王廬宇，朱長(zhǎng)軍

（天津師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，天津300387）

驅(qū)動(dòng)蛋白Kif18A多克隆抗體的制備、純化及免疫特異性檢測(cè)

王廬宇，朱長(zhǎng)軍

（天津師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，天津300387）

采用標(biāo)簽蛋白誘導(dǎo)表達(dá)純化、蛋白質(zhì)譜、Western Blot、免疫熒光染色等多種分子生物學(xué)與細(xì)胞生物學(xué)方法，探究了一種制備蛋白特異性多克隆抗體、檢測(cè)抗體并且運(yùn)用抗體獲得蛋白翻譯后修飾信息的實(shí)驗(yàn)思路.結(jié)果表明，使用這種方法可以高效地得到Kif18A的兔源多克隆抗體.得到的抗體血清可以很好地應(yīng)用于Western Blot（蛋白免疫印跡）、Co－IP（免疫共沉淀）等分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn).將抗體血清純化后可以應(yīng)用于免疫熒光染色實(shí)驗(yàn)，并可以獲得良好清晰的實(shí)驗(yàn)結(jié)果.此外，利用制備出的Kif18A特異性抗體對(duì)細(xì)胞內(nèi)源性Kif18A進(jìn)行Co－IP實(shí)驗(yàn)后進(jìn)行質(zhì)譜分析，得到了內(nèi)源性Kif18A蛋白翻譯后的修飾信息，為研究Kif18A蛋白的定位與功能奠定了良好的基礎(chǔ).

驅(qū)動(dòng)蛋白Kif18A；多克隆抗體；蛋白質(zhì)譜；蛋白磷酸化

在已知的40余種驅(qū)動(dòng)蛋白（kinesin）分子中，Kif18A蛋白近年來(lái)受到了越來(lái)越多的關(guān)注.在先前的文獻(xiàn)中報(bào)道，Kif18A蛋白分子在體外實(shí)驗(yàn)中證實(shí)具有微管解聚活性.這不同于早期報(bào)道中典型的驅(qū)動(dòng)蛋白分子的特性.先前認(rèn)為驅(qū)動(dòng)蛋白家族分子中有些具有微管解聚酶功能（如Kif2C，即MCAK蛋白），有些可以沿細(xì)胞骨架運(yùn)動(dòng)（如Kif5A）.但是，像Kif18A蛋白這樣兩種功能兼具的分子還比較罕見(jiàn)［1］.近年來(lái)國(guó)際上關(guān)于該蛋白分子的文獻(xiàn)報(bào)道數(shù)量達(dá)到數(shù)十篇，其中最為引人關(guān)注的焦點(diǎn)在于Kif18A蛋白對(duì)于細(xì)胞分裂進(jìn)程的正常進(jìn)行以及紡錘體功能和形態(tài)的影響起到了至關(guān)重要的作用.尤其是Kif18A蛋白在有絲分裂前中期對(duì)于染色體正確排列的重要意義以及Kif18A與細(xì)胞紡錘體中期檢驗(yàn)點(diǎn)的密切關(guān)系更是成了最近5年的研究熱點(diǎn).此外，Kif18A蛋白在某些腫瘤的發(fā)生、發(fā)展或遷移的過(guò)程中都發(fā)揮到了相應(yīng)的作用［2－7］.為了能夠通過(guò)細(xì)胞內(nèi)或細(xì)胞外實(shí)驗(yàn)對(duì)該蛋白分子進(jìn)行深入的研究，必須要得到純度和效價(jià)都極高的特異性Kif18A蛋白抗體，為此，本文設(shè)計(jì)了制備Kif18A特異性抗體的實(shí)驗(yàn)，以滿足實(shí)驗(yàn)室對(duì)于該蛋白分子在細(xì)胞和分子生物學(xué)層面的研究需要.

