楊濱宇 甘 玲 梅宏遠(yuǎn)

(西南大學(xué)榮昌校區(qū)動物醫(yī)學(xué)系，重慶 402460)

microRNA(miRNA)是一種功能上相對保守且由17～25個核苷酸(nt)組成的具有調(diào)控功能的非編碼RNA，其表達(dá)模式具有分化的時序性及位相性［1］。研究發(fā)現(xiàn)，miRNA參與了生物機體中一系列重要的生物學(xué)過程，如細(xì)胞發(fā)育分化、肌肉發(fā)育、脂肪代謝、激素分泌和病毒感染等。對miRNA的挖掘鑒定及其功能的研究已成為科學(xué)關(guān)注的焦點。近幾年的研究中，以豬作為模型動物的相關(guān)研究備受關(guān)注，且得到了廣泛認(rèn)可。豬miRNAs的研究相對較晚，但隨著豬全基因組的不斷完善以及大數(shù)據(jù)時代的來臨，豬miRNAs的鑒定極大地促進(jìn)了miRNA功能的研究。

1 豬miRNAs的鑒定方法

miRNA的鑒定是其功能研究的前提。最早發(fā)現(xiàn)的miRNA(lin－4)是通過正向遺傳學(xué)篩選得到的，這種方法準(zhǔn)確性高但是會遺漏一些不具有表型差異的miRNA。隨著科學(xué)技術(shù)在不同領(lǐng)域的延伸和發(fā)展，更多的miRNA隨之被發(fā)現(xiàn)，這些技術(shù)相應(yīng)地被應(yīng)用于豬miRNA的鑒定上來。

1.1 基因克隆技術(shù)

基因克隆技術(shù)需構(gòu)建miRNA的cDNA文庫，然后對擴增產(chǎn)物進(jìn)行克隆、測序并與基因組數(shù)據(jù)庫基于局部比對算法的搜索工具(BLAST)比對，排除非miRNA后，利用Northern印跡法最終確認(rèn)。Alavala等［2］通過基因測序構(gòu)建了豬心臟、肝臟和胸腺miRNA的cDNA文庫并通過克隆技術(shù)共確定了120個具有保守性的同源miRNA基因。Cho等［3］在豬骨骼肌和脂肪的cDNA文庫中共確定了15個新miRNA。常規(guī)的基因克隆技術(shù)在建立cDNA文庫時需要幾百微克RNA，操作繁瑣，工作量大。因此，研究者們對該方法進(jìn)行了改進(jìn)，他們利用flashPAGE分餾器和預(yù)制凝膠在10 μg總RNA中提取了40 nt的miRNA，然后通過組合式PCR并利用多聯(lián)基因克隆技術(shù)確定了豬空腸、回腸、脾以及31日齡仔豬腎中的10個新的miRNA［4］。

克隆技術(shù)可以準(zhǔn)確地確定每一個miRNA，但是分離miRNA的步驟繁瑣且一些低豐度表達(dá)的miRNA很難被檢測到。另外，由于miRNA表達(dá)具有組織特異性和階段性，通過建立cDNA文庫尋找一些暫時表達(dá)或具有組織特異性的miRNA具有一定的局限性［5］。

1.2 雜交檢測技術(shù)

1.2.1 Northern 雜交技術(shù)

Sawera等［6］采集豬的小腦、大腦皮層、海馬、腎以及仔豬肝臟并提取RNA，對提取的RNA利用ɑ－32P三磷酸脫氧尿苷和T7核糖核酸聚合酶進(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄，通過閃爍計數(shù)器測定標(biāo)記了放射物的核苷酸濃度從而完成了miRNA的探針設(shè)計，最后利用Northern印跡雜交技術(shù)所得到的數(shù)據(jù)確定了miR17－92 基因簇中的 miR－17、miR－18、miR－19a、miR－20、miR－19b、miR－91 和 miR－92 在豬組織中表達(dá)，這也是最早被確認(rèn)的豬miRNA。Northern雜交是鑒定miRNA的經(jīng)典方法，但因操作復(fù)雜，影響了檢測效率，不適合用于高通量分析。另外，盡管無放射性探針代替放射性探針的標(biāo)記方法已經(jīng)被廣泛使用，但因常規(guī)的Northern方法特異性和靈敏度不高，研究者們便利用鎖核酸(LNA)來代替核苷酸作為探針修飾的方法以提高其特異性和靈敏度。當(dāng)前，在豬miRNAs檢測中基于LNA的檢測技術(shù)已被廣泛使用。

