李秦晉，符文卉，魏寶陽，王 智

（1. 湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)生物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，湖南 長沙 410128；2. 湖南體育職業(yè)學(xué)院，湖南 長沙 410019）

蚓激酶的抗菌作用研究

李秦晉1,2，符文卉1，魏寶陽1，王 智1

（1. 湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)生物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，湖南 長沙 410128；2. 湖南體育職業(yè)學(xué)院，湖南 長沙 410019）

利用杯碟法探討了蚓激酶對細(xì)菌、真菌等的抗菌效果。從蚯蚓中提取蚓激酶經(jīng)過分離純化后采用杯碟法對大腸桿菌、K酵母、康氏木霉、枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌進(jìn)行抗菌作用研究，通過量效、時效檢測得出蚓激酶均對上述5種微生物產(chǎn)生了不同程度的效果，以大腸桿菌和K酵母作用尤為顯著。

蚓激酶；抗菌；杯碟法；蚯蚓

蚓激酶是從露天紅赤子愛勝蚓（Eisenia foetida）中提取的一種具有纖維蛋白溶解活力的絲氨酸蛋白酶[1-5]。它可直接溶解纖維蛋白，并具有纖溶酶原激活劑的作用，病人應(yīng)用后可促進(jìn)纖維蛋白的溶解，改善凝血及血液流變學(xué)指標(biāo)[2,6-9]。蚓激酶含有的纖溶酶原激活劑成分可以促使纖溶酶原轉(zhuǎn)化為纖溶酶降解纖維蛋白，使早期腦梗死的血栓溶解；含有的纖維蛋白溶酶可直接水解纖維蛋白原從而預(yù)防血栓形成[10-14]。此外蚓激酶還可降解凝血酶原、凝血因子V和凝血因子Ⅷ抗血小板聚集針對缺血性卒中患者的高黏、高凝、低纖溶狀態(tài)展示出更廣泛的治療作用[15-16]。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 試驗材料 湖南常見紅蚯蚓，即赤子愛勝蚓（Eisenia foetida）采自湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)校園。

1.1.2 供試菌株 金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、康氏木霉（Trichoderma koningii）、枯草芽孢桿菌（Bacillus sabtilis）、K酵母（Saccha-romyces cerevisiae K）和大腸桿菌（Escherichia coli）均由湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)生物科學(xué)技術(shù)學(xué)院微生物研究室提供。

1.1.3 培養(yǎng)基配方 細(xì)菌培養(yǎng)基：牛肉膏0.3%，蛋白胨0.5%，NaC1 0.5%，瓊脂1.5%，蒸餾水1 000 mL，121℃滅菌25 min。

霉菌培養(yǎng)基：PDA培養(yǎng)基，瓊脂1.5%，蒸餾水1 000 mL，121℃滅菌25 min。

1.2 方 法

1.2.1 蚓激酶的分離純化 取10條活的赤子愛勝蚓，多次水洗，待內(nèi)臟中的污物排出后，用濾紙吸除水分，然后稱重；再加2倍體積的緩沖液于勻漿器中勻漿5 min，在4℃冰箱中靜置4 h后以4 000 r/min離心10 min，將沉淀棄去；在上清液中加固體硫酸銨達(dá)一定飽和度，以同樣的方式再次離心10 min；收集上清液再加入固體硫酸銨達(dá)較高的飽和度，通過12 h靜置后再高速離心，將收集的沉淀物用緩沖液溶解，用超濾方法濃縮或透析袋透析去鹽后，用冷凍干燥機(jī)凍干得到淡棕色粉末狀的蚓激酶粗制品。

1.2.2 抗菌活性的檢測 在試驗前，先用無菌蒸餾水將蚓激酶分別配成每1mL中含10 000、8 000、6 000、4 000蚓激酶單位的粗酶液和不加酶液空白對照。采用杯碟法，選擇在直徑為9 cm無菌培養(yǎng)皿中注入10 mL融化的無菌培養(yǎng)基作為底層。等到培養(yǎng)基冷卻凝固且擴(kuò)展均勻后，再取適量無菌培養(yǎng)基加熱至50～55℃，然后不斷搖勻加入適量供試菌懸液，迅速倒入已注入10 mL融化的無菌培養(yǎng)基作為底層的培養(yǎng)皿中作為菌層，在菌層還未凝固前，快速安放4個無菌牛津杯，等到凝固后，在牛津杯中加入10 000、8 000、6 000、4 000酶單位的粗酶液和空白對照濃度，細(xì)菌于32℃培養(yǎng)36 h，霉菌于30℃培養(yǎng)60 h，定時觀察抑菌圈大小。