1 實(shí)驗(yàn)材料與方法

1.1材料

人宮頸癌細(xì)胞HeLa，本實(shí)驗(yàn)室自存；pEGFP－Kif18A（C297）質(zhì)粒為本實(shí)驗(yàn)室先前構(gòu)建；pGEX－KG載體、pET28a載體為本實(shí)驗(yàn)室自存.感受態(tài)大腸桿菌（E.coli）復(fù)制菌株Top10、表達(dá)菌株BL21購(gòu)自TransGen公司.DNA限制性內(nèi)切酶EcoRI和SalI以及T4DNA連接酶購(gòu)自Thermo公司；λ－HindⅢdigest DNA Marker購(gòu)自TaKaRa公司.其他試劑為進(jìn)口原裝、分裝或國(guó)產(chǎn)分析純.DNA測(cè)序工作委托金唯智公司進(jìn)行，蛋白質(zhì)譜分析工作委托軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院國(guó)家生物醫(yī)學(xué)分析中心進(jìn)行.

1.2 GST與His標(biāo)簽融合蛋白表達(dá)質(zhì)粒的制備

驅(qū)動(dòng)蛋白8家族分子靠近C端部分包含多個(gè)結(jié)合功能域且暴露在外，為了得到特異性Kif8A的抗體，實(shí)驗(yàn)中設(shè)計(jì)采用Kif18A蛋白分子C端297個(gè)氨基酸的區(qū)段作為抗原，免疫后得到該蛋白分子的多克隆抗體.前期，本實(shí)驗(yàn)室已制備出pEGFP－Kif18A（C297）的真核表達(dá)質(zhì)粒，本實(shí)驗(yàn)使用限制性內(nèi)切酶EcoRI和SalI將該質(zhì)粒在37℃條件下雙酶切2h，同時(shí)將pGEX－KG載體質(zhì)粒與pET28a載體質(zhì)粒37℃條件下雙酶切2h.隨后在1%瓊脂糖（BIOWEST）凝膠中進(jìn)行電泳，將酶切后的目的基因條帶切下，使用AXYGEN公司的AxyPrep DNA凝膠回收試劑盒將目的基因進(jìn)行回收.使用T4DNA連接酶在16℃條件下將目的基因與載體連接過(guò)夜，從而構(gòu)建出pGEX－KG－Kif18A（C297）（簡(jiǎn)稱GST－KC297）與pET28a－Kif18A（C297）（簡(jiǎn)稱His－KC297）質(zhì)粒，二者在原核表達(dá)體系中分別表達(dá)GST蛋白標(biāo)簽融合蛋白或His標(biāo)簽融合蛋白.

1.3 GST與His標(biāo)簽融合蛋白的表達(dá)

將構(gòu)建得到的原核表達(dá)質(zhì)粒GST－KC297與His－KC297轉(zhuǎn)化入感受態(tài)大腸桿菌復(fù)制菌種Top10，挑選陽(yáng)性單克隆，37℃條件下200r／min培養(yǎng)過(guò)夜.使用QIAGEN公司的DNA提取試劑盒QIAprep Spin Miniprep Kit（250）提純質(zhì)粒，通過(guò)酶切和DNA測(cè)序進(jìn)行鑒定.將提純、鑒定后的原核表達(dá)質(zhì)粒GST－KC297與His－KC297轉(zhuǎn)化入感受態(tài)大腸桿菌表達(dá)菌種BL21，利用IPTG誘導(dǎo)融合蛋白表達(dá)，離心收集細(xì)菌沉淀進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn).

1.4可溶性蛋白抗原的純化

使用L－buffer（5mg／mL Lysozyme，100mmol／L pH＝8.0Tris－Cl，5mmol／L EDTA，20mmol／L β－ME）溶菌后使用T－buffer（2%Triton X－100，50mmol／L pH＝7.5Tris－Cl，150mmol／L NaCl，10mmol／L EDTA，1mmol／L EGTA，1%甘油，2.5mmol／L DTT，1mmol／L PMSF，10μg／mL leupeptin）裂解細(xì)菌，隨后使用超聲破碎儀把細(xì)菌徹底裂解.將Glutathione Sepharose（GE）與細(xì)菌裂解液在4℃條件下充分搖勻12h，使細(xì)菌中表達(dá)的GST－KC297蛋白與Glutathione Sepharose珠子充分結(jié)合.隨后使用E－buffer（100mmol／L pH＝8.0Tris－Cl，5mmol／L EDTA，20mmol／L GSH，20mmol／L β－ME）洗脫GST－KC297蛋白，并使用500～1 000倍洗脫液體積的PBS在4℃條件下透析12h，以除去E－buffer中的谷胱甘肽和洗脫液中其他的有毒成分.