1.2.2 微陣列芯片技術(shù)

微陣列芯片技術(shù)是一種可以實現(xiàn)高通量分析的檢測方法，將大量miRNA序列互補寡核苷酸分子同時固定于支持物上，然后與標(biāo)記過的樣本RNA進(jìn)行雜交，最后通過信號強弱檢測進(jìn)而判斷樣品中靶分子的數(shù)量。Zhou等［7］利用微陣列芯片技術(shù)在豬骨骼肌組織中共檢測到16個新發(fā)現(xiàn)的miRNA和31個已知的miRNA，為進(jìn)一步的研究提供了重要的分子信息。

核苷酸分子和樣本分子間產(chǎn)生交叉反應(yīng)是常規(guī)微陣列技術(shù)的弊端，這將導(dǎo)致檢測結(jié)果準(zhǔn)確率低且重復(fù)性差［8］，研究者們便對這種方法進(jìn)行了很多改進(jìn)。Soroush等［9］利用了微液相miRNA技術(shù)檢測了豬小腸中已被發(fā)現(xiàn)的332種腸道m(xù)iRNA，并新發(fā)現(xiàn)一個miRNA且表明其前體位于第1、3號染色體。豬的 miR－135a－135b基因簇則是利用LNA miRNA芯片技術(shù)發(fā)現(xiàn)的［10］，此類鑒定為進(jìn)一步確定該基因簇的功能奠定了基礎(chǔ)。

miRNA芯片技術(shù)利用大規(guī)模微陣列對已知的miRNA進(jìn)行檢測，大大地提高了篩選的速度和通量，與以上方法相比較，miRNA芯片技術(shù)優(yōu)點突出，是一種快速有效的miRNA檢測方法。

1.3 生物信息學(xué)預(yù)測

該方法可以對表達(dá)量低、無法直接克隆的miRNA進(jìn)行預(yù)測［11］。但生物信息學(xué)方法預(yù)測得到的miRNA需要通過試驗進(jìn)行驗證。Xie等［12］對不同階段長白豬的背最長肌、心、肝、脾、肺、腎、骨骼肌、胃和小腸中的miRNA進(jìn)行生物信息學(xué)分析，在分析的57個miRNA中發(fā)現(xiàn)2種新miRNA且有39個miRNA在豬上未見報道。通過熒光定量PCR方法進(jìn)行驗證，數(shù)據(jù)結(jié)果表明在所采樣組織中 miR－181b 和 let－7e 均 有 表 達(dá)，let－7、cmiR－125b、miR－new1 和 miR－new2 僅在幾種組織中表達(dá)，而miR－122和miR－206分別在肝臟和肌肉中特異性表達(dá)。檢測通量大、速度快是生物信息學(xué)預(yù)測的特點。隨著各物種全基因序列測序工作的完成，生物信息學(xué)方法逐漸成為鑒定miRNA的有效方法。

1.4 高通量測序

高通量測序技術(shù)集合了以上幾種方法的優(yōu)點，并可以一次性對幾百萬條DNA分子進(jìn)行序列測定，在檢測和鑒定miRNA上具有極大優(yōu)勢。豬miRNA的鑒定工作在不同種類的高通量測序技術(shù)的支持下得到了巨大的發(fā)展。例如:Li等［13］通過Solexa測序確定了榮昌豬背部皮下脂肪中227個保守的miRNA，其中有59個是新發(fā)現(xiàn)的miRNA;Li等［14］采集了第210天的藏豬卵巢和睪丸的樣本，利用Illumina測序技術(shù)檢測了732個miRNA，其中新發(fā)現(xiàn)78個 miRNA;Oriol等［15］利用 Roche/454 FLX技術(shù)在歐洲伊比亞品種、歐洲野豬、長白、大白、皮蘭特、梅山豬和越南豬的腎臟組織中的229個miRNA中發(fā)現(xiàn)了110個新miRNA;Bai等［16］利用SOLID測序技術(shù)檢測了閹割與非閹割的皮蘭特和長白二元雜豬在第161天的背部皮下脂肪中的 366個 miRNA，其中新發(fā)現(xiàn) 192個miRNA。高通量測序技術(shù)的高準(zhǔn)確性、高通量和高靈敏度等突出優(yōu)勢，對挖掘和鑒定豬新miRNA做出了突出貢獻(xiàn)。