2 結(jié)果與分析

2.1 蚓激酶不同劑量抗菌效果檢測

以每1 mL中含10 000、8 000、6 000、4 000蚓激酶單位的粗酶液和不加酶液的空白對照，以大腸桿菌、K酵母、枯草芽孢桿菌、康氏木霉和金黃色葡萄球菌為供試菌種，作抗菌活性檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)以大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、K酵母、康氏木霉、枯草芽孢桿菌為試驗菌均出現(xiàn)明顯的抑菌圈。并且還發(fā)現(xiàn)，10 000酶單位/mL的蚓激酶對大腸桿菌（抑菌圈11.6 mm），K酵母（抑菌圈11.6 mm）的抑菌活性最強(qiáng)，金黃色葡萄球菌（抑菌圈11.3 mm）和枯草芽孢桿菌（抑菌圈11.0 mm）次之，對康氏木霉（抑菌圈10.0 mm）抑菌活性最弱 （表1～表5）。

2.2 蚓激酶抗菌時效檢測

從表1～表5可知，蚓激酶對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、K酵母、康氏木霉和枯草芽孢桿菌的抗菌效果在指定時間內(nèi)基本達(dá)到較佳的效果，再隨時間的延長其抑菌能力雖略有增加，但均不顯著。

3 討 論

試驗結(jié)果表明，蚓激酶對革蘭氏陰性菌，如大腸桿菌等的抗菌活性較對枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌等陽性菌強(qiáng)。蚓激酶對K酵母也具有較強(qiáng)抑菌活性。同時也發(fā)現(xiàn)蚓激酶對康氏木酶等霉菌抗菌效果不是很明顯。總的來說，蚓激酶中的抗菌肽對細(xì)菌有強(qiáng)烈抑制的作用，但是具有一定的選擇性，對大腸桿菌等革蘭氏陰性菌抗菌效果比陽性菌強(qiáng)；蚓激酶對K酵母同樣作用效果理想，但對康氏木酶等霉菌作用效果相對較差，這對于進(jìn)一步研究蚓激酶中抗菌肽的作用提供了參考。對蚓激酶各組分的作用和相互作用的研究以及分離純化的工藝等有待深化，對其作為酶類藥物的有效機(jī)理還要進(jìn)一步研究。

傳統(tǒng)的抗生素在使用過程中產(chǎn)生了諸多的新問題，如不斷出現(xiàn)的各種耐藥菌株以及變異菌株等，這就使得抗生素必須不斷更新?lián)Q代。因此，尋找新一代抗菌劑就變得越來越重要。雖然人們早就發(fā)現(xiàn)生物體內(nèi)具有高效的免疫系統(tǒng)，也有不少有關(guān)生物血淋巴中抗菌肽的研究報道[16-17]，但它們的產(chǎn)生大多是由于生物體受到損害或相關(guān)理化因素作用后在體內(nèi)誘導(dǎo)的。試驗中蚓激酶有較強(qiáng)的抗菌作用，說明蚯蚓體內(nèi)均含有抗菌肽。目前，有關(guān)蚓激酶的抗菌研究報道甚少，此項研究為以后的相關(guān)研究提供了參考。

文中對蚓激酶在抗菌作用方面只是做初步的探討和檢測，但是效果較理想，證明蚓激酶確實對細(xì)菌、霉菌均具有一定的抑制作用。蚓激酶是1992年在我國投入臨床應(yīng)用的，在用于防治心腦血管疾病上積累了豐富的研究資料[18-20]，本文提出的蚓激酶抗菌作用為新抗生素提供了新的思路和方法，相信在不久的將來蚓激酶會越來越受到人類的關(guān)注，在穩(wěn)定性好、纖溶活性強(qiáng)、藥理作用廣泛、口服有效、副作用小的基礎(chǔ)上開發(fā)出更多利于人類的藥物。

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（責(zé)任編輯：高國賦）

Anti-Microbial Effects of Lumbrokinase

LI Qin-jin1,2，F(xiàn)U Wen-hui1，WEI Bao-yang1，WANG Zhi1

（1. College of Bioscience and Biotechnology, Hunan Agricultural University, Changsha 410128, PRC; 2. Hunan Sports Vocational College, Changsha 410019, PRC）

This study was conducted to investigate anti-microbial effect of lumbrokinase on bacteria and fungi with cylinder plate method. The lumbrokinase extracted from the earthworm was separated, purifed and then used with the cylinder plate method to test its antimicrobial effect on Escherichia coli, Saccha-romyces cerevisiae k, Trichoderma koningii, Bacillus subtilis and Staphylococcus aureus. Through the dose-effect and aging-effect test, the lumbrokinase was found to produce the various-degree effects on the above-mentioned fve kinds of micro-organisms, particularly signifcant on E. coli and Saccha-romyces cerevisiae k.

lumbrokinase; anti-microbial; cylinder plate method; earthworm

R285

A

1006-060X（2015）08-0008-03

10.16498/j.cnki.hnnykx.2015.08.003

2015-05-25

湖南省科技廳重點項目（2014FJ2003）

李秦晉（1975-），男，湖南益陽市人，講師，主要從事農(nóng)業(yè)生態(tài)學(xué)研究。

王 智