1.5不可溶蛋白的純化與抗原－樹(shù)脂凝膠的制備

將實(shí)驗(yàn)中細(xì)菌誘導(dǎo)表達(dá)的His－KC297采用SDS－buffer（含有2%SDS的PBS緩沖液）裂解，用與裂解液等體積的Triton buffer（含有8%Triton X－100的PBS緩沖液）中和，隨后與Ni－NTA Resin（BIO BASIC INC.）在室溫條件下充分混合搖勻4h，使His－KC297特異性地結(jié)合到樹(shù)脂珠子上.使用DMB將珠子與His－KC297蛋白進(jìn)行共價(jià)交聯(lián)，并使用乙醇胺（0.2mol／L，pH＝8.0）中和，得到抗原－樹(shù)脂交聯(lián)珠子.

1.6抗體血清的純化

使用飽和（NH4）2SO4將血清中免疫球蛋白沉淀，利用1／3血清體積的TBS重懸沉淀的蛋白，隨后使用500倍重懸液體積的TBS在4℃條件下透析12h，以除去殘留的（NH4）2SO4.把透析后的免疫球蛋白（抗體主要為IgG）重懸液與先前實(shí)驗(yàn)中得到的抗原（His－KC297）－樹(shù)脂（Ni－NTA）交聯(lián)珠子在4℃條件下充分結(jié)合，并采用甘氨酸溶液洗脫（0.1mol／L，pH＝2.5）.洗脫后與1／10洗脫液體積的Tris－Cl緩沖液（1mol／L，pH＝8.0）混合使抗體溶液呈中性，并貯存于4℃冰箱中.

1.7細(xì)胞培養(yǎng)與質(zhì)粒轉(zhuǎn)染

將人子宮頸癌細(xì)胞HeLa用含有10%胎牛血清（HyClone）的DMEM／High Glucose細(xì)胞培養(yǎng)基（HyClone）在37℃含5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；進(jìn)行質(zhì)粒轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)前在24孔板內(nèi)每孔接種30 000～50 000個(gè)細(xì)胞，接種24h后待細(xì)胞附著到皿壁或細(xì)胞爬片后進(jìn)行質(zhì)粒再轉(zhuǎn)染.細(xì)胞轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)在500μL體系中進(jìn)行，使用TurboFect（thermo scientific）作為轉(zhuǎn)染試劑.每500μL體系中使用1μLTurboFect，200ng質(zhì)粒；在免疫共沉淀（IP）實(shí)驗(yàn)中使用直徑15cm的平皿培養(yǎng)細(xì)胞；在進(jìn)行細(xì)胞周期同步化時(shí)，加入50nmol／L Taxol或80ng／mL Nocodazole，20h后收集細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn).

1.8免疫熒光染色與免疫共沉淀

免疫熒光染色實(shí)驗(yàn)采用福爾馬林固定液（含有3%甲醛，2%蔗糖的PBS緩沖液）固定15min，采用山羊血清封閉液（含有10%山羊血清，0.4%Triton X－100的PBS緩沖液）封閉0.5h.二抗為FITC或Texas Red標(biāo)記的羊源二抗，采用DAPI染色DNA.一抗室溫孵育2h，二抗室溫避光孵育1h，DAPI室溫避光孵育3min.免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)采用NP－40buffer（1%NP－40，50mmol／L pH＝7.5Tris－Cl，150mmol／L NaCl，1%甘油，2.5mmol／L DTT，1mmol／L PMSF，10μg／mL Leupeptin，2μg／mL Aprotinin，50mmol／L Na3VO4，5mmol／L NaF）冰浴裂解細(xì)胞1h，裂解后在4℃條件下14 000r／min離心10min；取上清加入Kif18A抗體血清后4℃條件下?lián)u勻4h，隨后加入Protein A－Agarose（Roche），4℃條件下?lián)u8h.隨后用NP－40buffer清洗3遍珠子，使用SDS sample buffer（2%SDS，50mmol／L pH＝6.8Tris－Cl，10%甘油，20%β－ME）裂解珠子上結(jié)合的蛋白.將裂解液進(jìn)行蛋白電泳，電泳后進(jìn)行考馬斯亮藍(lán)染色或進(jìn)行Western Blot實(shí)驗(yàn).