2 豬miRNAs功能研究進(jìn)展

2.1 生產(chǎn)性能

以往的很多研究已證明miRNA參與了豬的肌肉發(fā)育、脂肪代謝等多個與生產(chǎn)性能相關(guān)的生物學(xué)過程。下面主要概述近年來miRNA與豬生產(chǎn)性能的相關(guān)研究。

在豬的肌肉發(fā)育方面，相關(guān)研究表明miR－1和miR－206在長白杜洛克雜交豬老齡化肌源干細(xì)胞中表達(dá)量降低，而miR－24的表達(dá)量增多。同時指出miR－24表達(dá)量升高可能與維持肌源干細(xì)胞靜止從而避免衰老有關(guān)［17］。Yang 等［18］研究了桐城豬和長白豬在產(chǎn)前和產(chǎn)后肌肉中miR－127的動態(tài)表達(dá)，結(jié)果表明，桐城豬在胚胎期第45～85天時的miR－127表達(dá)量高于長白豬;仔豬在出生后的第20～160天，桐城豬的miR－127表達(dá)量普遍高于長白豬，但差異不顯著。由此表明miR－127在桐城豬(肥胖型豬)胚胎肌肉發(fā)育中后期發(fā)揮的作用比長白豬(瘦肉型豬)大。此外相關(guān)研究表明在去勢豬的背最長肌中 miR－1、miR－133b 和 miR－133a 的表達(dá)量明顯下降，miR－206表達(dá)量增加且可以促進(jìn)骨骼肌再生，同時還表明let－7c和let－7a與去勢豬的脂肪沉積有關(guān)［19］。

在豬脂肪代謝方面，Li等［20］研究了 miR－181a與脂肪生成因子腫瘤壞死因子－α(TNF－α)之間的關(guān)系。結(jié)果表明，miR－181a可以加速脂滴的積累，增加甘油三酯的含量，并抑制TNF－α蛋白質(zhì)的表達(dá);此外，miR－181a也可以抑制脂肪合成相關(guān)基因以及脂解基因的表達(dá)。此暗示miR－181a可能作為抗肥胖藥物治療的新靶點。此外，Jeong等［21］研究表明miR－302a表達(dá)量與脂肪細(xì)胞基因脂肪酸結(jié)合蛋白(AP2)和過氧化物酶體增殖物激活受體γ(PPARγ)的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)。

在母豬生產(chǎn)性能方面已有證據(jù)表明外來體miRNA可以通過母乳傳遞給仔豬，母乳中免疫相關(guān)miRNA可以通過消化道轉(zhuǎn)移到仔豬體內(nèi)［22－23］，但是相關(guān)研究報道較少。伴隨通過哺乳所傳遞的miRNA在仔豬的免疫系統(tǒng)發(fā)育中的分子機制研究的深入，必將為提高仔豬存活率等生產(chǎn)指標(biāo)提供新思路。此外還有研究表明miR－92a可以抑制卵巢顆粒細(xì)胞凋亡和卵泡閉鎖，這有利于母豬排卵和提高產(chǎn)子數(shù)量［24］。

目前，對于豬生產(chǎn)性能相關(guān)miRNA的研究，一方面在繼續(xù)進(jìn)行深度挖掘鑒定及相關(guān)作用機理的解釋;另一方面對于miRNA的研究也逐漸趨向于多樣化，動態(tài)化及細(xì)致化。

2.2 垂體激素分泌

目前，miRNA參與豬腦垂體激素調(diào)控的研究相對較少，但其研究意義不可忽視。Ye等［25］研究豬腦垂體中miRNA的差異表達(dá)與卵泡刺激素(FSH)之間的關(guān)系時，構(gòu)建了豬腦垂體細(xì)胞模型，并發(fā)現(xiàn)促性腺激素釋放激素(GnRH)可以促進(jìn)miRNA的轉(zhuǎn)錄和FSH的分泌。在GnRH作用下，通過微陣列技術(shù)和 qPCR結(jié)果分析表明，ssc－let－7c、ssc－miR－361－5p、ssc－423－3p、ssc－miR－425－3p 和ssc－miR－45 表 達(dá) 量 上 調(diào)，而 ssc－miR－30e－3p、sscmiR－320、ssc－miR－324 和 ssc－miR－361－3p 表達(dá)量下調(diào);差異表達(dá)的miRNA進(jìn)行途徑影響試驗的研究表明，miRNA可能與GnRH調(diào)控途徑有關(guān)。其中已證實miR－361－3p靶標(biāo)位置是 GnRH的信號“開關(guān)”基因。最重要的是，功能研究結(jié)果表明miR－361－3p參與了FSH分泌的調(diào)節(jié)。在之后的研究中Qi等［26］又指出 ssc－let－7c 參與促生長素(GH) 的分泌調(diào)節(jié)，過量表達(dá)的ssc－let－7c可以抑制豬垂體前葉細(xì)胞分泌GH。

