是現(xiàn)在一個(gè)研究熱點(diǎn)，但是重復(fù)使用，可能使效果降低，還不是很理想，有待完善。雖然現(xiàn)在關(guān)于疫苗的研究有很多，但是還沒有有效的疫苗被投入市場來預(yù)防新孢子蟲病，但是相信隨著不斷深入的研究，在不久的將來，一定能夠突破難點(diǎn)，最終成為控制新孢子蟲病的重要手段

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