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 GST－KC297與His－KC297原核表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建

本實(shí)驗(yàn)室在前期已經(jīng)構(gòu)建出以GFP為標(biāo)簽的融合蛋白質(zhì)粒pEGFP－Kif18A（C297），該質(zhì)粒為在載體質(zhì)粒的GFP基因C端后插入了一個(gè)可表達(dá)Kif18A蛋白C端297個(gè)氨基酸殘基的Kif18A基因片段.在該質(zhì)粒的Kif18A（C297）基因片段的兩端存在限制性內(nèi)切酶EcoRI和SalI的酶切序列，故本實(shí)驗(yàn)首先對(duì)于GFP－Kif18A（C297）質(zhì)粒進(jìn)行了酶切鑒定和DNA測(cè)序鑒定.如圖1A所示，經(jīng)EcoRI和SalI雙酶切后確實(shí)得到了一個(gè)基因片段，同時(shí)DNA測(cè)序結(jié)果顯示，該質(zhì)粒確認(rèn)無(wú)誤.將回收后的基因插入到本實(shí)驗(yàn)室所有的帶有GST蛋白標(biāo)簽基因的pGEX－KG載體質(zhì)粒中以及帶有8個(gè)His蛋白標(biāo)簽基因的pET28a載體質(zhì)粒中.質(zhì)粒構(gòu)建后進(jìn)行酶切鑒定（如圖1B所示）與DNA測(cè)序鑒定驗(yàn)證.

2.2 GST－KC297抗原蛋白的純化

將誘導(dǎo)、表達(dá)GST－KC297蛋白的細(xì)菌沉淀，利用T－buffer裂解后溶菌產(chǎn)物的上清即可獲得大量的GST－KC297蛋白.將300mL細(xì)菌培養(yǎng)液離心收集后，裂解于30mL體系中，裂解后離心棄去沉淀，在上清液中取出10μL進(jìn)行SDS－PAGE蛋白電泳，采用考馬斯亮藍(lán)R－250染色后（見(jiàn)圖2A），可見(jiàn)經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后的GST－KC297蛋白的大量表達(dá).使用1.4的方法純化GST蛋白后洗脫于2mL體系中，取出10μL洗脫液進(jìn)行SDS－PAGE蛋白電泳，采用考馬斯亮藍(lán)－250染色（見(jiàn)圖2B）進(jìn)行驗(yàn)證.使用BCA法測(cè)量蛋白濃度后，－80℃保存.

2.3 His－KC297蛋白與Ni樹(shù)脂凝膠的交聯(lián)

采用本文1.5中的方法，在200mL體系中使用BL21菌株表達(dá)His－KC297蛋白，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)后，使用SDS buffer裂解細(xì)菌.隨后加入1mL Ni樹(shù)脂凝膠珠子與His－KC297，使其充分結(jié)合并交聯(lián).實(shí)驗(yàn)中可見(jiàn)經(jīng)DMB交聯(lián)后的抗原－凝膠復(fù)合體不可被SDS裂解，在全部SDS－PAGE過(guò)程中His－KC297蛋白也不能從凝膠珠子上分離下來(lái).

2.4抗原的免疫與抗體純化

第一次抗原免疫使用1mL弗氏完全佐劑與100μg純化后的抗原蛋白（以PBS補(bǔ)至2mL），充分混勻后皮下注射免疫雄性新西蘭大白兔.隨后的3周每周對(duì)該大白兔進(jìn)行一次抗原的注射（采用弗氏不完全佐劑）.從第4周開(kāi)始經(jīng)兔耳緣靜脈抽取免疫后的血清10～15mL，將血液在4℃條件下靜置48h，14 000r／min離心后取上清，即為抗體血清.第5周繼續(xù)注射抗原加強(qiáng)免疫，以此類推，隔周注射抗原，隔周抽血，持續(xù)6個(gè)月.經(jīng)HeLa細(xì)胞Co－IP的實(shí)驗(yàn)檢測(cè)可知，實(shí)驗(yàn)從第4周開(kāi)始（前4周未知）得到的免疫血清中相對(duì)免疫前血清在Western Blot中出現(xiàn)了比較明顯的特異性條帶（相對(duì)分子質(zhì)量為100 000附近）；隨后得到的幾次抗體血清中的信號(hào)強(qiáng)度不斷增加，到免疫第8周以后血清的抗體特異性逐漸穩(wěn)定并持續(xù)較高的效價(jià)約3個(gè)月.故本文中提及的Kif18A特異性免疫血清即為實(shí)驗(yàn)中得到的第8周至第30周的抗體血清.將第8周至第30周的抗體血清合并后進(jìn)行后續(xù)的抗體純化實(shí)驗(yàn).