2.3 參與疾病調(diào)控

miRNA參與了豬疾病發(fā)生機制。研究表明miRNA在豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)感染過程中扮演著不同的角色。miRNA可以抑制PRRSV的復(fù)制，但其作用機理各不相同。miR－181家族中的miR－181c對PRRSV的復(fù)制最為強烈，它主要通過靶標(biāo)作用于PRRSSV基因組從而抑制其復(fù)制［27］，隨后研究者對豬的其他部位進(jìn)行PRRSV病毒含量檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn) miR－106、miR－140－3p、miR－18、miR－181、miR－338 和 miR－93 表達(dá)量出現(xiàn)差異，暗示了這些miRNAs與抑制PRRSV復(fù)制有關(guān)。需指出的是 miR－181和 miR－338特定地在腦中表達(dá)，這表明這些組織特異性miRNA可能影響相應(yīng)組織中PRRSV的感染。miR－125b并不直接靶向作用于PRRSV的基因組，而是通過抑制核轉(zhuǎn)錄因子－κB(NF－κB)的活化而達(dá)到抑制PRRSV復(fù)制的效果［28］。miR－26家族均對 PRRSV的復(fù)制具有強烈抑制作用，其中miR－26a在PRRSV感染過程中可以作用于Ⅰ型干擾素和干擾素刺激基因MX1和ISG15，從而抑制1型和2型PRRSV毒株的復(fù) 制［29］。此 外 miR－23、miR－378、miR－505 和miR－506 對 PRRSV 復(fù) 制 也 有 抑 制 作 用［30－31］。miRNA還可受PRRSV的調(diào)節(jié)而改變其表達(dá)。Hicks等［32］研究了PRRSV感染豬后巨噬細(xì)胞的miRNA 組表征，研究發(fā)現(xiàn) miR－30a－3p、miR－132、miR－27b、miR－29b、miR－146a 和 miR－9－2 在巨噬細(xì)胞中表達(dá)量發(fā)生改變，而在巨噬細(xì)胞中被高度抑制表達(dá)的miR－147與PRRSV之間的關(guān)系尚需進(jìn)一步考證。

miRNA在豬疾病中還扮演著基因調(diào)節(jié)劑的作用。Hoeke等［33］在仔豬感染沙門氏菌的回腸中發(fā)現(xiàn)miRNA主要調(diào)控細(xì)胞的焦點粘連以及肌動蛋白細(xì)胞骨架的通路。研究表明，miR－29a可以介導(dǎo)腸上皮細(xì)胞繁殖導(dǎo)致Cdc42表達(dá)量下調(diào)和介導(dǎo)Caveolin－2調(diào)節(jié)。Caveolin－2參與許多致病性細(xì)菌和病毒的內(nèi)吞過程，而Cdc42可以調(diào)節(jié)細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)、細(xì)胞生長、細(xì)胞極性以及細(xì)胞內(nèi)運輸?shù)?。此項研究提出了一種可以通過miRNA調(diào)節(jié)細(xì)胞攝取病原體數(shù)量來替代常規(guī)治療策略的假設(shè)。此外，還有研究表明miR－155在胸膜肺炎放線桿菌感染豬的肺組織中參與了炎癥反應(yīng)的調(diào)節(jié)［34］;miR－21可以直接靶標(biāo)作用于IP－10基因抑制豬偽狂犬病毒在 PK－15細(xì)胞中的復(fù)制［35］等?？傊琺iRNA在豬疾病發(fā)展過程中的作用，將為豬疾病的防治提供新的思路和靶標(biāo)。

3 小結(jié)與展望

miRNA在豬機體內(nèi)廣泛分布且不同miRNA在個體發(fā)育的不同階段產(chǎn)生，廣泛參與各生理功能的調(diào)控。其鑒定工作從繁瑣低效轉(zhuǎn)變成了簡單高效，而功能的研究也更加全面。相信在未來的研究中，豬miRNAs鑒定和功能的研究一方面可以為養(yǎng)豬業(yè)帶來福利，另一方面也可以為人類疾病的防治帶來新的契機。

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