2.5抗體血清與純化抗體的檢測(cè)

如圖3A所示，利用本實(shí)驗(yàn)中獲得的Kif18A特異性免疫兔血清作為抗體，使用HeLa細(xì)胞全細(xì)胞裂解液進(jìn)行Western Blot實(shí)驗(yàn)，可見(jiàn)在相對(duì)分子質(zhì)量為100 000的位置附近有一條特異性免疫條帶.使用Kif18A特異性siRNA處理細(xì)胞20h后該特異性條帶消失，從而證實(shí)抗體血清確實(shí)對(duì)于Kif18A蛋白具有優(yōu)良的特異性.如圖3B所示，選取20mL Kif18A特異性抗體血清，使用1.7中的方法純化后，經(jīng)過(guò)1∶100倍比稀釋后使用正常培養(yǎng)的HeLa細(xì)胞進(jìn)行免疫熒光染色實(shí)驗(yàn)，綠色為微管染色、紅色為Kif18A、藍(lán)色為DNA.本實(shí)驗(yàn)中的Kif18A染色定位與文獻(xiàn)中的報(bào)道完全一致.可以證實(shí)，該實(shí)驗(yàn)中得到的抗體不僅可以進(jìn)行蛋白免疫印跡實(shí)驗(yàn)還可以進(jìn)行免疫熒光染色實(shí)驗(yàn).

2.6驅(qū)動(dòng)蛋白Kif18A的翻譯后蛋白修飾位點(diǎn)的檢測(cè)

在上述實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，正常傳代培養(yǎng)的HeLa細(xì)胞中Kif18A蛋白的表達(dá)豐度比較低.以前有研究報(bào)道，Kif18A分子在有絲分裂期大量表達(dá)，伴隨有絲分裂后期的到來(lái)，由于APC復(fù)合物的激活，Kif18A隨即大量降解［8］.故本文中的某些實(shí)驗(yàn)采用了細(xì)胞周期同步化的方法以便獲得含有Kif18A分子較多的有絲分裂前、中期的細(xì)胞.但是細(xì)胞周期同步化處理以后，在進(jìn)行Western Blot實(shí)驗(yàn)時(shí)意外發(fā)現(xiàn)不僅Kif18A的條帶熒光信號(hào)大幅增強(qiáng)，伴隨而來(lái)的還有新條帶的產(chǎn)生（見(jiàn)圖4A），因此推測(cè)Kif18A分子可能在有絲分裂期大量表達(dá)后還出現(xiàn)了蛋白的翻譯后修飾現(xiàn)象（如脲甲基化、磷酸化、乙酰化等）.故本實(shí)驗(yàn)通過(guò)IP的方法將用Taxol同步化處理的Kif18A蛋白與抗體共沉淀后進(jìn)行蛋白電泳.利用考馬斯亮藍(lán)（R－250）染色后，切下Kif18A蛋白的條帶，委托質(zhì)譜分析，結(jié)果顯示Kif18A蛋白分子的確在許多區(qū)域都顯示有蛋白的表達(dá)后修飾現(xiàn)象發(fā)生（見(jiàn)圖4B），圖4B中列出了質(zhì)譜分值最高的15個(gè)蛋白修飾.

3 討論

通過(guò)本實(shí)驗(yàn)中介紹的方法獲得的特異性Kif18A蛋白抗體血清與純化后的特異性Kif18A蛋白抗體在分子生物學(xué)以及細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)中都能比較好地發(fā)揮其功能.由于抗體血清在純化的過(guò)程中會(huì)伴隨著抗體效價(jià)的降低，但是為了獲得純度較高的抗體又必須將抗體血清中的雜質(zhì)去除.基于上述兩種考慮并結(jié)合實(shí)驗(yàn)的實(shí)際情況，一般認(rèn)為，抗體血清較為適合進(jìn)行Western Blot等實(shí)驗(yàn).因?yàn)樵赟DS存在的體系中，蛋白分子的高級(jí)構(gòu)象已經(jīng)喪失，所以蛋白分子將暴露出比存在高級(jí)構(gòu)象的分子更多的免疫結(jié)合位點(diǎn).在此情況下，雖然抗體血清的純化程度不高，但是也可以獲得非常好的免疫效果.相反，如利用純化的抗體進(jìn)行Western Blot等實(shí)驗(yàn)時(shí)，雖然抗體純化程度高，但是由于抗體效價(jià)的降低會(huì)造成抗體的過(guò)多浪費(fèi)，同時(shí)也不會(huì)獲得好的實(shí)驗(yàn)結(jié)果；在進(jìn)行免疫熒光染色或免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)時(shí)，由于抗原蛋白分子還維持一定的高級(jí)構(gòu)象，導(dǎo)致抗原分子暴露出的免疫位點(diǎn)較少.所以，如若采用抗體血清進(jìn)行免疫雜交，會(huì)導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)結(jié)果的背景升高，從而影響結(jié)果的清晰度.一般認(rèn)為在進(jìn)行該類實(shí)驗(yàn)時(shí)采用純化后的抗體能夠得到較為清晰的實(shí)驗(yàn)結(jié)果.

雖然本實(shí)驗(yàn)中通過(guò)蛋白質(zhì)譜的方法檢測(cè)到了Kif18A存在多種蛋白修飾的可能性，但是主要的蛋白翻譯后修飾是哪一種，發(fā)生在哪個(gè)具體的氨基酸位點(diǎn)，尚有待深入研究.另外，在Kif18A發(fā)生蛋白修飾后其功能和定位會(huì)發(fā)生什么樣的改變也尚不清楚.并且，在統(tǒng)計(jì)質(zhì)譜分析結(jié)果時(shí)發(fā)現(xiàn)，Kif18A的尾部（tail）區(qū)域存在大量的疑似蛋白修飾位點(diǎn)［9］.這與先前報(bào)道的驅(qū)動(dòng)蛋白8家族成員（特別是Kip3與Kif18A）尾部區(qū)域存在重要功能的結(jié)果相符合［10］，也預(yù)示著Kif18A蛋白的尾部區(qū)域可能對(duì)于蛋白功能的發(fā)揮起到了非常重要的調(diào)控作用.

本文著重介紹了Kif18A蛋白分子的抗體制備與純化方法.實(shí)驗(yàn)中得到的Kif18A特異性抗體在抗體檢測(cè)實(shí)驗(yàn)中體現(xiàn)了較為優(yōu)良的品質(zhì)，為后續(xù)深入研究該蛋白分子打下了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)；此外，本實(shí)驗(yàn)中Kif18A蛋白修飾的發(fā)現(xiàn)與檢測(cè)對(duì)后續(xù)實(shí)驗(yàn)也起到了重要的指導(dǎo)作用.

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Preparation，purification and specificity determination of kinesin－8family member Kif18Apolyclonal antibody

WANG Lu－yu，ZHU Chang－jun
（College of Life Sciences，Tianjin Normal University，Tianjin 300387，China）

To investigate the post－translational modification of Kif18Aby mass spectrometry，first performed expriment to prepare antibody against Kif18Aby injection of purified GST－Kif18protein into rabbit.By using affinity purification with Ni－NTA Agarose beads from rabbit serum，we got purified antibody，which has good quality of application in wester blot and immuniprecipitation.Thus provides a good oppertunity to further investigate the fuction of post－translational modification of Kif18A.

Kif18A；polyclonal antibody；mass spectrometry；protein phosphorylation

Q 291 ［學(xué)科代碼］ 180·21 ［

］ A

（責(zé)任編輯：方林）

1000－1832（2015）01－0129－06

10.16163／j.cnki.22－1123／n.2015.01.024

2013－11－24

國(guó)家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目（31271485）；國(guó)家自然科學(xué)基金青年基金資助項(xiàng)目（31301138）；2011年教育部“新世紀(jì)優(yōu)秀人才支持計(jì)劃”資助項(xiàng)目（NCET－11－1066）；天津市應(yīng)用基礎(chǔ)與前沿技術(shù)研究計(jì)劃重點(diǎn)項(xiàng)目（12JC2DJC21400）.

王廬宇（1987—），男，碩士研究生；通訊作者：朱長(zhǎng)軍（1972—），男，博士，教授，主要從事細(xì)胞分子生物學(xué)研究.